Immunochimica: Analisi e Metodi di Laboratorio PDF

Lezione 2 Serena Bonin CAMPIONI BIOLOGICI Prelevato da una SANGUE: Fluido biologico vena del braccio Sottovuoto Vo...

Lezione 2 Serena Bonin CAMPIONI BIOLOGICI Prelevato da una SANGUE: Fluido biologico vena del braccio Sottovuoto Volumi richiesti da analizzatori Volume medio prelevato: 5 ml automatizzati per singola analisi: (vacutainer) 2-100 µL  ALTRE POSSIBILI MATRICI (FLUIDI BIOLOGICI) Tali fluidi contengono spesso gli stessi analiti biologici di interesse, ad esempio glucosio e proteine, ma differiscono per proprietà chimiche e/o fisiche. Le differenze nelle caratteristiche dei fluidi vengono definite differenze delle matrici  ALTRE POSSIBILI MATRICI (FLUIDI BIOLOGICI) I metodi di analisi progettati per determinare un analita nel plasma sanguigno non sono idonei per la determinazione del medesimo analita negli altri fluidi (matrici). Quindi quando si utilizza un metodo per l'analisi di un fluido diverso dal plasma sanguigno o dal siero, è importante verificare che il metodo sia idoneo per il tipo di campione di fluido disponibile.  IMMUNOCHIMICA  Identifica metodi analitici, altamente sensibili e specifici, per rilevare la molecola d’interesse  Ligand Assay e nella > parte dei casi sono basate sull’impiego di un Ab per l’identificazione dell’analita, considerato quindi Ag.  La quantificazione dell’analita avviene perlopiù con l’impiego di un tracciante, che in determinate condizioni permette di rilevare un segnale proporzionale al numero di complessi fra Ag e Ab che si formano nella reazione 5  IMMUNOCHIMICA -FASI  INCUBAZIONE PER LA FORMAZIONE DI COMPLESSI Ag-Ab  SEPARAZIONE DEI COMPLESSI Ag-Ab DALLE MOLECOLE DI Ab E Ag NON REAGITE  RILEVAZIONE DEL SEGNALE ANALITICO  ELABORAZIONE DEI DATI ED ESTRAPOLAZIONE DELLE CONCEMTRAZIONI DI ANALITA 6  IMMUNOCHIMICA Metodi competitivi, in difetto di Ab/eccesso Metodi non competitivi, o in di Ag eccesso di Ab/ difetto di Ag SI IMPIEGA UN SOLO Ab PER È previsto l’uso di due Ab e il IDENTIFICARE L’Ag segnale è direttamente Il segnale analitico è inversamente proporzionale alla [Ag] proporzionale alla sua concentrazione DOSAGGIO IMMUNOCHIMICO COMPONENTI FONDAMENTALI  ANALITA, Ag  MOLECOLA LEGANTE, Ab  TRACCIANTE ovvero il sistema che emette il segnale analitico in funzione del legame fra Ag e Ab 7  ANALITA  Ag sono generalmente macromolecole (proteine, glicoproteine, polisaccaradi) che possono esprimere numerosi epitopi differenti. Il determinante antigenico o epitopo è quella regione dell’Ag che viene riconosciuta in modo specifico dall’Ab. Gli Ag che suscitano risposta immunitaria sono detti IMMUNOGENI.  Le molecole a basso PM (< 2 kDa) possono essere antigeniche (ovvero riconosciute dall’Ab), ma non immunogene⇒ APTENI (per produrre Ab contro un aptene, questo viene legato ad un carrier per renderlo immunogeno)  I metodi immunochimici possono esser impiegati per la misura di qualsiasi analita che sia in grado di esser riconosciuto e legato da un’altra molecola. Anche un Ab, legato da un Ab Anti-Ab. 8  MOLECOLA LEGANTE  Perlopiù Ab  Caratteristica dell’Ab: AFFINITÀ (Keq Ag-Ab ) SPECIFICITÀ (capacità di riconoscere l’analita da molecole con struttura simile)  Ab più comunemente impiegati nei saggi immunochimici sono IgG, che possono essere monoclonali (solo verso un determinato epitopo) o policlonali (più Ab diretti verso zone diverse dell’epitopo)  La specificità della misura immunochimica è strettamente dipendendente dagli Ab usati come leganti ed è definita come la capacoità dell’Ab di riconoscere l’Ag da determinare. Metodi che usano come leganti Ab policlonali sono meno specifici di quelli basati su Ab monoclonali 9  CARATTERISTICHE AB MONOCLONALI VANTAGGI SVANTAGGI Le caratteristiche di affinità e specificità sono note La specificità potrebbe essere eccessiva e costanti È sufficiente una piccola quantità di Ag per la Richiede tecnologie più sofisticate per la produzione produzione È possibile selezionare l’Ab con la specificità Non sempre reagiscono con la proteina A desiderata (rilevazione indiretta supporti solidi-lega IgG) Può essere prodotto in quantità limitata e il Non formano un precipitato in seguito a legame processo di purificazione è semplice con l’Ag Sono caratterizzati da elevata specificità Sono spesso caratterizzati da bassa affinità 10  TRACCIANTE  La rilevazione del segnale analitico in immunochimica è importante per la sensibilità (ordine nmoli e pmoli)  Il tracciante è l’indicatore della reazione analitica. La sostanza che si intende misurare è resa rilevabile con l’introduzione di un opportuno marcatore che però non deve alterare il comportamento immunologico del sistema. Si definisce MARCATO la porzione di Ag o Ab che nella realizzazione del metodo immunochoimico viene coniugato con il TRACCIANTE  Un tempo esistevano solo i traccianti radioattivi 11  CARATTERISTICHE DEL TRACCIANTE  Il loro legame chimico con la molecola di Ag o di Ab deve avere la minore interferenza possibile con la formazione del complesso Ag-Ab  Il segnale analitico emesso di avere un’elevata intensità per unità di massa, proprietà che dipende dal limite di rilevabilità del tipo di tracciante  La specificità del segnale deve essere la più elevata possibile al fine di garantire un basso rumore di fondo e quindi contribuire a migliorare la rilevabilità  Il segnale non deve essere modificato dalle caratteristiche della matrice circostante  Se possibile la misura dovrebbe essere ripetuta  Il tracciante deve poter essere rilevato in una vasta gamma di concentrazioni 12  TIPI DI TRACCIANTE  LE CARATTERISTICHE DEL SEGNALE ANALITICO DIPENDONO DALLA NATURA DEL SEGNALE STESSO E DALLA STRUMENTAZIONE CON CUI È MISURATO  È POSSIBILE RAGGRUPPARE I TRACCIANTI IN UNA DELLE SEGUENTI CATEGORIE  RADIOATTIVI  ENZIMATICI  FLUORESCENTI  CHEMILUMINESCENTI  Ogni categoria di tracciante si caratterizza per una diversa tipologia di segnale emesso e di conseguenza per il tipo di rivelatore da utilizzare per la sua misurazione 13  TRACCIANTI UTILIZZABILI IN IMMUNOCHIMICA STRUMENTO DI TRACCIANTI SEGNALE EMESSO MASSA (moli/tubo) MISURA RADIOISOTOPI Emissione radiazioni Contatore radiazioni 0,1*10-15 𝛾o𝛽 𝛾o𝛽 FLUOROFORI Emissione radiazioni Fluorimetro 10-15 - 10-18 luminose ENZIMA Assorbimento radiazioni Fotometro 10-15 - 10-16 luminose ENZIMA Emissione radiazioni Luminometro 10-16 - 10-18 luminose ENZIMA Amplificazione ciclica Luminometro 10-20 - 10-21 MOLECOLA Emissione radiazioni Luminometro 10-16 - 10-18 LUMINOGENA luminose 14  TIPI DI TRACCIANTE  Alcuni traccianti forniscono un segnale esplicito, esempio radioattività luminescenza, misurabile direttamente con gli idonei strumenti di rilevazione altri sono portatori di un segnale implicito esempio attività enzimatica fluorescenza che richiede un ulteriore passaggio per effettuare la misura TRACCIANTI RADIOATTIVI Sono stati per molto tempo gli unici traccianti utilizzati nello sviluppo e nell’esecuzione delle determinazioni di immunochimica I due principali radio elementi utilizzati come marcatori in radio immunochimica sono lo 125I 3 che emette radiazioni 𝛾, e il H che emette radiazioni 𝛽. Vantaggi: è un segnale diretto (emesso dal marcato), positivo (emissione di particelle o radiazioni), spontaneo (non necessita sorgenti esterne di E) ed è molto specifico(radiazioni spurie o contaminazioni sono rare). L’emissione del segnale è indipendente dall’ambiente e l’attività è proporzionale solo al numero di molecole marcate la rilevazione del segnale è un semplice conteggio numerico quindi facilmente correggibile per il livello del rumore di fondo. 15  TIPI DI TRACCIANTE TRACCIANTI ENZIMATICI Nelle determinazioni immunoenzimatiche il marcato è un Ag o un Ab associato ad un enzima. La misura dell’attività enzimatica consente di valutare la quantità di marcato libero o legato nell’ immunocomplesso La quantificazione è resa possibile tramite l’aggiunta del substrato appropriato che innesta la reazione enzimatica I marcatori enzimatici non emettono un segnale diretto, il segnale quantitativamente misurabile è proporzionale all’attività catalitica degli enzimi e quindi alla sua concentrazione Il segnale analitico emesso è dipendente dal tipo di trasformazione indotta sul substrato da parte dell’enzima: può essere sia l’assorbimento di radiazioni luminose (assorbanza) sia l’emissione di radiazioni luminose (fluorescenza o luminescenza) 16 TRACCIANTI ENZIMATICI- SEGNALE DI ASSORBIMENTO Il segnale di assorbimento di radiazioni luminose di una reazione enzimatica può essere ottenuto con diverse metodologie: utilizzo di un substrato cromogeno un cromogeno è una molecola la cui trasformazione chimica catalizzata da un enzima (tracciante) porta ad una modifica del suo spettro di assorbimento Es: Perossidasi di rafano H2O2 + o-fenildiammina ⇄ o-nitro-anilina + 2H2O La perossidasi catalizza l’ossidazione del cromogeno e trasferisce gli e- all’ H2O2 che viene ridotto ad H 2O. Il picco di assorbimento della o-Nitro-anilina è a 492 nm. 17 TRACCIANTI ENZIMATICI- SEGNALE DI ASSORBIMENTO utilizzo di un substrato cromogeno Fosfatasi alcalina p-Nitro-fenilfosfato ⇄ p-Nitrofenolo + Pi p-nitrofenolo (picco assorbimento 405 nm) 18 TRACCIANTI ENZIMATICI- SEGNALE DI EMISSIONE Il segnale di emissione di radiazioni luminose di una reazione enzimatica può essere ottenuto con diverse utilizzo di un substrato Fluorogeno ß-D-galattosidasi 4- Me-umbelliferil-ß-galacto-piranoside ⇄ 4-Me-umbrelliferone II 4-me-umbrelliferone è fluorescente 19 TRACCIANTI ENZIMATICI- SEGNALE DI EMISSIONE Utilizzo di due substrati di cui uno luminogeno Un luminogeno e una molecola la cui trasformazione chimica produce un’emissione di luce reazione di chemiluminescenza Perossidasi di rafano H2O2 + o-fenildiammina ⇄ ione ammino ftalato + 2H2O 20 TRACCIANTI FLUORESCENTI DIRETTI I traccianti fluorescenti (fluorofori) rimettono nella maggior parte dei casi a lunghezze d’onda maggiori (E costante di affinità rispetto ad un altro, a parità di concentrazione fa registrare un segnale analitico più intenso alla medesima [Ag]. 7  METODI IMMUNOCHIMICI SENZA TRACCIANTE Nelle determinazioni immunochimiche senza tracciante (label -free) la formazione del complesso AgAb viene evidenziata direttamente, senza dover separare le forme di Ag e Ab non legate. PRINCIPIO ANALITICO METODO Agglutinazione Emoagglutinazione Agglutinazione al lattice Precipitazione Rocket immunoelettroforesi Immunoturbidimetria /Nefelometria Immunosensori Resonant mirror biosensor Surface plasmon resonance In questi metodi se la conc è sufficientemente elevata, i complessi sono evidenziabile a occhio nudo. Per concentrazioni inferiori si quantificano sfruttando la loro capacità a deviare un raggio luminoso.  FOTOMETRIA Oltre all’assorbimento della radiazione esistono altri fenomeni che possono essere sfruttati per le misure  RIFLESSIONE: è il fenomeno per cui un’onda, quando colpisce l’interfaccia tra Titolo principale differenti mezzi, cambia direzione e torna nel mezzo di provenienza RIFRAZIONE: è la deviazione subita da un’onda quando passa da un mezzo ad un altro (ad es. da un mezzo meno denso ad uno più denso e dipende dall’indice di rifrazione del mezzo stesso) DIFFUSIONE: o scattering, è un fenomeno in cui le particelle vengono deflesse (cambiano traiettoria) a causa della collisione con altre particelle DIFFRAZIONE: quando un’onda incontra un ostacolo o una fenditura, che abbia dimensioni simili alla sua lunghezza d’onda, avviene la diffrazione.  La luce può essere assorbita da una sostanza disciolta nella soluzione (assorbanza) La luce può essere emessa da una sostanza che assorbe la luce su una lunghezza d'onda e La luce può essere l'emette su un'altra diffusa o rifratta da lunghezza d'onda particelle sospese (fluorescenza) nella soluzione (turbidimetria o nefelometria)  TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA A una maggiore concentrazione dell'analita corrisponde un maggior numero di particelle che impediscono il passaggio della luce attraverso la soluzione facendo aumentare la quantità di luce riflessa TURBIDIMETRIA e NEFELOMETRIA sono le tecniche immunochimiche attualmente più utilizzate che non richiedono l’uso di tracciante. Sono tecniche basate sulla valutazione della LUCE DIFFUSA da parte di un sistema eterogeneo quale soln colloidali o sospensioni. Turbidimetria e nefelometria si applicano a tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida.  TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA Nei colloidi le particelle sono abbastanza grandi da disperdere la luce, perciò quando un raggio di luce le colpisce, un osservatore di lato può osservarne il percorso. CASI LIMITE  La luce è assorbita in maniera notevole per cui l’intensità del raggio uscente è particolarmente attenuata  La luce è notevolmente diffusa dalle particelle in sospensione anche grazie ad un insieme di fenomeni di riflessione e rifrazione da parte delle particelle sospese (effetto Tyndall) originando la cosiddetta luce opalescente Nei colloidi le particelle sono abbastanza grandi da disperdere la luce, perciò quando un raggio di luce le colpisce, un osservatore di lato può osservarne il percorso. In realtà, i due fenomeni limite coesistono sempre, ma con intensità alquanto diverse  TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA Quando l’assorbimento prevale sulla diffusione, si valuta l’entità dell’assorbimento: MISURA TURBIDIMETRICA In TURBIDIMETRIA si misura l’intensità della luce trasmessa da una sospensione: si possono usare colorimetri o spettrofotomeri UV-VIS. In turbidimetria, il rilevatore viene posizionato in asse con la luce incidente e la luce rilevata diminuisce con l'aumentare delle particelle di analita presenti.  TURBIDIMETRIA E NEFELOMETRIA Quando il fenomeno di diffusione è molto più intenso, es per fasi disperse molto fini, allora si procede alla valutazione della luce diffusa dalla sospensione a 90° rispetto la radiazione incidente e si fa una MISURA NEFELOMETRICA In nefelometria, il rilevatore viene posizionato a 90° rispetto al raggio entrante nella cuvette rispetto al percorso del fascio luminoso, per evitare il rilevamento della luce che passa attraverso il campione. Le misure nefelometriche sono molto sensibili e la loro precisione è condizionata da molti fattori, come il pH del mezzo, la presenza di interferenti o che si possono adsorbire sulle particelle colloidali della sospensione.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA Si applica per la determinazione di analiti che, dopo una reazione chimica, formano una sostanza colorata sopra una striscia reattiva (CHIMICA SECCA O DRY CHEMISTRY) oppure per la lettura di strisce ove è stata fatta una separazione di varie fasi, successivamente colorate (ELETTROFORESI). PRINCIPIO: si basa sulla variazione dell’intensità luminosa della luce riflessa (ad una specifica lunghezza d’onda) da una superficie dove è avvenuta una reazione chimica.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA Studia la luce in funzione della lunghezza d’onda riflessa o diffusa da un solido Il campione assorbe alcune componenti della radiazione riducendo l’intensità della luce diffusa.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA Reazioni cromogene su support solido (cellulose modificata o altri materiali) DRY CHEMISTRY Zone reattive delimitate Analita nel fluido biologico Intensità della colorazione in funzione della concentrazione dell’analita Misure della luce riflessa Analisi Quantitativa SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA VANTAGGI Possibile applicare reattivi diversi in diverse zone dello stesso supporto (strisce ad immersione per l’analisi delle urine) Reattivi nel supporto allo stato secco quindi facilità di conservazione I reattivi possono essere stratificati, quindi separati l’uno dall’altro (dissoluzione solo al momento dell’analisi) La zona reattiva può essere costruita in modo da assorbire una quantità standard di campione  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA APPLICAZIONI Glucosio Colestrerolo totale Colesterolo HDL Trigliceridi Creatinina Enzimi : GOT (AST), GPT (ALT) Emogoblobina Anaboliti e cataboliti vari nelle urine (ac. Urico)  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA APPLICAZIONI Dosaggio qualitativo della malaria Dosaggio quantitativo di vari analiti nel sangue Determinazione di alcuni analiti presso Studi Medici Determinazione di alcuni analiti in Veterinaria La tecnica dry chemistry (sviluppata dalla Kodak e adattata a strumentazione di laboratorio per grossa routine) viene impiegata largamente per l’esecuzione del test al letto del paziente e per il POINT OF CARE TESTINTG (P.O.C.T.) La tecnica si basa su LASTRE o STRISCE a vari strati.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA La chimica secca Kodak Ektachem (1986) è un'apparecchiatura di laboratorio progettata per l'analisi di vari componenti chimici in campioni clinici. Utilizza una tecnologia a vetrino secco per eseguire test quantitativi automatizzati su piccoli volumi di campione. La funzione principale del sistema Ektachem è quella di fornire una misurazione rapida e affidabile di analiti come enzimi, elettroliti e altri marcatori biochimici in ambito clinico.  SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA La chimica secca Kodak Ektachem (1986) è un'apparecchiatura di laboratorio progettata per l'analisi di vari componenti chimici in campioni clinici. Utilizza una tecnologia a vetrino secco per eseguire test quantitativi automatizzati su piccoli volumi di campione. La funzione principale del sistema Ektachem è quella di fornire una misurazione rapida e affidabile di analiti come enzimi, elettroliti e altri marcatori biochimici in ambito clinico. https://youtu.be/-AMxY_9sGJI 1) STRATO DI DIFFUSIONE: Ha una porosità isotropica (con proprietà fisiche costanti indipendenti dalla direzione) e serve per distribuire uniformemente il campione sulla superficie della lastra trattenendo molecole, quali proteine, lipidi e pigmenti del siero 2) STRATO DI REAGENTI: su di esso sono presenti i reagenti specifici (completi o parziali) e qui avviene la reazione (finale o parziale), prima del passaggio alla successiva membrana. 3) MEMBRANA SEMIPERMEABILE: Essa consente il passaggio del solo prodotto intermedio di reazione. 4) STRATO INDICATORE: contiene il reattivo finale che porta al colore. 5) SUPPORTO TRASPARENTE: È costituito da una pellicola trasparente attraverso la quale viene effettuata la lettura fotometrica (per riflessione)  DETERMINAZIONE SEMI-QUANTITATIVA IN DRY CHEMISTRY: L’applicazione più diffusa è quella delle strisce reattive per la determinazione dei caratteri chimici delle URINE. PROCEDIMENTO: Una goccia di campione (urina) reagisce su un supporto imbevuto del reattivo specifico; la colorazione che si forma è letta per riflessione mediante l’uso di fibre ottiche, mentre l’intensità del colore sarà proporzionale alla concentrazione dell’analita. VANTAGGI DELLA CHIMICA SECCA: Più agevole lo smaltimento dei rifiuti (solo solidi) Rapidità di esecuzione e di ottenimento del dato analitico SVANTAGGI DELLA CHIMICA SECCA PER LE DETERMINAZIONI QUANTITATIVE: Pochi produttori sul mercato, perciò: monopolio Rigidità delle calibrazioni, per ogni serie di lastre o strisce Sistema rigorosamente «chiuso» METODI TECNICI DI CHIMICA E BIOCHIMICA Lezione 1 SERENA BONIN PRESENTAZIONE DEL CORSO Obiettivi del Corso Fornire le conoscenze di base sui metodi analitici di tipo chimico e biochimico impiegati nell’ambito della Laboratorio biomedico. Testo di Approfondimento: Ciaccio: Trattato di Biochimica Clinica e Medicina di Laboratorio-Ed EDISES, anno di pubblicazione 2021 Modalità d’esame: testo scritto (prova parziale) 2 PRESENTAZIONE DEL CORSO Teams del corso Codice: f8b88tp Materiale del corso File PowerPoint caricati nel canale Teams 3  CLASSIFICAZIONE DEL LABORATORIO BIOMEDICO SULLA BASE DELLA MATRICE BIOLOGICA Area siero e/o plasma (Li eparina oe/o plasma EDTA) Area ematologia (EDTA) Area coagulazione (Na citrato) Area Urine e altri materiali (altri contenitori) CLASSIFICAZIONE DEL LABORATORIO BIOMEDICO SULLA BASE DELLE ATTIVITÀ TECNICHE ANALITICHE/STRUMENTI IMPIEGATI Area di accettazione dei campioni Area proteine Area chimica clinica Area di tossicologia Area immunochimica Area di microbiologia Area emocromocitometrico Area di immunoematologia Area esami di coagulazione Area di biologia molecoare e/o citogenetica Area esami urine standard Altre Aree (autoimmunità, test funzionali…) LABORATORI PLURIDISCIPLINARI LABORATORI SPECIALISTIC 4  FUNZIONE DEL LABORATORIO BIOMEDICO Assistere il medico nella:  Diagnosi di una malattia  Prognosi  Scelta e monitoraggio della terapia  Screening Laboratorio X Attività clinica 5  LABORATORIO BIOMEDICO Genera numeri che diventano informazioni cliniche qualificate solo se ottenuti con ben determinati criteri. Questi dati sono il risultato di MISURAZIONI che sono il compito principale del tecnico sanitario di laboratorio biomedico. IL TECNICO DI LABORATORIO BIOMEDICO o Deve conoscere le variabili che possono influenzare una misura o Trattare in maniera corretta i campioni in esame o Conoscere le tecniche di misura manuale e i principi di funzionamento degli strumenti di laboratorio 6  DEFINIZIONI DI METROLOGIA Misurazione: processo mediante il quale si arriva a descrivere quantitativamente una proprietà, grandezza, di una cosa o un fenomeno Misura: il risultato di un processo di misurazione formato da un insieme di tre dati (valore numerico, unità di misura e grado di incertezza) Grandezza: attributo di una cosa o di un fenomeno che può essere individuato qualitativamente o quantitativamente Misurando: grandezza oggetto della misurazione, che deve essere attentamente individuato e di cui è necessario definire lo stato (es T) Unità di misura: grandezza adottata per convenzione per esprimere 7 quantitativamente grandezze aventi la stessa dimensione Incertezza di misura: stima caratterizzante il campo di valori entro i quali cade il valore proprio più probabile del misurando (analisi  PROCESSO DI MISURAZIONE Individuazione Scelta del del misurando Motivo della metodo di (definire il suo Misurazione Misura stato) 8  METODO DI MISURA DIRETTI INDIRETTI ES. Potenziometria per misurare Richiedono vari passaggi prima di la ddp dovute a cariche elettriche ottenere il segnale da misurare di ioni trasportati in soluzione È fondamentale conoscere le Abbassamento del punto relazioni fra i prodotti che si criogenico (osmolalità di un formano nelle reazioni durante le reazioni che si sviluppano nei campione) procedimenti di misura per poter risalire, ad es, alla concentrazione Permettono di ottenere risulati misurando un segnale rapportabili tra loro con bassa incertezza di misura. Ogni passaggio porta con sé un grado di incertezza ⇛ Imprecisione totale 9  METODI INDIRETTI La grandezza non è misurabile direttamente ma richiede l’utilizzo di reagenti specifici in grado di formare con la sostanza in esame dei prodotti conosciuti che portano con sé un segnale misurabile dagli strumenti di laboratorio. Mediante l’impiego di una strumentazione idonea, si rileva un segnale che viene trasformato in MISURA mediante un processo logico/pratico: LA CALIBRAZIONE Il rapport fra segnale e grandezza in alcuni casi è stabilito da reazioni chimiche o fisiche. Nell’ambiìto della spettrofotometria viene molto spesso impiegata la legge di LAMBERT BEER 10  LEGGE DI LAMBERT-BEER Descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche e sta alla base delle applicazioni di spettrofotometria. Supponiamo che una luce monocromatica di intensità I0 colpisca una soluzione contenuta in una cuvette e sia I l’intensità della radiazione uscente Si definisce trasmittanza T il rapport fra l’intensità della radiazione uscente I (cioè quella che attraversa la soluzione) e quella della radiazione entrante I0 (ovvero della sorgente) 𝑰 𝑻= 𝑰𝟎 Si definisce assorbanza Aabs il logaritmo in base 10 dell’inverso di T 𝟏 𝑰𝟎 𝑨𝒂𝒃𝒔 = 𝒍𝒐𝒈 = 𝒍𝒐𝒈 𝑻 𝑰 11  LEGGE DI LAMBERT-BEER Aabs e T sono correlate rispettivamente alla frazione di energia radiante assorbita o trasmessa dal campione (soluzione), quindi sono NUMERI PURI L’assorbimento di radiazioni elettromagnetiche è descritto dalla legge (sperimentale) di Bouguer-Lambert-Beer o legge di Beer  La legge di Beer è una legge generale a cui obbediscono i fenomeni di assorbimento di radiazione elettromagnetica  La dimostrazione della legge di Beer è stata sviluppata considerando come modello l’assorbimento di analiti in soluzione  È stato dimostrato che l’intensità I della radiazione uscente dal I0 c I campione è funzione : o della radiazione incidente I0 o del cammino ottico b, ovvero delle lunghezza del percorso che la radiazione fa all’interno della soluzione o dalla concentrazione dell’analita in soluzione b 12  LEGGE DI LAMBERT-BEER 𝑰𝟎 𝒍𝒐𝒈 = 𝜺 ∙ 𝒃 ∙ 𝒄 = 𝑨𝒂𝒃𝒔 𝑰 𝜺 è il coefficiente di assorbimento molare e dipende: o dalla 𝝀 della radiazione assorbita I0 c I o dal solvente o dalla specie chimica che dà l’assorbimento Quindi più correttamente la Legge di Beer si scrive: b 𝑨𝒂𝒃𝒔 = 𝜺𝝀 ∙ 𝒃 ∙ 𝒄 𝜺𝝀 NON è noto, quindi questa tecnica è una TECNICA ANALITICA RELATIVA, poiché è necessario costruire una curva di taratura con soluzioni standard dell’analita 13  LEGGE DI LAMBERT-BEER 𝜺𝝀 il coefficiente di assorbimento molare (ε) rappresenta l’Assorbanza (o Densità Ottica) di una soluzione con concentrazione 1M e a cammino ottico unitario (1cm) 𝜺𝝀 Natura chimica Temperatura e solvente Lunghezza d’onda 𝑨𝒂𝒃𝒔 = 𝜺𝝀 ∙ 𝒃 ∙ 𝒄 La radiazione assorbita dipende dal cammino ottico in cui avviene l’assorbimento, dalla concentrazione delle molecole che assorbono, e come assorbe la sostanza e le condizioni in cui si trova. 14  ASSORBIMENTO IN FUNZIONE DEL CAMMINO OTTICO E DELLA CONCENTRAZIONE Assorbanza in funzione della lunghezza del cammino ottico La risposta dell’assorbanza in funzione della concentrazione è lineare solo in un intervallo di valori 15  UTILITÀ DELLA MISURAZIONE DELL’ASSORBIMENTO DI UNA SOLUZIONE Utilizzo pratico della legge di Beer 𝑨𝒂𝒃𝒔 = 𝜺∙𝒃 ∙𝒄 Il coefficiente di assorbimento molare rappresenta la pendenza della retta di calibrazione 𝑨𝒂𝒃𝒔 Assorbanza vs. concentrazione 𝒄= 𝜺 ∙𝒃 (con cammino ottico unitario) 16 DIPENDENZA DELLA LEGGE DI BEER DALLA CONCENTRAZIONE Tipici spettri di assorbimento del MnO4- a cinque diverse concentrazioni. I numeri adiacenti alle curve indicano la concentrazione del Mn in ppm. La specie assorbente è lo ione permanganato; il cammino ottico della cella è 1 cm. Il grafico dell’assorbanza alla λ del picco a 525 nm in funzione della concentrazione è lineare e quindi la relazione soddisfa la legge di Beer. 17  DEVIAZIONI DALLA LINEARITÀ DELLA LEGGE DI BEER FATTORI FISICI E CHIMICI o Concentrazioni troppo elevate. Si ha un cambiamento dell’indice di rifrazione della soln o Concentrazioni troppo elevate di assorbente (C > 0,01 M) o di elettrolita o Variazione del pH: HIn + H2O H3O+ + In- o Temperatura. Può influire su un sistema in equilibrio chimico. o Soluzioni torbide. Effetto scattering della luce. 18  DEVIAZIONI DALLA LINEARITÀ DELLA LEGGE DI BEER FATTORI STRUMENTALI o Solo con radiazioni monocromatiche si verifica un’aderenza stretta alla legge di Beer. o Luce diffusa. La radiazione che esce dal monocromatore è contaminata da una piccola quantità di luce diffusa. o Rumori strumentali o Se S è l’intensità di luce “spuria” proveniente dallo strumento: 𝑰𝟎+𝑺 𝑰𝟎+𝑺 o𝑨 = 𝒍𝒐𝒈 Se C è elevata, I tende a 0 →→ 𝑨= 𝒍𝒐𝒈 𝑺 𝑰+𝑺 L’errore influenza in modo maggiore l’assorbanza 19  APPLICAZIONI QUANTITATIVE DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO o Ampia applicabilità o Alta sensibilità: i limiti di rivelabilità variano da 10-4 a 10-5 M e si può -6 -7 arrivare anche a 10 e 10 M con accorgimenti. o Selettività da moderata ad alta. o Buona accuratezza. Gli errori con apparecchiature e procedure normali sono dell’ordine del 1-5%; con precauzioni fino a 0.1%. o Facilità e convenienza. 20  SPETTROFOTOMETRO o Gli strumenti usati per misurare l’assorbimento della luce da parte di soluzioni sono detti spettrofotometri. o Hanno diversi elementi:  Sorgente di luce  Monocromatore  Compartimento campioni (porta cuvette)  Rivelatore  Indicatore del segnale Schema a blocchi di uno spettrofotometro 21  APPLICAZIONI QUANTITATIVE DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO o Selezione della lunghezza d’onda o Ottimizzazione variabili che influenzano l’assorbanza (es. pH, mascheramento interferenti) o Determinazione della relazione tra assorbanza e concentrazione con opportuno metodo di calibrazione o I calibratori in immunochimica vengono forniti con i kit per poter generare curve di calibrazione su più punti (calibrazione con standard esterno). 22  APPLICAZIONI QUANTITATIVE DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO o E’ di importanza fondamentale che la composizione degli standards sia il più vicina possibile a quella del campione incognito poiché’ soluzioni diverse possono dare tipi di interferenze che influenzano il segnale 23  APPLICAZIONI QUANTITATIVE DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO CHIMICA CLINICA 1. Le analisi di chimica clinica misurano le concentrazioni o le attività delle sostanze (ioni, molecole, complessi) presenti nei fluidi corporei. 2. Per le analisi si possono utilizzare diversi tipi di fluidi corporei, ad esempio sangue intero, plasma, siero, urine e liquido cerebrospinale. 3. L'interpretazione medicale dei risultati delle analisi si basa sul confronto rispetto a un intervallo di riferimento, che riflette la gamma dei valori previsti per gli individui sani o un livello deciso dai medici (MDL) per la diagnosi e il trattamento della patologia. 24  CHIMICA CLINICA La chimica clinica è una scienza quantitativa che si occupa della misurazione delle quantità di sostanze biologicamente rilevanti (denominati analiti) presenti nei fluidi corporei. I metodi per la misurazione di queste sostanze sono progettati in modo rigoroso allo scopo di fornire valutazioni accurate della loro concentrazione. 25  CHIMICA CLINICA La chimica clinica è la branca della medicina di laboratorio che si occupa principalmente delle molecole. Le analisi in un laboratorio di chimica clinica consentono di misurare le concentrazioni di ioni biologicamente significativi (sali e minerali), piccole molecole organiche e macromolecole (soprattutto proteine). 26  CHIMICA CLINICA ANALITI PIÙ COMUNI 27  SERENA BONIN Dip. Di Scienze Mediche, Chirurgiche e della Salute sbonin@units.it www.units.it