Microscopía Electrónica: Preparación de Muestras

Biología Celular: Bloque 1, Introducción

• La biología celular es el estudio de la célula y su investigación.
• El bloque 1 se centra en la visión global de la célula y las herramientas para investigarla.

Guion de la Unidad Didáctica 1

• Origen y evolución de las células
• Organismos como modelos experimentales
• Instrumentos de la Biología Celular
• Unidades de medida y dimensiones de las células y de sus componentes

Contenidos

• Teoría celular
• Microscopía
• Técnicas inmunohistoquímicas
• Citometría de flujo
• Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial

Teoría Celular

• Los seres vivos están constituidos por células.
• Robert Hooke acuñó el término "célula" al observar paredes celulares vegetales muertas en corcho en 1665.
• Antonie van Leeuwenhoek realizó la primera descripción de células vivas en 1674, descubriendo protozoarios y bacterias.
• Matthias Schleiden, Theodor Schwann y Rudolf Virchow postularon que la célula es la unidad anatómica, trófica y genética de los seres vivos entre 1835 y 1855.
• Es difícil estudiar las células en un organismo vivo.
• El cultivo celular, que implica aislar y mantener células en laboratorio, ofrece ventajas para la investigación.
• Las células cultivadas permiten un mejor control de las condiciones experimentales.
• Una sola célula puede crecer en una colonia de células idénticas, llamada clon.

Microscopía

• El microscopio es esencial para el conocimiento y análisis de las células.
• Tipos de microscopía:
  • Microscopio Óptico
  • Microscopio Electrónico de Transmisión
  • Microscopio Electrónico de Barrido -El adecuado procesamiento de la muestra es clave

Microscopía Óptica Convencional

• El microscopio óptico convencional tiene un sistema mecánico (base, columna, platina, tubo), óptico (objetivo y ocular) y de iluminación (foco, condensador, diafragma).
• El microscopio óptico convencional tiene aumentos de hasta 1500 veces, mientras que el electrónico alcanza 150.000-200.000 veces.
• Sistemas de contraste como tinciones y técnicas especiales, junto con sistemas ópticos especiales, permiten distinguir estructuras celulares y tejidos.

Aumentos, Poder de Resolución y Límite de Resolución

• El poder de resolución es la capacidad de un microscopio para distinguir dos puntos muy cercanos como separados
• El límite de resolución (LR) es la distancia mínima necesaria entre dos puntos para distinguirlos como independientes
• Ejemplos de LR: ojo humano (0,1 mm), microscopio óptico (0,2 µm), microscopio electrónico de transmisión (10-20 Å).

Obtención de Contraste

• El contraste es la propiedad que permite distinguir estructuras celulares por diferencia de color o brillo.
• Para obtener contraste se utilizan: Variaciones de la λ que atraviesa distintas estructuras celulares. Colorantes (hematoxilina y eosina): hematoxilina tiñe los núcleos de azul y eosina el citoplasma de rosa. Variaciones en la amplitud de onda mediante sistemas ópticos que producen diferencias de brillo.

Microscopio de Contraste de Fases

• Aprovecha las diferencias de los índices de refracción en la célula y el tejido.
• La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción sufre deflexión y queda fuera de fase.
• Anula la amplitud de la porción fuera de fase del haz de luz para producir un contraste útil.
• Las partes oscuras de la imagen corresponden a porciones densas; las claras, a porciones menos densas.
• Los colorantes utilizados en microscopios convencionales son no vitales, pero los microscopios de contraste de fases permiten estudios in vivo

Microscopio de Fluorescencia

• Se basa en la propiedad de sustancias fluorescentes de absorber luz de una λ determinada y emitir luz con otra λ.
• Permite ver estructuras marcadas selectivamente con sustancias fluorescentes (fluorocromos).
• Se pueden usar colorantes como naranja de acridina (tiñe selectivamente el núcleo) o anticuerpos conjugados con fluorocromos.
• Los microscopios de fluorescencia usan filtros para seleccionar la λ de excitación del fluorocromo.
• Tras la excitación del fluorocromo, se emite luz fluorescente a una λ específica.
• La fluoresceína, un fluorocromo común, se excita a 494 nm (azul) y emite a 521 nm (verde).fluorocromo.

Fundamentos de la Fluorescencia

• La fluorescencia se describe en términos de excitación y emisión.
• Un fluorocromo es excitado al absorber fotones de luz, y luego emite fotones con menos energía a una longitud de onda mayor.
• La diferencia entre estas longitudes de onda es el desplazamiento de Stokes.
• Desplazamientos de Stokes más grandes son generalmente más deseables para la investigación fluorescente, ya que la luz emitida se puede distinguir fácilmente de la fuente de luz excitadora.

Microscopio Confocal

• Utiliza un rayo láser como fuente de iluminación.
• Permite una focalización muy precisa eliminando señales de interferencia.
• El láser pasa por un pinhole que permite focalizar el rayo en el punto concreto de la muestra.
• Tras la excitación, la luz fluorescente emitida se filtra a través de otro pinhole.
• Poseé un sistema de barrido, capaz de desplazar el rayo láser por la preparación en las tres dimensiones del espacio, iluminando puntos específicos de la misma a distintos tiempos.
• Como el láser tiene más penetración que la luz visible, los tejidos pueden ser más gruesos Cada imagen corresponde a un plano de fluorescencia, llamado z-stack.
• Los stacks se integran con softwares específicos para reconstrucción tridimensional.
• Programas eliminan señales de interferencia derivadas del uso de fluorocromos.
• Se pueden realizar estudios cuantitativos de las estructuras analizadas y el uso del láser.

Microscopio Electrónico

• Utiliza un haz de electrones acelerado como fuente de ‘iluminación', mejorando el poder de resolución.
• Permite la observación de orgánulos celulares.

Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)

• Consiste en un tubo de rayos catódicos de aproximadamente 1 m de longitud.
• Un filamento de tungsteno (cátodo) emite un haz de electrones hacia un ánodo perforado.
• Una bobina electromagnética actúa como condensador, focalizando los electrones hacia la muestra.
• La muestra se sitúa en una rejilla de cobre o níquel de unos 3 mm.
• Bobinas actúan como objetivo y sistema de proyección.
• Radicación electrónica a imagen visible por pantalla fluorescente en la base.
• Requiere un sistema de bombas para generar vacío.
• Impide la estudios in vivo.
• Para que el haz de electrones atraviese la muestra, esta ha de tener un espesor muy fino (10-100 nm).
• el contraste se consigue por absorción diferencial de metales pesados (citrato de plomo y acetato de uranio).
• Las zonas oscuras en la pantalla (zonas electrodensas) impiden el paso de electrones.
• Las zonas claras permiten un mayor paso de electrones (zonas electrolúcidas).

Microscopio Electrónico de Barrido (MEB)

• Se utiliza para ver superficies de tejidos y células a gran aumento y resolución.
• Las muestras se sitúan en la base del microscopio, son metalizadas.
• Tras el barrido dan una imagen tridimensional.
• El aspecto de visualización es metalizado y tridimensional.

Procesamiento de Muestras

• El procesamiento histológico consta de fijación, inclusión, microtomía (corte) y tinción.

Fijación

• Detiene los procesos de degradación y preserva estructuras y componentes celulares.
• Métodos físicos: criofijación o congelación a temperaturas inferiores a -70 ºC.
• Este es un método reversible que puede generar cristales de hielo.
• Se usan sustancias protectoras como sacarosa o glicerol.
• Fijación muy rápida, útil para biopsias urgentes.
• Métodos químicos: usan sustancias que interaccionan con las macromoléculas celulares.
• Tres tipos de fijadores: agentes entrecruzantes, oxidantes y precipitantes.
  • Agentes entrecruzantes: formaldehido (microscopía óptica), glutaraldehido y tetróxido de osmio (ME).

Inclusión

• Eliminar el agua mediante deshidratación con etanol y reemplazarla por un medio que solidifica.
• Posibilita la obtención de cortes finos.
• Se utiliza parafina (microscopía óptica) y resinas (ME).
• Parafina: mezcla de ceras compuesta por hidrocarburos de cadena larga con un punto de fusión de 50ºC
• Resina: son más duras que la parafina por lo que permiten realizar cortes más finos. Son sustancias líquidas en forma monomérica, y polimerizan tras tratamiento con calor o luz UV.

Microtomía

• Los cortes histológicos se hacen en un microtomo (MO) o ultramicrotomo (ME).
• Cortes de muestras fijadas por congelación se realizan en un criostato a -20 ºC, sin deshidratación.
• Algunas muestras no requieren fijación ni corte, como frotis de sangre o fluidos biológicos.

Tinción

• En MO se emplean colorantes con afinidad por orgánulos.
• Ejs: hematoxilina-eosina (diagnóstico anatomopatológico), Papanicolau (citologías exfoliativas), tinción argéntica (sistema nervioso).
• En ME el contraste se realiza mediante moléculas de alto peso molecular (acetato de uranio y citrato de plomo).

Técnicas Inmunohistoquímicas

• Identificación de una proteína concreta en tejido mediante anticuerpos específicos.
• La inmunohistoquímica es esencial en anatomía patológica para el diagnóstico de enfermedades.
• Técnicas pueden ser directas o indirectas.
• Directas: anticuerpo primario está conjugado a sustancia detectable al microscopio.
• Indirectas: anticuerpo primario no está conjugado, se utiliza un anticuerpo secundario.
• Fracción Fc de una especie determinada, permite usar un mismo anticuerpo para muchos anticuerpos primarios.

Marcaje indirecto con peroxidasa

• La técnica más utilizada para diagnóstico con anticuerpos secundarios unidos a peroxidasa.
• La peroxidasa se revela añadiendo un sustrato (H2O2) y un donador de electrones (diaminobencidina, DAB).
• La peroxidasa reduce el H2O2, oxida la DAB y forma un precipitado marrón en el punto de unión del anticuerpo.

Esquema de reacción inmunohistoquímica

1. Desparafinación e hidratación de los tejidos (xilol, baños en alcohol).
2. Incubación de la preparación con el anticuerpo primario.
3. Lavado para eliminar el exceso de inmunoglobulinas.
4. Incubación con el anticuerpo secundario conjugado a la peroxidasa.
5. Lavado para eliminar el exceso de anticuerpo secundario.
6. Revelado de la actividad enzimática de la peroxidasa.
7. Observación.

• Utilización dde sustancias fluorescentes en su región Fc (inmunofluorescencia).
• En este caso no se requieren reacciones enzimáticas. se lleva a cabo con un microscopio de fluorescencia y la señal se pierde progresivamente.

Citometría de Flujo

• Técnica de análisis del número, tamaño y forma de una suspensión celular.
• También sirve para cuantificar el número de células de determinadas poblaciones celulares marcadas
• También sirve para aislar diferentes poblaciones celulares (útil para estudiar células sanguíneas y en médula ósea).

Componentes del Citómetro y Funcionamiento

• Sistema fluídico de transporte de muestras.
• Sistema óptico de iluminación de las partículas mediante láser (argón).
• Detector electrónico, que convierte la luz en señal digital.
• Las células pasan en un capilar muy fino de forma que pasan de una en una.
• El rayo impacta sobre las células, produciendo una distorsión registrada por el detector.
• El sistema cuantifica el número de células, la forma y la complejidad interna de la célula.
• El grado de grado de alteración que dan las células que atraviesa el láser da a lugar a una dispersión relacionada con el tamaño de la célula, la dispersión frontal (FSC) y la complejidad interna lateral u ortogonal (SSC)
• Para caracterizar patologías es otra posibilidad marcar una población celular específicamente con un fluorocromo.
• El isotiocianoato de fluoresceína (FITC), que absorbe a 490 nm y emite a 525 nm el marcaje más usado

Múltiples Marcajes

• Se pueden realizar también múltiples marcajes con anticuerpos con fluorocromos diferentes.
• Además del FITC se suelen emplear: la ficoeritrina (PE) y la aloficocinina (APC).
• Los citómetros clásicos con un solo rayo láser permiten analizar 5 parámetros a la vez: FSC, SSC y tres canales de fluorescencia.
• Los parámetros de ciclo celular: apoptosis, necrosis, mitocondrias, ADN, actividad enzimática....

Cultivo Celular

• Herramienta más utilizada en biología celular
• Células in vitro provienen de un órgano o tumor,
• Mantenimiento y almacenamiento en medios de cultivo controladas (habitualmente, 37°C, 5% CO₂ y 95 O₂)..

Cultivos Primarios

• Cultivos que derivan directamente de células, tejidos u órganos

Líneas Celulares

• Células de un cultivo primario adquieren capacidad ilimitada y son lineas puras
• Herramientas de trabajo de fácil manipulación y ofrecen una fuente homogénea e ilimitada de células fácilmente caracterizables.

Este cuestionario explora los fundamentos de la microscopía electrónica, centrándose en la preparación de muestras. Abarca la función de las sales de metales pesados, las limitaciones para el estudio in vivo y la necesidad de metalización en MEB. También destaca las diferencias entre MEB y MET.