Replicación de ADN en Eucariotas

Replicación en Eucariotas

• La replicación en eucariotas implica varias polimerasas en la horquilla de replicación: ADN pol α, ADN pol δ y ADN pol ε, cada una con funciones específicas.
• Se requiere una abrazadera (PCNA) y su complejo de carga (RFC) para la replicación.
• La terminación de la replicación requiere la síntesis de los telómeros (extremos del cromosoma).

Iniciación de la Replicación

• La iniciación de la replicación implica Various proteínas, incluyendo CDC6, CDT1 y MCM.
• La estructura del origen de replicación en E. coli (oriC) tiene 245 pb y secuencias consenso muy conservadas evolutivamente.
• La proteína DnaA es clave en el proceso de inicio de la replicación.
• La fase previa a la iniciación implica la desnaturalización del ADN en la zona DUE dependiente de DnaA.

Características de la Replicación en Eucariotas

• La velocidad de la replicación en eucariotas es de 50 nucleótidos/s, una vigésima parte de la velocidad en E. coli.
• La replicación es bidireccional y progresa en dirección 5´→ 3´.
• La síntesis de la hebra conductora es continua, mientras que la síntesis de la hebra retardada es discontinua.
• La replicación requiere la síntesis de primers o cebadores.

Enzimas y Factores Proteicos Implicados en la Replicación

• El replisoma es un conjunto de enzimas y proteínas que participan en la replicación, incluyendo polimerasas, helicasas, topoisomerasas, SSBs, primasas y ligasas.
• La polimerasa requiere sustratos (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), cofactores (Mn2+ o Mg2+) y un molde o plantilla.
• La necesidad de un cebador o primer se debe a que la polimerasa no puede incorporar el primer nucleótido.

Elongación

• La elongación se desliza a lo largo del ADN.
• El lazo en la hebra rezagada aproxima los dos puntos de polimerización.
• Cada núcleo (core) de la polimerasa sintetiza una hebra distinta.
• El cebador del fragmento de Okazaki anterior se aproxima a las subunidades núcleo.
• El primosoma se forma de nuevo para la síntesis de un nuevo primer, una vez formado la primasa se disocia.

Fragmento de Okazaki

• El fragmento de Okazaki 1 ya está sintetizado, y la Pol III de la hebra retardada está sintetizando el fragmento de Okazaki 2.
• La primasa se asocia temporalmente a DNA B para sintetizar un nuevo primer 3 (en verde) para el fragmento de Okazaki 3.
• El complejo de carga de la abrazadera coloca una nueva abrazadera en el nuevo primer 3 para el fragmento de Okazaki 3.
• El core de pol III continua con la síntesis del fragmento de Okazaki 2 y al acabarla se encuentra con el primer (en verde) del fragmento de Okazaki 1.

Abrazadera

• La abrazadera que ha participado en la síntesis del fragmento 2 se disocia.
• La abrazadera ocupa su posición en el core de la pol III y comienza la síntesis del fragmento de Okazaki 3.
• La hidrólisis de 3 moléculas de ATP permite el cierre de la abrazadera β abierta.

Elongación: etapa final

• ADN pol I elimina ribonucleótidos del cebador y los reemplaza por desoxirribonucleótidos.
• TRASLADO DE LA MELLA: la polimerasa se disocia y la abrazadera se desecha.

Iniciación

• Factores implicados en la iniciación: primosoma, helicasa, ADN pol I y proteína DnaA.
• La metilación del ADN de oriC por la metilasa Dam es una etapa regulada.
• La interacción con la membrana plasmática es importante.

Varios tipos de ADN polimerasa

• ADN polimerasa I: se encarga de la limpieza en la replicación, recombinación y reparación.
• ADN polimerasa II: implicada en un tipo de reparación.
• ADN polimerasa III: enzima principal de la replicación.
• ADN polimerasa IV y V: implicadas en reparaciones.

Replicación del ADN mitocondrial

• Modelo de desplazamiento de hebra: la ARNpol mt sintetiza un ARN cebador.
• El ADN polimerasa γ sintetiza la hebra naciente ADN.
• Topoisomerasa I, Helicasa mt y Twinkle están implicados en la replicación.

Replicación en eucariotas

• La replicación es similar en muchos aspectos a la bacteriana.
• Es semiconservativa, bidireccional y semidiscontinua.
• La mella queda a la espera de que otro enzima la selle.

ADN polimerasa I

• Tiene dos funciones: maduración de los fragmentos de Okazaki y reparación del ADN.
• La ADN polimerasa I tiene 3 actividades diferentes: exonucleasa 5’->3’, exonucleasa 3’->5’ y polimerasa 5’->3’.

Fragmento grande (Klenow) de la ADN pol I

• La eliminación del dominio que contiene la actividad exonucleasa 5’->3’ se obtiene por tratamiento enzimático.
• Conserva actividad de polimerización y de corrección de errores (exonucleasa 3’->5’).

Corrección de errores

• La actividad exonucleasa se localiza por delante de la actividad polimerasa en el desplazamiento de la E a lo largo del ADN.

Transposición Conservadora

• Las secuencias invertidas terminales tienen 9-40 pb
• La transposición conservadora es un mecanismo de "cortar y pegar"
• La mayoría de las secuencias invertidas terminales son fósiles inactivos en humanos debido a la truncación de la transposasa
• Los activos están relacionados con patología humana
• Estas secuencias están activas en plantas, moscas y bacterias

Ejemplos de Transposición Conservadora

• MER1/2 y elementos mariner (Hsmar2) son responsables de reordenaciones cromosómicas importantes en patología humana (Charcot-Marie-Tooth y Síndrome de Prader-Willi/Angelman)

Genoma Mitocondrial

• La mitocondria contiene material genético debido a la teoría endosimbiótica
• La teoría endosimbiótica propone que una α-proteobacteria se fusionó con una célula precursora eucarionte
• El genoma mitocondrial contiene genes que codifican para la síntesis de energía (Sistema OXPHOS)

Organización del Genoma Mitocondrial

• El genoma mitocondrial es circular, cerrado y de doble cadena
• No contiene histonas
• Contiene un 93,3% de codificante
• El ADNmt tiene un tamaño de 16.569 pb y 37 genes

Componentes del Genoma Mitocondrial

• 13 ARN mensajero (proteínas)
• 22 ARN de transferencia
• 2 ARN ribosómico
• H (nt G): 2 ARNr, 14 ARNt, 12 proteínas
• L (nt C): 8 ARNt, 1 proteína
• OXPHOS: 7 genes (ND1, 2, 3, 4L, 4, 5 y 6)
• 1 gene (cyt b)
• 3 genes (COI,II, III)
• 2 genes (ATP 6 y 8)

Proyecto Genoma Humano

• El proyecto se llevó a cabo de 1990-2003
• El primer borrador del genoma es una lectura generada del análisis de 10-20 muestras tomadas de donantes anónimos de diferentes etnias y grupos raciales