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Questions and Answers
Un buffer di PCR etichettato come '10X' richiede una diluizione di dieci volte rispetto al volume totale della reazione per raggiungere la concentrazione di lavoro appropriata.
Un buffer di PCR etichettato come '10X' richiede una diluizione di dieci volte rispetto al volume totale della reazione per raggiungere la concentrazione di lavoro appropriata.
True (A)
L'assenza del loading buffer nei buffer di PCR è imperativa quando si prevede di eseguire il clonaggio del prodotto amplificato, al fine di preservare l'integrità enzimatica e la funzionalità del DNA.
L'assenza del loading buffer nei buffer di PCR è imperativa quando si prevede di eseguire il clonaggio del prodotto amplificato, al fine di preservare l'integrità enzimatica e la funzionalità del DNA.
True (A)
Concentrazioni eccessivamente elevate di MgCl₂ nella miscela di reazione PCR incrementano la specificità dell'appaiamento dei primer, riducendo la formazione di prodotti aspecifici.
Concentrazioni eccessivamente elevate di MgCl₂ nella miscela di reazione PCR incrementano la specificità dell'appaiamento dei primer, riducendo la formazione di prodotti aspecifici.
False (B)
La concentrazione ottimale di dNTPs in una reazione PCR è tale da indurre una condizione di 'saturazione' che inibisce l'ulteriore avanzamento della reazione, garantendo così la sintesi di frammenti di DNA di dimensioni definite.
La concentrazione ottimale di dNTPs in una reazione PCR è tale da indurre una condizione di 'saturazione' che inibisce l'ulteriore avanzamento della reazione, garantendo così la sintesi di frammenti di DNA di dimensioni definite.
Una soluzione madre di primers a 20 μM, derivata dalla risospensione di primers liofilizzati, viene direttamente impiegata nella reazione di PCR senza ulteriori diluizioni per raggiungere una concentrazione finale di 0.4 μM.
Una soluzione madre di primers a 20 μM, derivata dalla risospensione di primers liofilizzati, viene direttamente impiegata nella reazione di PCR senza ulteriori diluizioni per raggiungere una concentrazione finale di 0.4 μM.
L'utilizzo di DNA genomico come templato in una reazione di PCR richiede tipicamente quantità inferiori rispetto al DNA plasmidico purificato, a causa della sua maggiore stabilità strutturale e resistenza agli inibitori.
L'utilizzo di DNA genomico come templato in una reazione di PCR richiede tipicamente quantità inferiori rispetto al DNA plasmidico purificato, a causa della sua maggiore stabilità strutturale e resistenza agli inibitori.
La mancata riuscita di una reazione PCR dovuta alla presenza di inibitori nel DNA genomico può essere risolta incrementando la quantità di DNA templato, al fine di saturare gli inibitori e favorire l'amplificazione specifica.
La mancata riuscita di una reazione PCR dovuta alla presenza di inibitori nel DNA genomico può essere risolta incrementando la quantità di DNA templato, al fine di saturare gli inibitori e favorire l'amplificazione specifica.
L'unità di misura primaria per la Taq DNA polimerasi in una reazione PCR è la concentrazione molare, poiché riflette direttamente la quantità di enzima attivo presente nella miscela di reazione e la sua capacità di catalizzare la polimerizzazione del DNA.
L'unità di misura primaria per la Taq DNA polimerasi in una reazione PCR è la concentrazione molare, poiché riflette direttamente la quantità di enzima attivo presente nella miscela di reazione e la sua capacità di catalizzare la polimerizzazione del DNA.
L'incorporazione di un nucleotide marcato tramite DNA polimerasi I durante la marcatura interna di una sonda, specifica per adenina (A), è invariabilmente ottenuta dall'utilizzo esclusivo di ATP marcato con un isotopo radioattivo sul fosfato $\gamma$.
L'incorporazione di un nucleotide marcato tramite DNA polimerasi I durante la marcatura interna di una sonda, specifica per adenina (A), è invariabilmente ottenuta dall'utilizzo esclusivo di ATP marcato con un isotopo radioattivo sul fosfato $\gamma$.
Nel contesto della marcatura terminale di una sonda, l'utilizzo della polinucleotide chinasi garantisce una marcatura ad alta efficienza, producendo costantemente livelli elevati di incorporazione del fosfato marcato in posizione 5' terminale.
Nel contesto della marcatura terminale di una sonda, l'utilizzo della polinucleotide chinasi garantisce una marcatura ad alta efficienza, producendo costantemente livelli elevati di incorporazione del fosfato marcato in posizione 5' terminale.
La tecnica di marcatura mediante nick translation implica che l'attività esonucleasica 5'→3' della DNA polimerasi I è totalmente inibita per garantire un'incorporazione efficiente di ATP marcato.
La tecnica di marcatura mediante nick translation implica che l'attività esonucleasica 5'→3' della DNA polimerasi I è totalmente inibita per garantire un'incorporazione efficiente di ATP marcato.
Nell'analisi microarray, l'utilizzo di cDNA derivato da un organismo in condizioni specifiche mira esclusivamente a identificare i geni silenziati in quel determinato momento.
Nell'analisi microarray, l'utilizzo di cDNA derivato da un organismo in condizioni specifiche mira esclusivamente a identificare i geni silenziati in quel determinato momento.
Il processo di end-filling, utilizzato nella marcatura interna, si basa sull'attività della DNA ligasi per unire i nucleotidi marcati alle estremità a singolo filamento.
Il processo di end-filling, utilizzato nella marcatura interna, si basa sull'attività della DNA ligasi per unire i nucleotidi marcati alle estremità a singolo filamento.
Nella PCR, la temperatura di annealing dei primer è calcolata sottraendo un valore costante di 5°C dalla temperatura di melting (Tm) per assicurare una corretta ibridazione.
Nella PCR, la temperatura di annealing dei primer è calcolata sottraendo un valore costante di 5°C dalla temperatura di melting (Tm) per assicurare una corretta ibridazione.
L'utilizzo di oligonucleotidi completamente omopolimerici, composti esclusivamente da ripetizioni di un'unica base azotata (es. AAAAAA), è essenziale nel random priming per garantire un'amplificazione uniforme di tutte le regioni del DNA target.
L'utilizzo di oligonucleotidi completamente omopolimerici, composti esclusivamente da ripetizioni di un'unica base azotata (es. AAAAAA), è essenziale nel random priming per garantire un'amplificazione uniforme di tutte le regioni del DNA target.
Una temperatura di melting (Tm) di 72°C per un primer indica che, in condizioni standard di PCR, l'annealing del primer al DNA target avverrà con massima efficienza a questa temperatura esatta.
Una temperatura di melting (Tm) di 72°C per un primer indica che, in condizioni standard di PCR, l'annealing del primer al DNA target avverrà con massima efficienza a questa temperatura esatta.
Un'esonucleasi che agisce sull'estremità 5' di un filamento di DNA può, in certe condizioni sperimentali, essere convertita per agire anche sull'estremità 3' dello stesso filamento mediante modifiche chimiche specifiche dell'enzima.
Un'esonucleasi che agisce sull'estremità 5' di un filamento di DNA può, in certe condizioni sperimentali, essere convertita per agire anche sull'estremità 3' dello stesso filamento mediante modifiche chimiche specifiche dell'enzima.
La T4 DNA ligasi ricombinante, derivata da E. coli, è in grado di ligare frammenti di DNA con estremità modificate con nucleotidi non standard (es. locked nucleic acids - LNA) con la stessa efficienza delle estremità coesive standard.
La T4 DNA ligasi ricombinante, derivata da E. coli, è in grado di ligare frammenti di DNA con estremità modificate con nucleotidi non standard (es. locked nucleic acids - LNA) con la stessa efficienza delle estremità coesive standard.
Un'endonucleasi di restrizione che riconosce una sequenza palindromica di 8 coppie di basi (bp) taglierà, in media, un genoma batterico di 4 milioni di bp circa 15 volte, assumendo una distribuzione casuale delle basi.
Un'endonucleasi di restrizione che riconosce una sequenza palindromica di 8 coppie di basi (bp) taglierà, in media, un genoma batterico di 4 milioni di bp circa 15 volte, assumendo una distribuzione casuale delle basi.
La digestione enzimatica completa di un plasmide circolare rilassato con un'endonucleasi di restrizione che ha un singolo sito di taglio nel plasmide, genera una molecola di DNA lineare con due estremità coesive identiche.
La digestione enzimatica completa di un plasmide circolare rilassato con un'endonucleasi di restrizione che ha un singolo sito di taglio nel plasmide, genera una molecola di DNA lineare con due estremità coesive identiche.
L'assorbanza di una soluzione di DNA misurata a 260 nm in uno spettrofotometro con un cammino ottico di 1 cm è pari a 0.5. Ciò implica che la concentrazione del DNA è approssimativamente di 25 μg/mL, indipendentemente dalla composizione in basi del DNA.
L'assorbanza di una soluzione di DNA misurata a 260 nm in uno spettrofotometro con un cammino ottico di 1 cm è pari a 0.5. Ciò implica che la concentrazione del DNA è approssimativamente di 25 μg/mL, indipendentemente dalla composizione in basi del DNA.
In una reazione di ligazione, l'aumento della concentrazione di ATP oltre la concentrazione ottimale raccomandata per la T4 DNA ligasi promuove la formazione di concatenameri lineari di DNA piuttosto che la circolarizzazione del DNA.
In una reazione di ligazione, l'aumento della concentrazione di ATP oltre la concentrazione ottimale raccomandata per la T4 DNA ligasi promuove la formazione di concatenameri lineari di DNA piuttosto che la circolarizzazione del DNA.
L'utilizzo di un buffer di restrizione con una concentrazione di sale significativamente inferiore a quella raccomandata dall'azienda produttrice dell'enzima può portare a un aumento della specificità dell'enzima, riducendo la probabilità di tagli in siti non canonici.
L'utilizzo di un buffer di restrizione con una concentrazione di sale significativamente inferiore a quella raccomandata dall'azienda produttrice dell'enzima può portare a un aumento della specificità dell'enzima, riducendo la probabilità di tagli in siti non canonici.
Per massimizzare l'efficienza di clonaggio di un frammento di DNA in un vettore plasmidico linearizzato, è sempre consigliabile trattare sia il frammento che il vettore con fosfatasi alcalina prima della ligazione, indipendentemente dal tipo di estremità (piatte o coesive).
Per massimizzare l'efficienza di clonaggio di un frammento di DNA in un vettore plasmidico linearizzato, è sempre consigliabile trattare sia il frammento che il vettore con fosfatasi alcalina prima della ligazione, indipendentemente dal tipo di estremità (piatte o coesive).
Una membrana di nitrocellulosa, impiegata nel blotting, manifesta una capacità di legame superiore per frammenti di DNA di piccole dimensioni rispetto a quelli di grandi dimensioni, grazie alla sua intrinseca porosità differenziale.
Una membrana di nitrocellulosa, impiegata nel blotting, manifesta una capacità di legame superiore per frammenti di DNA di piccole dimensioni rispetto a quelli di grandi dimensioni, grazie alla sua intrinseca porosità differenziale.
Il legame del DNA a una membrana di nylon avviene tramite interazioni idrofobiche reversibili, consentendo una facile rimozione del DNA senza compromettere l'integrità della membrana per successive analisi.
Il legame del DNA a una membrana di nylon avviene tramite interazioni idrofobiche reversibili, consentendo una facile rimozione del DNA senza compromettere l'integrità della membrana per successive analisi.
L'incremento della concentrazione di formammide nel buffer di pre-ibridazione eleva la temperatura di denaturazione del DNA, accelerando l'annealing non specifico e riducendo il background nelle successive ibridazioni.
L'incremento della concentrazione di formammide nel buffer di pre-ibridazione eleva la temperatura di denaturazione del DNA, accelerando l'annealing non specifico e riducendo il background nelle successive ibridazioni.
Nell'esecuzione di Southern blotting, l'utilizzo di alte concentrazioni saline durante i lavaggi post-ibridazione promuove la rimozione selettiva delle sonde non ibridate, preservando l'integrità dei legami specifici e riducendo artefatti interpretativi.
Nell'esecuzione di Southern blotting, l'utilizzo di alte concentrazioni saline durante i lavaggi post-ibridazione promuove la rimozione selettiva delle sonde non ibridate, preservando l'integrità dei legami specifici e riducendo artefatti interpretativi.
Sonde oligonucelotidiche con temperature di melting inferiori di almeno 25°C rispetto alla temperatura di ibridazione ottimale sono ideali per discriminare varianti alleliche singole in condizioni di stringenza elevata, minimizzando ibridazioni spurie.
Sonde oligonucelotidiche con temperature di melting inferiori di almeno 25°C rispetto alla temperatura di ibridazione ottimale sono ideali per discriminare varianti alleliche singole in condizioni di stringenza elevata, minimizzando ibridazioni spurie.
Durante la preparazione di sonde degenerate per l'ibridazione, l'introduzione strategica di inosine in posizioni altamente variabili del codone minimizza la complessità della sonda senza compromettere l'efficienza di ibridazione a sequenze target correlate evolutivamente.
Durante la preparazione di sonde degenerate per l'ibridazione, l'introduzione strategica di inosine in posizioni altamente variabili del codone minimizza la complessità della sonda senza compromettere l'efficienza di ibridazione a sequenze target correlate evolutivamente.
L'utilizzo di sonde eterologhe in esperimenti di ibridazione in situ incrementa la specificità dell'interazione sonda-target poiché sfrutta regioni genomiche altamente conservate tra specie distanti, riducendo la probabilità di cross-ibridazione non specifica.
L'utilizzo di sonde eterologhe in esperimenti di ibridazione in situ incrementa la specificità dell'interazione sonda-target poiché sfrutta regioni genomiche altamente conservate tra specie distanti, riducendo la probabilità di cross-ibridazione non specifica.
L'incorporazione di deossinucleotidi trifosfati (dNTPs) modificati con gruppi reporter ingombranti durante la sintesi della sonda, pur facilitando la rilevazione, può paradossalmente incrementare la velocità di ibridazione grazie all'effetto entropico indotto dalla destabilizzazione temporanea delle strutture secondarie del DNA target.
L'incorporazione di deossinucleotidi trifosfati (dNTPs) modificati con gruppi reporter ingombranti durante la sintesi della sonda, pur facilitando la rilevazione, può paradossalmente incrementare la velocità di ibridazione grazie all'effetto entropico indotto dalla destabilizzazione temporanea delle strutture secondarie del DNA target.
Nel processo di Southern blotting, l'utilizzo di membrane di polivinilidenfluoruro (PVDF) al posto di nitrocellulosa comprometterebbe significativamente l'efficienza di trasferimento degli acidi nucleici a causa della minore affinità del PVDF per il DNA.
Nel processo di Southern blotting, l'utilizzo di membrane di polivinilidenfluoruro (PVDF) al posto di nitrocellulosa comprometterebbe significativamente l'efficienza di trasferimento degli acidi nucleici a causa della minore affinità del PVDF per il DNA.
L'efficacia del trasferimento capillare nel Southern blotting è inversamente proporzionale alla viscosità del buffer di trasferimento, a causa dell'influenza della viscosità sulla velocità di migrazione del DNA attraverso il gel.
L'efficacia del trasferimento capillare nel Southern blotting è inversamente proporzionale alla viscosità del buffer di trasferimento, a causa dell'influenza della viscosità sulla velocità di migrazione del DNA attraverso il gel.
Nel Southern blotting, l'incubazione della membrana con probe marcati avviene necessariamente prima del fissaggio del DNA alla membrana per garantire un'ibridazione efficiente.
Nel Southern blotting, l'incubazione della membrana con probe marcati avviene necessariamente prima del fissaggio del DNA alla membrana per garantire un'ibridazione efficiente.
L'autoradiografia, utilizzata nella fase finale del Southern blotting, rileva direttamente la presenza del DNA bersaglio sulla membrana, senza la necessità di sonde radioattive.
L'autoradiografia, utilizzata nella fase finale del Southern blotting, rileva direttamente la presenza del DNA bersaglio sulla membrana, senza la necessità di sonde radioattive.
Un aumento della concentrazione di sale nel buffer di pre-ibridazione durante il Southern blotting accelererebbe il processo di denaturazione del DNA bersaglio sulla membrana, migliorando l'accessibilità per le sonde.
Un aumento della concentrazione di sale nel buffer di pre-ibridazione durante il Southern blotting accelererebbe il processo di denaturazione del DNA bersaglio sulla membrana, migliorando l'accessibilità per le sonde.
L'utilizzo di filtri di vetro borosilicato al posto della carta assorbente durante il trasferimento capillare nel Southern blotting migliorerebbe significativamente la risoluzione delle bande di DNA sulla membrana grazie alla maggiore uniformità della pressione esercitata.
L'utilizzo di filtri di vetro borosilicato al posto della carta assorbente durante il trasferimento capillare nel Southern blotting migliorerebbe significativamente la risoluzione delle bande di DNA sulla membrana grazie alla maggiore uniformità della pressione esercitata.
Nel Southern blotting, l'utilizzo di un campo elettrico applicato perpendicolarmente alla membrana durante il trasferimento capillare accelererebbe il processo di trasferimento per tutte le molecole di DNA, indipendentemente dalla loro dimensione, garantendo una resa uniforme.
Nel Southern blotting, l'utilizzo di un campo elettrico applicato perpendicolarmente alla membrana durante il trasferimento capillare accelererebbe il processo di trasferimento per tutte le molecole di DNA, indipendentemente dalla loro dimensione, garantendo una resa uniforme.
L'aggiunta di agenti caotropici, come il tiocianato di guanidinio, al buffer di trasferimento nel Southern blotting migliorerebbe l'efficienza di ibridazione delle sonde al DNA immobilizzato sulla membrana, facilitando l'apertura delle strutture secondarie del DNA.
L'aggiunta di agenti caotropici, come il tiocianato di guanidinio, al buffer di trasferimento nel Southern blotting migliorerebbe l'efficienza di ibridazione delle sonde al DNA immobilizzato sulla membrana, facilitando l'apertura delle strutture secondarie del DNA.
L'inibizione dell'enzima prima del raggiungimento delle condizioni ottimali di annealing durante l'assemblaggio della reazione è una caratteristica indesiderabile e deliberatamente evitata nel protocollo di PCR standard.
L'inibizione dell'enzima prima del raggiungimento delle condizioni ottimali di annealing durante l'assemblaggio della reazione è una caratteristica indesiderabile e deliberatamente evitata nel protocollo di PCR standard.
In un ciclo termico universale di PCR, la fase di denaturazione iniziale è rigorosamente definita a 93°C e non ammette alcuna variazione per ottimizzare l'amplificazione di sequenze ricche di GC.
In un ciclo termico universale di PCR, la fase di denaturazione iniziale è rigorosamente definita a 93°C e non ammette alcuna variazione per ottimizzare l'amplificazione di sequenze ricche di GC.
L'abbassamento della temperatura di annealing durante la PCR aumenta l'ibridazione aspecifica dei primer, il che è sempre indesiderabile e indica un protocollo di PCR mal progettato.
L'abbassamento della temperatura di annealing durante la PCR aumenta l'ibridazione aspecifica dei primer, il che è sempre indesiderabile e indica un protocollo di PCR mal progettato.
In condizioni di amplificazione subottimali, un aumento della concentrazione di $MgCl_2$ potenzia esclusivamente l'amplificazione delle regioni target, senza alcun impatto sull'amplificazione aspecifica.
In condizioni di amplificazione subottimali, un aumento della concentrazione di $MgCl_2$ potenzia esclusivamente l'amplificazione delle regioni target, senza alcun impatto sull'amplificazione aspecifica.
La processività della Taq polimerasi canonica è invariabile e intrinsecamente limitata a 1000 bp al minuto, indipendentemente dalle condizioni di reazione o dalle modifiche enzimatiche.
La processività della Taq polimerasi canonica è invariabile e intrinsecamente limitata a 1000 bp al minuto, indipendentemente dalle condizioni di reazione o dalle modifiche enzimatiche.
L'incremento selettivo della concentrazione di dNTPs non influenza la resa e la specificità della reazione di PCR, dato che la Taq polimerasi possiede un'affinità saturante per i substrati nucleotidici.
L'incremento selettivo della concentrazione di dNTPs non influenza la resa e la specificità della reazione di PCR, dato che la Taq polimerasi possiede un'affinità saturante per i substrati nucleotidici.
L'ottimizzazione della reazione di PCR, focalizzata sulla diminuzione della temperatura di annealing, assicura sempre l'eliminazione dei prodotti aspecifici, incrementando esclusivamente la resa del frammento target desiderato.
L'ottimizzazione della reazione di PCR, focalizzata sulla diminuzione della temperatura di annealing, assicura sempre l'eliminazione dei prodotti aspecifici, incrementando esclusivamente la resa del frammento target desiderato.
A concentrazioni standard di $MgCl_2$, l'aggiunta di agenti chelanti potenzia la reazione di PCR, incrementando la disponibilità di ioni magnesio liberi e promuovendo l'attività polimerasica.
A concentrazioni standard di $MgCl_2$, l'aggiunta di agenti chelanti potenzia la reazione di PCR, incrementando la disponibilità di ioni magnesio liberi e promuovendo l'attività polimerasica.
Flashcards
Nucleasi
Nucleasi
Enzimi che tagliano il DNA al legame fosfodiesterico.
Esonucleasi
Esonucleasi
Nucleasi che degradano gli acidi nucleici dalle estremità.
Endonucleasi
Endonucleasi
Nucleasi che rompono il legame fosfodiesterico internamente.
Endonucleasi di restrizione
Endonucleasi di restrizione
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Ligasi
Ligasi
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Estremità coesive
Estremità coesive
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Estremità piatte
Estremità piatte
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T4 DNA ligasi
T4 DNA ligasi
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Blotting paper
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Posizionamento del gel
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Membrana di nitrocellulosa/nylon
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Azione capillare
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Trasferimento overnight
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Fissaggio del DNA
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Probe radioattivi
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Autoradiografia
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PCR Hot Start
PCR Hot Start
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Denaturazione (PCR)
Denaturazione (PCR)
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Annealing (PCR)
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Estensione (PCR)
Estensione (PCR)
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Estensione Finale (PCR)
Estensione Finale (PCR)
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Bassa temperatura di Annealing
Bassa temperatura di Annealing
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Alta temperatura di Annealing
Alta temperatura di Annealing
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Magnesio Cloruro (PCR)
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Nitrocellulosa
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Nylon
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Preibridazione
Preibridazione
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Ibridazione
Ibridazione
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Lavaggi post-ibridazione
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Sonde
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Lunghezza della sonda e specificità
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Sonde degenerate
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Marcatura terminale
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Marcatura interna
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Nick translation
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End filling
End filling
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Random priming
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Analisi Microarray
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PCR
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Temperatura di melting (Tm)
Temperatura di melting (Tm)
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MgCl₂ nella PCR
MgCl₂ nella PCR
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Cos'è '10X' o '5X' in un buffer PCR?
Cos'è '10X' o '5X' in un buffer PCR?
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Cos'è il loading buffer?
Cos'è il loading buffer?
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Effetto di alte concentrazioni di MgCl₂
Effetto di alte concentrazioni di MgCl₂
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Cosa sono i dNTPs nella PCR?
Cosa sono i dNTPs nella PCR?
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Come vengono preparati i primers per PCR?
Come vengono preparati i primers per PCR?
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Quantità di templato DNA nella PCR
Quantità di templato DNA nella PCR
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Come viene quantificata la Taq DNA polimerasi?
Come viene quantificata la Taq DNA polimerasi?
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Study Notes
Valutazione della Qualità e Quantità del DNA: Corsa Elettroforetica
- La corsa elettroforetica permette di determinare la qualità e la quantità del DNA.
- Gli acidi nucleici, carichi negativamente, migrano in un campo elettrico attraverso una matrice porosa.
- La velocità di migrazione è influenzata dalla dimensione e, in parte, dalla forma delle molecole di DNA.
- L'elettroforesi si svolge in una camera con due elettrodi immersi in un tampone (es. TAE 1X o TBE 1 o 0,5X) contenente EDTA per prevenire la degradazione del DNA.
Matrici per Elettroforesi
- Agarosio: Un polisaccaride che forma pori di dimensioni variabili in base alla concentrazione, utile per separare frammenti di DNA di dimensioni comprese tra 50 bp e 25 kbp con differenze di almeno 20/30 bp.
- La concentrazione di agarosio influenza la separazione: alta concentrazione per frammenti piccoli, bassa per quelli grandi.
- La corsa viene condotta a voltaggio costante di 3 V/cm.
- Esistono versioni modificate dell'agarosio per lavorare con frammenti di dimensioni diverse.
- Acrilammide: Offre una maggiore risoluzione, separando frammenti molto simili tra loro, con una concentrazione minima del 3%, adatta per frammenti fino a 500 bp.
- La scelta della matrice dipende dalla dimensione dei frammenti da separare.
- Elettroforesi in campo pulsato: Utilizzata per frammenti di DNA molto grandi, con elettrodi posti a 45 gradi e campo elettrico variabile.
- Questo metodo permette a frammenti grandi di attraversare più facilmente la matrice, usato per cromosomi di lievito.
Visualizzazione e Rivelazione
- I campioni sono caricati in pozzetti con loading buffer e glicerolo per aumentarne la densità.
- La corsa avviene in presenza di coloranti, precedentemente si usava etidio bromuro (mutageno).
- Attualmente si usano sostanze intercalanti del DNA che emettono un segnale fluorescente eccitabili con luce UV o blu.
- La visualizzazione avviene con un transluminatore o gelDOC.
- Alternative includono metodi radioattivi come il silver staining.
- Al termine della corsa, si osservano bande di DNA: il DNA genomico in alto e i prodotti di PCR nella parte bassa del gel.
Stima di Dimensione e Concentrazione
- Stima della dimensione dei frammenti: si usa un marcatore di pesi molecolari di dimensioni note.
- Stima della concentrazione del DNA: si confronta l'intensità delle bande del campione con quelle di una scala di DNA genomico a concentrazioni note.
Qualità del DNA
- La qualità del DNA si valuta osservando la presenza di una singola banda (DNA integro) o uno smear (DNA degradato).
- È possibile recuperare singoli frammenti di interesse dal gel per purificarli.
- Sistemi di microfluidica: utilizzano chip con pozzetti e canali con matrice, con rilevazione tramite coloranti per visualizzare un'immagine digitale del DNA.
Analisi Spettrofotometrica
- Il DNA in soluzione acquosa ha un picco di assorbanza a 260nm, utile per determinarne la concentrazione.
- Per risultati attendibili, l'assorbanza deve essere tra 0,1 e 1 OD, misurata in uno spettrofotometro con cuvette di quarzo dopo averlo azzerato con il bianco.
- La trasformazione per ottenere la concentrazione è: 1 OD = 50 ng/μL per dsDNA (40 ng/μL per ssDNA).
- Si misurano altri valori di assorbanza per valutare la purezza del campione:
- 280nm: indica la presenza di proteine, con un rapporto OD260/OD280 ideale tra 1,8 e 2.
- 230nm: indica contaminazione da guanidinio, fenolo o polisaccaridi (valore ideale 2.0/2.2).
- 320nm: dovrebbe essere molto bassa, utile per verificare che tutto sia corretto.
Nanodrop
- Spettrofotometro che usa volumi ridotti di campione (1,5-2µL), riducendo lo spreco.
- Una goccia di DNA viene caricata, e un raggio UV misura l'assorbanza attraverso una colonna di liquido.
Manipolazione Enzimatica del DNA Purificato
- Il DNA può essere manipolato con enzimi purificati o prodotti ricombinanti, che svolgono diverse funzioni cellulari.
Nucleasi
- Le nucleasi tagliano il DNA nei legami fosfodiesterici, e si dividono in:
- Esonucleasi: accorciano e degradano gli acidi nucleici dalle estremità (5' o 3', o entrambe).
- Endonucleasi: rompono i legami fosfodiesterici interni al DNA, su singolo o doppio filamento.
- Endonucleasi di restrizione: tagliano il DNA in sequenze specifiche (4-6 bp o più lunghe), producendo estremità piatte o coesive, usate nel clonaggio classico.
- Si può stimare la frequenza di taglio di un enzima di restrizione in un genoma o frammento.
Reazione di Restrizione
- Si allestisce combinando DNA, buffer specifico per l'enzima di restrizione ed enzima di restrizione.
- L'incubazione è a 37°C per un tempo variabile (3 ore per clonaggio, 1 ora per verificare la presenza del sito).
- Dopo la digestione, si purifica il DNA se si deve clonare; altrimenti, si carica direttamente sul gel.
- Se si usano più enzimi, si controllano le compatibilità dei buffer.
Ligasi
- Le ligasi uniscono molecole di acidi nucleici, riparando discontinuità nei legami fosfodiesterici su singola o doppia elica.
- Funzionano con estremità piatte o coesive (più efficienti).
- L'enzima usato è la T4 DNA ligasi di E. coli.
- PCR con siti di restrizione: i primer per PCR possono essere disegnati con siti di restrizione al 5', per poi inserire il frammento amplificato in un vettore.
Polimerasi
- Le polimerasi copiano gli acidi nucleici usando uno stampo e necessitano di un primer.
- DNA polimerasi I: ha attività polimerasica ed esonucleasica 5'-3', quindi ripara i "nick" sostituendo i nucleotidi adiacenti, anche se corretti.
- Frammento di Klenow: deriva dalla DNA polimerasi I ma ha solo attività polimerasica, quindi riempie i "nick" senza sostituire i nucleotidi esistenti.
- Taq DNA polimerasi I: di Thermus acquaticus, stabile alle alte temperature, usata per la PCR.
- Trascrittasi inversa: sintetizza cDNA usando RNA come stampo.
Enzimi di Modificazione
- Sono enzimi che rimuovono o aggiungono gruppi chimici:
- Fosfatasi alcalina: rimuove il fosfato in 5' dal DNA.
- Polinucleotide kinasi (PNK): aggiunge il fosfato in 5' terminale, usata per ligazioni che richiedono il fosfato.
- Questi enzimi possono sostituire il fosfato presente con uno radioattivo o marcato.
Ibridazione Molecolare
- L'ibridazione molecolare si basa sulla denaturazione e rinaturazione del DNA.
- La denaturazione avviene con l'aumento della temperatura (DNA da ds a ss).
- La rinaturazione è il processo inverso che avviene raffreddando il DNA.
- Il processo dipende dalla composizione del DNA: più GC, più calore è necessario per la denaturazione.
- La temperatura di Melting è la temperatura a cui il 50% del DNA è denaturato.
- Due filamenti di DNA a singolo filamento si ibridano abbassando la temperatura.
- L'ibridazione stabile si ha quando sono presenti molti legami idrogeno e alta complementarietà tra le basi.
Applicazioni dell'Ibridazione
- L'ibridazione DNA/DNA studia l'organizzazione dei geni nel genoma tramite Southern blotting o screening di librerie genomiche o cDNA.
- Le applicazioni includono definire quanti membri di una famiglia genica ci sono (Southern blotting), verificare copie di transgeni (Southern blotting), arricchire geni in tessuti specifici, isolare cloni in librerie genomiche o cDNA, e analisi microarray.
Southern Blotting
- Identifica la presenza di un gene di interesse in un campione di DNA.
- Protocollo che sfrutta l'ibridazione molecolare del DNA genomico trasferito su una membrana.
- Digestione del DNA genomico: almeno 10μg di DNA sono digeriti ed effettuata la separazione in gel.
- Costruzione del castelletto: gel immerso in tampone con carta assorbente, membrana di nitrocellulosa sopra il gel, e altra carta assorbente per il trasferimento capillare del DNA.
- Trasferimento e Fissaggio: Il liquido risale per capillarità, portando il DNA dal gel alla membrana (overnight).
- Il DNA può essere trattato con HCl per la depurinazione per facilitare il trasferimento, seguito da neutralizzazione.
- Il DNA viene fissato alla membrana con UV o calore (80°C), poi la membrana viene ibridata con sonde marcate.
- Ibridazione e Rivelazione :La sonda si lega ai siti complementari sul DNA digerito e fissato alla membrana.
- La membrana viene lavata e si rileva l'appaiamento della sonda (ad esempio, con autoradiografia per sonde radioattive).
Membrane Utilizzate
- Nitrocellulosa:
- Bassa capacità di legame (adatta per frammenti piccoli).
- Legame idrofobico e non covalente.
- Poco robusta e difficile da riutilizzare/conservare.
- Basso background.
- Nylon:
- Maggiore capacità di legame.
- Legame covalente del DNA.
- Più robusta e riutilizzabile.
- Diversi tipi (neutre o cariche positivamente), le cariche hanno maggiore capacità di legame ma causano background aspecifico, richiedendo protocolli specifici di trasferimento e blocking.
Condizioni di Ibridazione
- Preibridazione: la membrana viene preibridata nella stessa soluzione di ibridazione per bloccare legami aspecifici, in tubi rotanti, bustine di plastica o vaschette.
- Ibridazione: condotta in tubi rotanti, bustine o vaschette a 65°C o 42°C (la formammide abbassa la temperatura).
- Lavaggio: le membrane sono lavate con buffer a concentrazioni di sali decrescenti per favorire il legame specifico.
- Rimozione della Sonda e Riutilizzo: La sonda può essere rimossa e la membrana riutilizzata.
Oligonucleotidi come Sonde
- Selezione e Amplificazione:
- Si sceglie il gene di interesse e si amplifica l'oligo, usando una temperatura di Melting di almeno 10°C superiore all'ibridazione.
- Maggiore è la lunghezza, maggiore è la specificità.
- Sonde Eterologhe: utilizzate per vedere geni condivisi in organismi diversi.
- Sonde Degenerate: nucleotidi variabili, con ibridazione fino al 70% di complementarietà.
- Marcatura: la sonda è resa visibile con nucleotidi tracciabili (radioattività o altro), purificando la sonda dopo la marcatura per rimuovere nucleotidi non incorporati con cromatografia.
Metodi di Marcatura delle Sonde
- Marcatura Terminale: la polinucleotide chinasi sostituisce un gruppo OH con un fosfato marcato al 5' terminale (bassi livelli di marcatura).
- Marcatura Interna: DNA polimerasi I o frammento di Klenow inseriscono ATP marcato al posto delle A.
- Nick Translation: DNasi crea "nick" riparati con DNA polimerasi I e ATP marcato.
- End Filling:frammento di Klenow ripara estremità a singolo filamento con ATP marcato.
- Random Priming:: oligonucleotidi randomici (6-7bp) creano un ds che lega Klenow, marcando il DNA.
Marcatura non Radioattiva
- Caratteristiche:
- Meno pericolosa.
- Nessun problema di smaltimento di radioattivo.
- Più veloce ed economica.
- Molti kit disponibili.
- Sistema di rilevazione: sistema di rivelazione indiretto con minor sensibilità a alti background.
- Analisi Microarray: oligonuleotidi complementari a tutti geni genomici sono fissati ad un supporto solido.
- cDNA da un organismo in certe condizioni è marcato e ibridato al supporto per vedere quali geni sono espressi.
Analisi del DNA Mediante PCR
- La PCR si compone di tre step:
- denaturazione.
- annealing.
- extension.
Disegno di Primer
- Il processo si disegna in base al disegno di primer per creare un innesto di dsDNA.
- I primer presentano una sequenza da 20-25 paia di basi con una temperatura di melting e annealing definita dall'operatore.
T di melting
- temperatura a la quale metà del primer è dissociato dal templato: T m = (4 x GC) + (2 x AT)
T di annealing
- deve essere il più vicino possibile alla temperatura di melting, per favorire la specificità, ma non troppo alta per garantire un buon appaiamento e una certa efficienza.
- È importante che la sequenza del primer dia una T m compresa tra 50 gradi C, e la temperatura di annealing invece viene definita dall'operatore ed è minore di 5 rispetto alla T m affinché i primer siano ibridati.
- Il primer forward corrisponde alla sequenza 5'→3 mentre il primer reverse è il reverse complement letto dalla fine.
Ulteriori considerazioni sui Primer
- È possibile modificare il 5' del primer senza problemi, mentre il 3' non deve essere modificato e inoltre deve essere arricchito da sequenze con alto contenuto di GC per favorire l'appaiamento specifico.
Al 5 sono invece consentite diverse modifiche per:
- siti di restrizione per il clonaggio.
- aggiunta di gruppi fluorescenti ovvero fluorofori che sono molecole stericamente ingombranti. In questo modo si ha un tag e l'amplicone può essere rilevato.
- Sono presenti dei software che si occupano del disegno dei primer e consentono di ottimizzare la sequenza affinché non ci siano ripiegamenti all'interno del primer.
Allestimento Reazione PCR
- La PCR è composta da volumi grandi a piccoli per un lavaggio più efficace.
Buffer 10X o 5X
- Mantiene le condizioni idonee di Ph per la reazione.
- Alcuni contengono Magnesio che svolge una funzione come cofattore per la polimeresi.
- Il campione deve essere 1µL/5 µL, quindi deve essere diluito.
- In alcuni il buffer può contenere il loading buffer .
MgCl2
- Serve a modulare la reazione.
- Alte concetrazioni favorisocno l'appaiamento aspeficifico dei primer.
dNTPs
- concentrazione finale 200uM: inibiscono la reazione e fermano la PCR.
Primers
- Concentrazione 0,4 µM: la risospensione è a concentrazione più elevata chiamata madre per poi diluire di nuovo
Templato
- DNA plasmidico: piccole quantità.
- DNA genomico: da 250ng a 1µg
Taq DNA Polimerasi
-
0,5 a 1U/2,5U per reazione: fornita come 5U/μLle poi deve essere calcolata facendo la proporzione.
-
Alestire il tutto in ghiaccio perchè il genomico e i primer tenderanno a ibridarsi.
TAQ POLIMERASI
- Alcune caratteristiche della Taq polimerasi:
- Processività :Può allungaree 1000 bp al minutoalcune Taq presentano attività di proofreading ovvero attività esonucleasica.
- Se si vuole procedere per un clonaggio si usa la taq proofreading per la correzion degli errori che si producono durante i cicli.
- Erroore: 1 ogni 9000 bp.
- A tailing: nell'aggiunta di A al 3 senza bisogno di T complementari . Utile per clonaggi che hanno bisogno di ligazioni vettoriali con T protuding.
- Taq hot start: hanno un anticorpo complessato all'enzima nel sito attivo che viene rimosso durante al prima denaturazioneimpedendo la sua azione, prima che le condizioni ottimali di annealing siano raggiunte
Analisi dei Cicli PCR
- Vi sono 5 fasi per i cicli:
1 denaturazione iniziale(5' a 95°C)-->per separare in filamenti il DNA stampo.
2 annealing--> per l'appaiamento (60°C) per poi andare nell'estensione a 72°C.
3 la processitività è di 100pb/Sec e il tempo dipende dalla lunchezza.
4 estensione finale a 72°C. - L'operatore agisce sia sulla temperatura che sulla lunchezza dei frammenti. Può essere ottimizzata agendo sulla temperatura.
- Se la temperatura è bassa--> si favoricse l'ibridazione e i primi si legheranno più facilmente,
- temperature troppo alte--> non si legano i primi e rimangono dissociati: di conseguenza verranno amplificate regioni target.
Ulteriori Ottimizzazioni PCR
- Se si ottengono delle code(dovute all'alto contenuto di GC per aspecificita-> si diminuisce la concetrazione).
- Mglc2: se non si aumentano favoriscono la reazione altrimenti non la ottengono.
- dNTPs E Taq : possono far avviare per forzare e forzare la reazione in quanto la Tag si scassa e si finiscono i dNTPs.
Applicazioni della PRCA
- Vi sono più tecniche per la PRCA tra cui:
- MULTIPLEX PRCA
- Consente di amplificare divers regoni daun unico campione percontemporaneamente.
- Usatissima nelle genotipizzata iono.
- Nested PRCA
- Incremento sul terget di interesse a che farecon i DN di grado e anche PRCA archeologica. Permettendo una elevata gamma di specifiche e aumentandoanchei numeri di scopi.
- Tauchdawn PRCA
- Strategia per identificare il tau che funziona inun numero di cicli.
- Nel P.R.C e se si vuole togliere gli esecificici , con temperature che siano alte che sono -10 al'altrariuscendo ad ottenere P.R.C sempre più specifiche ottenendo sol oil targeted di interesse.
PCR inversa
- Ha l'obbiettivo di determinarsi sulle sequenza fiancheggiante di una squenza: con Primer , versi l'esterno che verso gli interno della sequenza note.Supponiamo l'esistenza di colmi clona Bac che a un gene d i interesse che nono sappiano cosa sia trovi vicinio a quello che sappiamo.
- Poi la Squenza e viene fatta con i prumer e poi se posso sequenziare da cosa do duplice la sequenza flange.
ALLELE specifica PRCA
- Effettuata la squenza è posso capire se una persona unaallele un allele malate creasando primer legino l'allele e questo è uno strumento di diagnostico e mutazioni punt formiti non di più
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Description
Appunti sulla reazione PCR, incluse le diluizioni del buffer, l'importanza dell'assenza del loading buffer per il clonaggio e l'effetto della concentrazione di MgCl₂. Inoltre, viene descritta la concentrazione ottimale di dNTPs e l'uso di una soluzione madre di primers a 20 μM.
