Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Unidad 7: Técnicas de PCR

• La unidad se centra en las técnicas de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), detallando sus fundamentos teóricos, modalidades estándar, otras técnicas derivadas, y la PCR a tiempo real.

1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

• Es una técnica in vitro para amplificar ADN, generando millones de copias idénticas a partir de una mínima cantidad de ADN molde.
• Originalmente para amplificar un único fragmento corto de ADN, ahora permite amplificar fragmentos grandes (hasta 35 kb) y tiene variantes para:
  • Amplificar varios fragmentos en una reacción (PCR múltiple).
  • Amplificar ARN (RT-PCR).
  • Cuantificar la concentración de un ácido nucleico (PCR cuantitativa o a tiempo real).
• Las técnicas de PCR y sus variantes son rápidas y automatizadas comparadas con la clonación en vectores.
• Requiere menos cantidad de muestra que la hibridación y permite cuantificar secuencias concretas mediante PCR en tiempo real.
• Es una técnica básica en laboratorios de biología molecular debido a su capacidad para obtener altos niveles de amplificación rápidamente y su alta sensibilidad.
• Tiene aplicaciones innumerables en biología, medicina y paleontología, incluyendo:
  • Diagnóstico y pronóstico de enfermedades.
  • Estudios de evolución y respuesta a tratamientos.
  • Estudios de expresión génica.
  • Mutagénesis y estudios filogenéticos.
  • Genotipado y medicina forense.

2. Bases Teóricas de la PCR

• La PCR es un proceso enzimático impulsado por una ADN polimerasa, basado en la replicación del ADN.
• Kary Mullis ideó la técnica en 1983, basándose en repetir secuencialmente ciclos de replicación in vitro para obtener múltiples copias de una molécula de ADN molde.
• La amplificación es posible gracias a que las nuevas copias sirven como moldes en ciclos sucesivos, produciendo un aumento exponencial de las copias en cada ciclo.
• La principal ventaja es su sensibilidad, pero la contaminación es un riesgo (por material no amplificado o amplificado anteriormente).

2.1 Cebadores o Primers

• Son oligonucleótidos monocatenarios complementarios a las regiones que flanquean el fragmento a amplificar.
• Imprescindible diseñar cebadores específicos que permitan aislar y amplificar exclusivamente la región de interés.
• ADN polimerasa termoestable evita la inactivación de la enzima a temperaturas elevadas.
• Se diseñan siempre por parejas, complementarios a secuencias adyacentes en extremos opuestos de la región de interés.
• El cebador que se une a la hebra molde en dirección 3'→5' se llama cebador F (forward).
• El cebador que se une a la hebra molde en dirección 5'→3' se denomina cebador R (reverse).
• Proveen una región de doble hélice a la que se une la ADN polimerasa para incorporar nucleótidos complementarios.
• Definen y delimitan la región diana a amplificar, asegurando la especificidad de la reacción.
• La secuencia de los cebadores debe ser única en el ADN a estudiar.
• Para el diseño ideal de los cebadores, hay que tener en cuenta:
  • Longitud: Entre 18 y 30 bases; mínimo 16 bases para especificidad.
  • Cebadores con menos de 15 bases carecen de especificidad.
  • Usar cebadores de hasta 40-50 bases para aplicaciones concretas.
  • Composición de bases: Contenido G+C entre 40% y 60%, con distribución equilibrada de dominios ricos en A/T y G/C.
  • Secuencia: No deben contener secuencias complementarias intra- o intermoleculares para evitar estructuras secundarias u homodimerización.
  • Es primordial evitar la formación de estructuras díméricas bloqueantes en el extremo 3'.
  • Temperatura de fusión (Tm): Idealmente entre 52-65ºC, con una diferencia menor a 5ºC entre los cebadores de una pareja para una unión eficaz al ADN molde.

2.2 ADN Polimerasas Termoestables

• ADN polimerasa termoestable permite la replicación a temperaturas elevadas.
• Es necesario que el molde de ADN sea monocatenario para la actividad de la ADN plimerasa.
• La necesidad de desnaturalización por calor supone un problema para las ADN polimerasas convencionales, inactivándose a altas temperaturas.
• En los primeros experimentos se debía añadir nueva enzima en cada ciclo.
• Caracteristicas de la ADN polimerasa termoestable:
  • Aisladas de arqueobacterias extremófilas (termófilas), con actividad a temperaturas elevadas.
  • Catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5'→3' a partir de una región con doble hélice y en presencia de iones magnesio (Mg2+).
  • Actividad polimerasa óptima entre 70 ºC y 75 ºC, permitiendo la hibridación de los cebadores a altas temperaturas para maximizar la especificidad.
  • Mantiene su actividad tras tiempos prolongados a 95 ºC.
• Tipos de ADN polimerasas termoestables: - Con actividad exonucleasa 5'→3' sin actividad exonucleasa 3'→5' (no corrige errores). - Con actividad exonucleasa 5'→3' y 3'→5' (corrige errores). - Con actividad transcriptasa inversa (usa ARN como molde en presencia de iones manganeso (Mn2+)).

2.3 El Ciclo Básico de una PCR

• La PCR consta de la repetición secuencial de ciclos de replicación.
• Cada ciclo tiene tres fases:
  • Desnaturalización del ADN molde.
  • Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
  • Extensión de los cebadores.

Fase I: Desnaturalización

• Debe ser larga e una temperatura alta para asegurar el desdoblamiento completo del ADN molde.
• Se realiza normalmente a 94-95 ºC durante 15-30 segundos.

Fase II: Hibridación

• La hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing) se realiza a 50-65 ºC.
• Se depende de la Tm de los cebadores y su rango Tm + 5ºC.
• Temperaturas elevadas se relaciona con una mayor especificidad
• Temperaturas bajas se relaciona con que puede aparecer productos no deseados
• El tiempo estándar es de 30-60 segundos.

Fase III: Extensión

• La ADN polimerasa copia la hebra molde a la temperatura óptima.
• El tiempo se condiciona por la velocidad y por la longitud del fragmento.
• Un tiempo prolongado se relaciona con enzimas de actividad correctora.

2.4 Productos de Amplificación de la PCR

• Tras n repeticiones: varios productos de amplificación, deseados y no deseados.
• Productos del primer ciclo de PCR: productos no deseados y 0 deseados.
• Productos del segundo ciclo de PCR: 4 productos deseados y 0 deseados.
• Productos del tercer ciclo de PCR: 6 productos deseados y 2 amplicones.
• Productos del cuarto ciclo de PCR: 8 productos deseados y 8 amplicones.
• En cada ciclo, el numero de productos no deseados aumenta aritméticamente (2n), y el número de amplicones incrementa exponencialmente (2n-2n). Pero debe obtener millones de copias.

3. PCR Estándar o Convencional

• La forma más simple en la que se amplifica un fragmento de ADN, con un único par de cebadores y un único proceso de amplificación a tiempo final.
• Su funcionamiento se basa en:
  • La composición de la mezcla de reacción.
  • La preparación de la mezcla.
  • La programación del termociclador.
  • El análisis de los productos de la reacción.

3.1 La Mezcla de Reacción

• La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios, consiste en un tampón adecuado y su composición:
  • Cloruro magnésico: Importante los iones de magnesio (Mg2+) como cofactor.
  • Desoxinucleótidos trifosfato: Que compone las molécules de ADN. Son 4 desoxinucleótidos.
  • ADN polimerasa: Es otro factor clave.
  • ADN Molde: Es un componente imprescindible.
  • Cebadores: Son factores importantes.
• Otros Aditivos y Potenciadores:
  • Para cuando el rendimiento es bajo o cuando los productos son amplificados.
  • Problemas con contaminantes y con la naturaleza del ADN molde.

3.2 Preparación de las Muestras

• Se requiere ajustar el volúmen de reacción, elaborar la mezcla master (master mix) y establecer controles positivos y negativos.
  • Ajuste del volumen de reacción:
    • Importante decidir el volúmen final, suele ser 25 o 50 ul.
    • Calcular los volúmenes de cada reactivo dependiendo su concentración.
    • Completar con agua especial PCR.
  • Mezcla master (master mix)
    • Las reacciones de PCR se realizan en volúmenes pequeños.
    • Posibilidad de errores.
    • Recomendable preparar mezcla master con todos los componentes.
    • Se debe tener en cuenta el número de muestras a incluir, incluyendo los controles posibles.
  • Control positivo y control negativo:
    • Los tubos deben llevar controles para ver la reacción.
    • Control de la técnica: Es tubo master mix y ADN molde.
    • Control blanco: tubo master mix y se sustitue el ADN molde.

3.3 Programación del Termocicladoor

• El termociclador es el aparato para realizar la PCR
• Permite programar los ciclos con temperatura y tiempo de incubación
• La programación tiene 3 etapas:
  • Desnaturalización inicial:
    • Es la que inicia la reacción. Se calienta la mezcla de reacción a 94 -95 °C
  • Ciclos de replicación:
    • Las temperaturas y los tiempos de incubación de cada fase (desnaturalización, hibridación, y extensión).
    • El número de ciclos que es va a repetir.
    • Este número es dependiente del número inicial de copias que hay en el fragmente.
    • Su número suele estar entre los 24 y los 40.
  • Extensión final:
    • Etapa que finaliza la reacción de PCR
    • Para una óptima incubación de la ADN polimerasa
    • Se finaliza con una incubación de 4°C.

3.4 Análisis de los Productos Amplificados

• Se recuperan las muestras ampliadas del temociclador y se analizan el resultado
• Se usa la electroforesis en gel de agarosa.
• Para la detección es necesaria una única banda.
• Observación de varios productos es un producto fallido.
• Resultado positivo:
  • Con una banda específica es suficiente
  • La secuencia diana está presente.
  • En caso de falso negativo es necesario realizar controles en blanvo/negativo o saber si ha havido contaminación en los reactivos.
• Resultado negativo:
  • Está la indica muestra problema
  • Es resultado negativo porque no hay reactivo o inhibiores de PCL.
  • En caso de que todos los reactivos funcionen bien, el control postivo observará la banda específica.

4. Modalidades de la PCR Estándar

• Ampliación de secuencias de 3.5 kb
• Diagnósticos.
• Se intento minimizar generación de productos no deseado, adaptando la PCR:
  • PCR con inicio caliente.
  • PCR de grandes fragmentos.
  • PCR de alta fidelidad.

4.1 PCR con Inicio en Caliente (Hot Start PCR)

• En el período de preparación se puede generar productos no deseados.
• Para evitar la aparación de productos utilizar PCR con inicio caliente/ Hot Star PCR
• La mezcla de reacción sin ADN polimerasa.
• Añadir la ADN polimerasa cuando la temperatura esté por encima de 65 °C.
• Aislando la ADN polimerasa del resto del resto de los componentes y por el interior de una esfera de cera.
• Suministrado la ADN polimerasa inactiva bloqueándonla con un anticuerpo especifico/ bloqueante termolábil.

4.2 PCR De Grandes Fragmentos

• Reduce drásticamente ampliaciones mayoreas de 5kb.
• PCR es variable para aumetnar el rnedimeinto de entre 5 y 35 kb.
• Diseño PCR se relaciona con la programación de composición de la mezcla.
• Se debe tener en cuenta una mezcla de don ADN polimerasas con una actividad correctora, aditivos, y baja concentración de tampones.
• La programación del termociclador tiene: - Aumentar el tiempo de extensión en cada ciclo (25 minutos) - Acortar los tiempos de desnaturalización (2-10 segundos)

4.3 PCR de Alta Fidelidad

• Evita la generación de mutaciones por la mala incoración de nuclétidos.
• Se relaciona con le uso de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora.
• Y a favorercer la condición óptima mayor de fidelidad ajustando el PH y la concentración de Mg+2.

5. Otras Técnicas de PCR

• Permite una especificidad de aplicaciones - PCR anidada (Nested- PCR) - La PCR múltiple (Multiplex PCR) - La PCR con transcripción inversa (Reverse Trasncription-PCR)

5.1 PCR Anidada (Nested-PCR)

• Consisnte de 2 reacciones acopladas:
  • 1ra PCR para ADN molde
  • 2da PCR para amplificar productos de la primera.
• Se usan 2 pareja de cebadores: Externos e interno al principio, y internos al final.
• Se usa para aumentar o sensibilidad en los resultados.

5.4 PCR con Transcripción Inversa (RT-PCR)

• Permite aplificar y analizar moléculas de ARNm
• Dado que que la ADN plimerasa usa ADN como molde, se usa una retrotranscriptasa (RT).
• Y la ADN plimerasa lo amplia con la ARNm como molde.
• Esto dos pasos se relaciona en 2 tubos independientes o en 1 mismo tubo.

6. PCR a Tiempo Real

• Estándares, iguales que todos los tipos PCR, reacciones a punto final.
• El resultado se analiza mediante electroforesis.
• Se monitroiza el proceso de amplificación, y la detección de los amplicones se raliza ciclo a ciclo.
  • Se raliza un temoclizador a tiempo real
• Ventajas:
  • Mayor rapidez cualitativa de secuencias de ADN, y sus resultados antes de finalizar la PCR.
  • Resultados más fieles, por la desrección istruccional que la disolución del ADN en electroforesis - Mininiza problemas de continación en tubo cerado
• A traves de la intensidad de la fosforescencia es proporcianal al ADN sintetado,. el que permite su cuantificación, tanto sea produicida como el ADN diama inicial.

6.1 Aplicaciones de la PCR a Tiempo Real

• Las aplicaciones más importantes de la PCR a tiempo real son la PCR cuantitativa a tiempo real y la detección de mutaciones mediante curvas de fusión.
  • PCR cuantitativa a tiempo real(qPCR)
    • Una aplicación permite cuantificar el cantidad íncial de moleculas, cuantificando la expresión genética.
      • Cuantificanción absoluta: En unidades y concentración
      • Cuantifacación relativa: Dependienta de los factores constantes
• Curvas de fusión y detección de mutaciones:
  • Detección mutaciones mediante curvas de fusión.
    • Tres tipos 2: - Un punto de fusión - Un con pico menor - Un con 2 picos

Este cuestionario explora los principios de la PCR, incluyendo la dirección de la catálisis de la ADN polimerasa, los iones necesarios y las temperaturas óptimas. También cubre la actividad exonucleasa, la síntesis de ADNc y las fases de un ciclo de PCR.