PCR en DNA-vermeerdering

Choose a study mode

Play Quiz
Study Flashcards
Spaced Repetition
Chat to Lesson

Podcast

Play an AI-generated podcast conversation about this lesson
Download our mobile app to listen on the go
Get App

Questions and Answers

Wat is de rol van het ligase-enzym in het MLPA-proces?

  • Het bindt fosfodiësterverbindingen binnen de probes.
  • Het zorgt voor de fluorescentie van de geamplificeerde probes.
  • Het verbindt de upstream- en downstreamprobes alleen als ze complementair zijn aan het target-DNA. (correct)
  • Het versnelt de hybridisatie van probes.

Welke toepassing maakt gebruik van MLPA voor kwantitatieve analyse?

  • Detectie van enkelvoudige nucleotide polymorfismen (SNP's).
  • Secuencing van DNA-strings.
  • Detectie van alle types mutaties.
  • HER2-amplificatie bij borsttumoren. (correct)

Wat gebeurt er met pieken in het elektroferogram bij heterozygote mutaties?

  • Ze zijn 1,5 keer vergroot.
  • Ze blijven onveranderd.
  • Ze worden gehalveerd. (correct)
  • Ze verdwijnen volledig.

Welke stap volgt na de hybridisatie en ligatie in het MLPA-proces?

<p>PCR-amplificatie. (D)</p> Signup and view all the answers

Wat bepaalt het aantal geligeerde probes in MLPA?

<p>De complementaire binding aan het target-DNA. (C)</p> Signup and view all the answers

Waar worden de geamplificeerde probes na PCR-amplificatie gescheiden?

<p>Via capillaire elektroforese. (C)</p> Signup and view all the answers

Wat geeft de oppervlakte onder elke piek in het elektroferogram aan?

<p>De amplificatie van de probes. (A)</p> Signup and view all the answers

Hoe verschilt een homozygoot van een heterozygoot in termen van pieken in MLPA-analyse?

<p>Homozygoten hebben geen pieken. (A)</p> Signup and view all the answers

Wat is het doel van site-specifieke mutagenese in de PCR-techniek?

<p>Om mutaties in het midden van het PCR-product te introduceren. (B)</p> Signup and view all the answers

Welke rol speelt de interne mismatch in de primers bij het PCR-proces?

<p>Het introduceert een restrictie-site in het PCR-product. (A)</p> Signup and view all the answers

Wat is het resultaat van het gebruik van het HindIII-restrictie-enzym op het PCR-product?

<p>Het leidt tot verschillende fragmentlengtes afhankelijk van de genotypen. (C)</p> Signup and view all the answers

Wat karakteriseert een heterozygoot resultaat in een PCR-digestiereactie met HindIII?

<p>Er verschijnen zowel fragmenten van 406 bp als 383 bp. (C)</p> Signup and view all the answers

Hoe maakt het ARMS-systeem gebruik van primers met een 3'-mismatch?

<p>Ze verhinderen de verlenging door het DNA-polymerase. (A)</p> Signup and view all the answers

Wat is een belangrijke toepassing van de PCR-techniek in genetisch onderzoek?

<p>Het identificeren van specifieke genotypen. (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is de rol van de sense primer in het PCR-proces voor factor V-mutaties?

<p>Het is ongeveer 500 bp stroomopwaarts van de mutatie. (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is het belangrijkste voordeel van het gebruik van het ARMS-systeem?

<p>Het maakt het mogelijk om specifieke mutaties te onderscheiden. (C)</p> Signup and view all the answers

Wat is het doel van multiplex PCR in diagnostische tests?

<p>Het bepalen of een T-lymfocytenpopulatie monoclonaal of polyclonaal is. (A)</p> Signup and view all the answers

Welke van de volgende stellingen over monoclonale populaties is waar?

<p>Ze resulteren in een enkele scherpe piek tijdens capillaire elektroforese. (A)</p> Signup and view all the answers

Wat is het belangrijkste voordeel van Nested PCR?

<p>Het verhoogt de gevoeligheid en specificiteit van de PCR. (A)</p> Signup and view all the answers

Welke factoren beïnvloeden de resultaten van capillaire elektroforese in het geval van polyclonale populaties?

<p>De diversiteit aan amplicons en hun lengtes. (D)</p> Signup and view all the answers

Wat is de rol van primers in de tweede ronde van een Nested PCR?

<p>Ze flankeren de primers van de eerste ronde. (C)</p> Signup and view all the answers

Wat is een kenmerk van de Gauss-curve die voortkomt uit capillaire elektroforese bij analyse van amplicons?

<p>Het weerspiegelt een regelmatige verdeling van amplicons op basis van lengte. (B)</p> Signup and view all the answers

Wat is een belangrijke toepassing van MLPA-technieken?

<p>Detectie van chromosomale afwijkingen. (A)</p> Signup and view all the answers

Wat gebeurt er tijdens de eerste ronde van de Nested PCR?

<p>Een klassieke PCR wordt uitgevoerd met een primerpaar gericht op een breed doelwit. (B)</p> Signup and view all the answers

Flashcards

MLPA

Een techniek die meerdere targetsequenties kan detecteren in één PCR-reactie via probe-amplificatie.

Halfprobes

De probes die hybridiseren met target-DNA en elkaar vervolgens verbinden.

Hybridisatie

Het proces waarbij de halfprobes zich binden aan het target-DNA.

Ligatie

Het verbinden van de upstream- en downstreamprobe door een enzym.

Signup and view all the flashcards

PCR-amplificatie

Vermeerderen van de geligeerde probes voor analyse. Gebruikmakend van een primerpaar (een).

Signup and view all the flashcards

Capillaire elektroforese

Scheiding van de geamplificeerde probes op basis van lengte.

Signup and view all the flashcards

Kwantitatieve analyse

Bepaalt het aantal geligeerde probes, gerelateerd aan de hoeveelheid target-DNA.

Signup and view all the flashcards

Elektroferogram

Een grafische weergave van de gescheiden probes.

Signup and view all the flashcards

Site-specifieke mutagenese

Een methode om mutaties in een specifiek deel van een DNA-sequentie in te brengen.

Signup and view all the flashcards

Heteroduplex-structuur

Een DNA-molecuul gevormd door het mengen van twee verschillende DNA-strengen.

Signup and view all the flashcards

Primer 1M/2M

Primers waarmee een specifieke mutatie in een PCR-reactie wordt ingebracht.

Signup and view all the flashcards

ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

Een techniek om wild-type en mutant DNA te onderscheiden door gebruik te maken van primers met 3'-mismatch.

Signup and view all the flashcards

Mismatched primers

Primers die een mismatch in de sequentie bevatten met het doel-DNA.

Signup and view all the flashcards

PCR-protocol

Een specifieke reeks stappen voor PCR, vaak met een specifiek doel, zoals het onderscheiden van wild-type en mutant DNA.

Signup and view all the flashcards

HindIII restrictie-site

Een specifiek stukje DNA dat herkend wordt door het restrictie-enzym HindIII.

Signup and view all the flashcards

Homozygoot wild-type/mutatie

Bevat respectievelijk twee wild-type/twee mutante allelen, een set genen.

Signup and view all the flashcards

Monoclonale T-lymfocytenpopulatie

Een T-lymfocytenpopulatie met een identieke reorganisatie van TCR-genen, resulterend in een enkele, sterke PCR-product-piek op capillaire elektroforese.

Signup and view all the flashcards

Multiplex PCR

Een techniek die tegelijkertijd meerdere DNA-sequenties kan amplificeren.

Signup and view all the flashcards

Polyclonale T-lymfocytenpopulatie

Een mengsel van verschillende T-lymfocyten met verschillende TCR-gen-reorganisaties, die op capillaire elektroforese diverse amplicons vertoont.

Signup and view all the flashcards

Nested PCR

Een tweestaps PCR-techniek om de gevoeligheid en specificiteit te vergroten door gebruik te maken van twee primerparen. De tweede ronde is gericht op een specifiek fragment binnen het product van de eerste ronde.

Signup and view all the flashcards

Eerste PCR-ronde (traditonele PCR)

De eerste ronde in Nested PCR; met een breder primerpaar, resulterend in een ruw PCR-product.

Signup and view all the flashcards

Tweede PCR-ronde (Nested PCR)

De tweede ronde in Nested PCR, met primers die gericht zijn op een klein, specifiek fragment binnen het product van de eerste ronde.

Signup and view all the flashcards

Amplicon

Een vermenigvuldigd DNA-fragment dat deels overeenkomt met de DNA-primer-sequentie.

Signup and view all the flashcards

Study Notes

PCR (Polymerase Chain Reaction)

  • PCR is een methode om DNA-sequenties exponentieel te kopiëren.
  • Ontwikkeld in 1983 door Mullis.
  • Doel was aanvankelijk dNTP's verwijderen uit een monster, ontdekte dat DNA-kopieën exponentieel vermeerderd werden.
  • Proces bestaat uit cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie.

Denaturatie en temperatuur

  • Denaturatiestap: Temperatuur verhoogd naar 94°C om dubbelstrengs DNA (dsDNA) te smelten naar enkelstrengs DNA (ssDNA).
  • Taq-polymerase (thermostabiel enzym): Introductie in 1988, loste probleem van DNA-polymerases die bij hoge temperaturen denatureren, vereenvoudigde techniek.

PCR-proces

  • Denaturatie: Temperatuur verhoogd tot 94°C om dsDNA te splitsen in ssDNA.
  • Annealing: Primers binden (annealen) aan specifieke DNA-strengen (sense/forward primer en antisense/reverse primer). Optimale temperatuur hangt af van primer lengte en samenstelling.
  • Verlenging: DNA-polymerase verlengt de primers van 5' naar 3'. Optimale temperatuur voor Taq-polymerase is 72°C. Langere DNA-fragmenten hebben een langere verlengingsfase.

Taq-polymerase

  • Afkomstig van de thermofiele bacterie Thermus aquaticus.
  • Thermostabiel, werkt optimaal bij 72°C.
  • Polymerasesnelheid: 1-2 kb per minuut bij optimale temperatuur.
  • Geen proofreading-activiteit: ongeveer 1 fout per 9.000 nucleotiden.
  • Kan 3' A-overhangs creëeren als templatebereikt.

Pfu-polymerase

  • Afkomstig van Pyrococcus furiosus.
  • Proofreading-activiteit: 1 fout per ongeveer 1.300.000 nucleotiden.
  • Trager dan Taq: 0,5-1 kb per minuut.
  • Geen 3' A-overhangs.

Primer Keuze

  • Primers hybridiseren (binden) aan complementaire DNA-strengen, polymerase verlengt aan 3' uiteinden.
  • Sequencing-info is benodigd voor primers.
  • Optimum lengte: 17-30 nucleotiden.
  • Optimum GC-gehalte: 50-60%.
  • Annealing temperatuur: ongeveer 5°C lager dan smelttemperatuur (Tm) van primers.
  • Herhaling van sequenties en gelijke sequenties vermijden.

Hot Start Polymerasesystemen

  • Voorkomt aspecifieke priming bij lage temperatuur.
  • Proces gebeurt bij hoge temperatuur.
  • De temperatuur van de polymerase activatie dient vooraf te worden geregeld.

Inhibitoren in PCR

  • Verbindingen die het PCR-proces verstoren, beperkend of voorkombend.
  • Oorzaken: staalcomponenten, zoals hemoglobin, galzouten, ureum, en polysachariden.
  • Oplossingen: extra reiniging, verdunning van het staal, additionele hulpstoffen (zoals BSA) of sterkere polymerases.

Contaminatie

  • PCR is gevoelig voor contaminatie.
  • Preventie: gescheiden ruimtes, decontaminatiemethoden (zoals UV-licht).

Controles in PCR

  • Positieve controle: dient altijd positief te zijn , tenzij inhibitoren aanwezig zijn.
  • Negatieve controle: moet altijd negatief zijn, tenzij er sprake is van contaminatie.

Specificaties voor PCR

  • Grootte van amplicon: kortere fragmenten zijn efficiënter. (klassieke PCR 200-1500bp, qPCR 50-150bp)
  • Analyse van PCR-producten: lengteanalyse (Agarosegel elektroforese) en sequencing.

Nested PCR

  • Twee opeenvolgende PCR-reacties met verschillende primerparen.
  • Verhoogt gevoeligheid en specificiteit.
  • Gebruikt bij lage DNA hoeveelheden, complexe samples, hoge specificiteit nodig .

Multiplex PCR

  • Meerdere primers in één reactie voor amplificatie van meerdere targetsequenties tegelijkertijd
  • Toepassing: klonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocyten.
  • Monoclonale populaties: één dominante piek
  • Polyclonale populaties: verscheidenheid aan PCR-productlengtes (Gauss-curve)

MLPA

  • Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
  • Amplificatie van meerdere fragmenten tegelijkertijd, gevolgd door capillaire elektroforese.
  • Identificatie en kwantificatie van targets (zoals numerieke veranderingen).

Studying That Suits You

Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.

Quiz Team

Related Documents

PCR PDF

More Like This

Use Quizgecko on...
Browser
Open
Browser
Browser