Microscopía óptica convencional en Biología Celular PDF

BIOLOGÍA CELULAR BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN Unidad Didáctica 1. Visión global de la célula e investigación celular BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 1 Unidad Didáctica 1 Guion de la...

BIOLOGÍA CELULAR BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN Unidad Didáctica 1. Visión global de la célula e investigación celular BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 1 Unidad Didáctica 1 Guion de la Unidad Didáctica 1 1.1. Origen y evolución de las células 1.2. Organismos como modelos experimentales. 1.3. Instrumentos de la Biología Celular. 1.4. Unidades de medida y dimensiones de las células y de sus componentes. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 2 Unidad Didáctica 1  Teoría celular Microscopía Técnicas inmunohistoquímicas Citometría de flujo Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 3 Unidad Didáctica 1 Teoría celular BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 4 Unidad Didáctica 1 Los seres vivos están constituido de células Acuñó el término de célula, observando las paredes celulares de células vegetales muertas provenientes de una corteza de corcho. Robert Hooke,1665 Primera descripción de células vivas. Informa su descubrimiento de protozoarios. Observará bacterias 9 años después. Antonie van Leeuwenhoek, 1674 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 5 Unidad Didáctica 1 Los seres vivos están constituidos de células Padres de la Teoría Celular en ella se postula que la célula era: una UNIDAD ANATÓMICA (Todos los seres vivos están formados por células) una UNIDAD TRÓFICA (En cada célula se producen los procesos metabólicos propios de los seres vivos: Respiración, Fermentación, Fotosíntesis, etc.). una UNIDAD GENÉTICA (Toda célula procede de otra preexistente) 1835-1855 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 6 Unidad Didáctica 1 Consideraciones a tener en cuenta cuando queremos estudiar las células El estudio de las células en un organismo vivo entraña mucha dificultad. Una alternativa es aislar y mantener las células en laboratorio en condiciones que permitan su supervivencia y crecimiento, un procedimiento que se conoce con el término de cultivo celular. Las células cultivadas presentan varias ventajas sobre los organismos intactos para la investigación. Por ejemplo, pueden controlarse mejor las condiciones experimentales, en muchos casos, una sola célula puede crecer fácilmente en una colonia de muchas células idénticas. La cepa resultante de células, que es genéticamente homogénea, se llama un CLON. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 7 Unidad Didáctica 1 Microscopía Microscopio óptico Microscopio electrónico de transmisión Microscopio electrónico de barrido Procesamiento de muestras BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 8 Unidad Didáctica 1 Microscopía óptica convencional El microscopio es un instrumento imprescindible para el conocimiento y el análisis de las células. Aumentos: 1500 veces el microscopio óptico convencional, y unas 150.000-200.000 veces el microscopio electrónico. Sistemas de contraste: tinciones, técnicas especiales, junto con sistemas ópticos especiales permiten distinguir estructuras de células y tejidos. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 9 Unidad Didáctica 1 Coloración Hematoxilina-Eosina. Objetivo de inmersión 100X. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 10 Unidad Didáctica 1  Microscopía óptica convencional El microscopio óptico convencional está formado por tres sistemas: Mecánico: pie (base), columna (brazo), platina (portamuestras) y tubo (cabeza). Óptico: Objetivo y ocular De iluminación: foco de luz, condensador y diafragma. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 11 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Poder de resolución: capacidad que tiene un microscopio para distinguir como separados y diferentes dos puntos muy cercanos entre sí. Límite de resolución (LR): es la distancia mínima que debe haber entre dos puntos entre sí para poder ser distinguidos como independientes. Ejemplos de LR: o Ojo humano es de 0,1 mm. o Microscopio óptico convencional: 0,2 m. o Microscopio electrónico de transmisión: 10-20 Amstrons (Å) BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 12 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 13 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Óvulos de rana (ojo desnudo) BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 14 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Tejido epitelial (microscopía óptica) BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 15 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Ribosoma Maquinaria de traducción (microscopía electrónica) Cadena polipeptídica Molécula mRNA BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 16 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución  X  LR = AN AN = n x sen   = longitud de onda  = 0,65 AN = Apertura numérica del objetivo n = índice de refracción del medio  = semiángulo de haz de luz incidente  = 550 nm BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 17 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Obtención de contraste El contraste es la propiedad que nos permite distinguir estructuras celulares por su diferente color o brillo. ¿Cómo podemos obtener contraste? ▪ Variaciones de la  que atraviesa distintas estructuras celulares, ✓ utilizando colorantes (hematoxilina y eosina): la hematoxilina tiñe los núcleos de color azul; la eosina el citoplasma de color rosa. ▪ Mediante variaciones en la amplitud de onda. ✓ Utilizando sistemas ópticos que consiguen variaciones en la amplitud de onda (brillo) en zonas específicas del tejido o célula proporcionando diferencias de brillos (claros y oscuros). BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 18 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 19 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio de contraste de fases Aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 20 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio de contraste de fases Los colorantes utilizados en los microscopios convencionales son no vitales (causan la muerte celular). Los microscopios de contraste de fases permiten hacer estudios in vivo. Microscopio invertido de contraste de fases Micrografía de células epiteliales en cultivo mediante la técnica de contraste de fases brillante o negativo, en la cual los detalles y bordes de las células aparecen brillantes (debido a un halo de difracción) en un fondo oscuro. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 21 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución phase-contrast differential interference-contrast microscopy BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN phase-contrast Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio de fluorescencia La microscopía de fluorescencia se basa en la propiedad que tienen las sustancias fluorescentes de absorber luz de una determinada , y emitir luz con una  Este microscopio permite ver solo las estructuras que se han marcado selectivamente con sustancias fluorescentes (fluorocromos). Se pueden utilizar colorantes fluorescentes para teñir algunos componentes específicos de las células, como el naranja de acridina, que tiñe selectivamente el núcleo. Otras sustancias que se pueden emplear para el marcaje: anticuerpos conjugados con fluorocromos, que reconocen específicamente aquellas proteínas que queremos estudiar específicamente. Los microscopios de fluorescencia tienen una serie de filtros que permiten seleccionar una determinada  que excita máximamente a un fluorocromo determinado antes de que pase por la muestra. Tras la excitación del fluorocromo, se emite luz fluorescente a una  específica. Un fluorocromo muy utilizado es la fluoresceína, que se excita máximamente cuando se hace incidir la luz de una  de 494 nm (azul) y emite a una  de 521 nm (color verde) 23 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio de fluorescencia Fundamentos de la fluorescencia La fluorescencia se describe en términos de excitación y emisión. Un fluorocromo puede ser excitado por un láser a una longitud de onda de excitación definida, momento en el cual la molécula absorbe fotones de luz. Luego, cuando regresa a su estado fundamental, el fluorocromo emite esos fotones con menos energía y a una longitud de onda más larga. La diferencia entre estas dos longitudes de onda de excitación y emisión se denomina desplazamiento de Stokes. Los fluorocromos que presentan desplazamientos de Stokes más grandes son generalmente más deseables para la investigación fluorescente, ya que la luz emitida se puede distinguir fácilmente de la fuente de luz excitadora. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 24 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio de fluorescencia Células HEp-2 expuestas a autoanticuerpos humanos dirigidos contra los filamentos de actina y marcadas con un anticuerpo murino anti IgG humana conjugado con isotiocianato de fluoresceína. DAPI ó (4 ',6-diamino-2-fenilindol) es un marcador fluorescente que se une fuertemente a regiones enriquecidas en adenina y timina en secuencias de ADN.  (absorción) = 358 nm (ultravioleta)  (emisión) = 461 nm (azul) BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 25 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio confocal En el microscopio confocal la fuente de iluminación utilizada es un rayo láser, en lugar de una fuente de luz. Lo que permite una mayor eficacia en la excitación de los fluorocromos. Permite una focalización muy precisa de los puntos que emiten fluorescencia y elimina selectivamente las señales de interferencia generadas por esta. El láser se hace pasar por un pinhole, agujero que permite focalizar el rayo en el punto concreto de la muestra. Tras la excitación de la muestra, la luz fluorescente emitida se filtra a través de otro pinhole, de tal manera que solo se recoge la fluorescencia específica proveniente del punto que ha sido iluminado, evitándose la luz que está fuera del foco, de ahí el nombre de confocal (en foco con el punto iluminado). Poseé un sistema de barrido, capaz de desplazar el rayo láser por la preparación en las tres dimensiones del espacio, iluminando puntos específicos de la misma a distintos tiempos. Como el láser tiene más penetración que la luz visible, los tejidos pueden ser más gruesos con el microscopio confocal. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 26 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio confocal Cada imagen captada corresponde a un plano de fluorescencia que se llama z-stack. Los diferentes stacks se pueden integrar con la ayuda de softwares específicos, permitiendo hacer una reconstrucción tridimensional de la imagen. También, estos programas, pueden eliminar señales de interferencia derivadas del uso de diversos fluorocromos, a través de un proceso denominado deconvolución, y se pueden realizar estudios cuantitativos de las estructuras analizadas. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 27 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio confocal Microtubules are yellow, actin filaments are blue, and nuclei are red BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 28 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio electrónico El microscopio electrónico utiliza como fuente de ‘iluminación’ un haz de electrones acelerado, lo que consigue mejorar el poder de resolución con respecto al microscopio óptico, permitiendo la observación de orgánulos celulares. El microscopio electrónico de transmisión (MET) consiste en un tubo de rayos catódicos, de aproximadamente 1 m de longitud. En la parte superior de la columna se encuentra el cátodo, consistente en un filamento de tugsteno o wolframio, que emite un haz de electrones, mediante una diferencia de potencial, hacia un ánodo perforado más abajo. El haz atraviesa el ánodo y se dirige a la parte basal de la columna. En su camino, el haz es primeramente modificado por una bobina electromagnética que actúa como condensador, focalizando los electrones hacia la muestra. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 29 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio electrónico La muestra se sitúa en una rejilla de cobre o de níquel de unos 3 mm. El haz atraviesa entonces la muestra y es modificado entonces por una bobina que actúa a modo de objetivo y otra que sirve como sistema de proyección (semejante al ocular del microscopio óptico). Para visualizar la imagen originada por los electrones, es necesario convertir la radiación electrónica a una imagen visible por el ojo humano. Esta imagen se obtiene en una pantalla fluorescente situada en la base del microscopio, que recibe la radiación de los electrones ( no visible) y emite radiación a una  mayor (luz visible). Para conducir los electrones es necesario un sistema de bombas que generan vacío, por lo que con este tipo de microscopios no de pueden realizar estudios in vivo. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 30 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio electrónico Para que el haz de electrones atraviese la muestra, esta ha de tener un espesor muy fino (10-100 nm). El contraste en MET se consigue por absorción diferencial de metales pesados en forma de sales, que se unen a estructuras biológicas. Sustancias típicas para el contraste: citrato de plomo y acetato de uranio. Las estructuras que presentan mayor afinidad por estas sustancias impiden en parte el paso de los electrones, por lo que se ve en la pantalla como una zona oscura (zonas electrodensas). Las zonas que permiten un mayor paso de electrones se ven como zonas claras (zonas electrolúcidas). BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 31 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio electrónico de barrido (MEB) Se utiliza para ver superficies de tejidos y células a gran aumento y resolución. Las muestras se sitúan en la base del microscopio, pero éstas han sido metalizadas, por lo que los electrones no las atraviesan, sino que van a ser barridas por los electrones en las tres direcciones del espacio, dando una imagen tridimensional. Con el MEB se pueden ver muestras de considerable tamaño, como tejidos o insectos. El aspecto de visualización es metalizado y tridimensional. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 32 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio electrónico de barrido (MEB) Granos de polen BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN Células sanguíneas 33 Unidad Didáctica 1 Aumentos, poder de resolución y límite de resolución Microscopio electrónico de barrido (MEB) BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 34 Unidad Didáctica 1 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 35 Unidad Didáctica 1 Procesamiento de muestras El procesamiento histológico consta de cuatro fases fundamentales: a) Fijación b) Inclusión c) Microtomía (corte) d) Tinción BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 36 Unidad Didáctica 1 Procesamiento de muestras Fijación Permiten detener los procesos de degradación que se producen tras la muerte celular (autolisis). Provoca reacciones fisicoquímicas que preservan las estructuras y componentes químicos de las células (proteínas) y da consistencia mecánica a la muestra (dureza), permitiendo manipulaciones posteriores. Métodos de fijación: a) Físicos: Criofijación o congelación, el tejido se expone a temperaturas inferiores a -70ºC, disminuyendo actividad enzimática e inmovilizando las estructuras celulares. Es un método reversible, que deja de funcionar cuando aumenta la temperatura; y puede provocar la formación de cristales de hielo que dañan la estructura celular. Hay sustancias protectoras, como la sacarosa o el glicerol, que previenen la formación de estos cristales. Método de fijación muy rápido, muy útil en el procesado de biopsias urgentes intraoperatorias. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 37 Unidad Didáctica 1 Procesamiento de muestras Fijación Métodos de fijación: b) Químicos: emplea sustancias químicas que interaccionan con las macromoléculas celulares, estabilizándolas. Tres tipos de fijadores: agentes entrecruzantes (dan lugar a un entrelazamiento de proteínas), oxidantes y precipitantes. Agentes entrecruzantes: formaldehido para microscopía óptica y glutaraldehido y tetróxido de osmio para ME. Este último muy útil para fijar y dar contraste a los lípidos, y por tanto visualizar membranas celulares. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 38 Unidad Didáctica 1 Procesamiento de muestras Inclusión Objetivo: eliminar el agua (mediante deshidratación, utilizando concentraciones crecientes de etanol) de los tejidos y reemplazarla por un medio que solidifica, lo que permita el corte posterior. Posibilita la obtención de cortes finos para permitir el paso de la luz o de los electrones. Se utiliza parafina, para microscopía óptica, y resinas para ME. Parafina: mezcla de ceras compuesta por Resina: son más duras que la parafina, por lo que permiten hidrocarburos de cadena larga con un punto de realizar cortes más finos. Son sustancias líquidas en forma fusión de 50ºC monomérica, y polimerizan tras tratamiento con calor o luz UV. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 39 Unidad Didáctica 1 Procesamiento de muestras Microtomía Los cortes histológicos se realizan en un microtomo (entre 3 y 5 m, MO) o ultramicrotomo (entre 10- 100 nm, ME). Los cortes de las muestras fijadas por congelación son más gruesos (6 y 8 m como mínimo), y se realizan en un criostato, que mantienen a las muestras a una temperatura de -20ºC, durante el corte. Estas muestras no requieren el paso de deshidratación. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 40 Unidad Didáctica 1 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 41 Unidad Didáctica 1 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 42 Unidad Didáctica 1 Procesamiento de muestras Microtomía Hay muestras que no requieren pasos de fijación ni corte, si no que la visualización se hace directamente. Por ejemplo, células en medio líquido (frotis de sangre) o muestras de diversos fluidos biológicos, como esputos o lavados bronquioalveolares. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 43 Unidad Didáctica 1 Procesamiento de muestras Tinción En MO se emplean colorantes con distinta afinidad por los orgánulos celulares. Ejemplos: la hematoxilina- eosina es la más utilizada en el diagnóstico anatomopatológico; Papanicolau (mezcla de hematoxilina con diversos colorantes citoplásmicos) se utiliza en citologías exfoliativas; tinción argéntica para estudiar sistema nervioso. En ME el contraste se realiza mediante moléculas de alto peso molecular que intensifican la capacidad de dispersión de la muestra (acetato de uranio y citrato de plomo). BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 44 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 45 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas Objeto: identificar la presencia de una proteína concreta en una sección de tejido mediante el el uso de anticuerpos específicos. Por ejemplo: identificación de proteínas víricas, sobre expresión de determinados oncogenes, etc. La inmunohistoquímica es esencial en los laboratorios de anatomía patológica, por la capacidad que tiene de ayudar en el diagnóstico de enfermedades. Las técnicas inmunohistoquímicas se pueden dividir en dos grandes grupos: ✓ Directas: el anticuerpo que reconoce el antígeno de interés (anticuerpo primario) que está conjugado a una sustancia que puede que puede ser detectada al microscopio (una enzima, un fluorocromo o una partícula de oro). ✓ Indirectas: el anticuerpo primario no está conjugado, si no que se utiliza un anticuerpo secundario, que reconoce al primario, y que a su vez está conjugado con una sustancia visible al microscopio. Por lo tanto, la señal vendrá del anticuerpo secundario. Los métodos indirectos son los más utilizados, ya que los anticuerpos utilizados pueden reconocer la fracción Fc de una especie determinada, y utilizar un mismo anticuerpo para muchos anticuerpos primarios, independientemente del antígeno que reconozcan. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 46 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas Estructura de un anticuerpo humano BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 47 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas Marcaje directo Marcaje indirecto BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 48 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas La técnica más utilizada en los laboratorios de diagnóstico es el marcaje indirecto con anticuerpos secundarios unidos a la enzima peroxidasa. La presencia de peroxidasa se revela mediante una reacción histoquímica consistente en añadir un sustrato (H2O2) en presencia de un donador de electrones (normalmente diaminobencidina, DAB). Como consecuencia de la actividad de la peroxidasa, el H2O2 se reduce y la DAB se oxida dando lugar a un precipitado de color marrón. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 49 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas Esquema de una reacción inmunohistoquímica en un laboratorio de diagnóstico: 1. Desparafinación e hidratación de los tejidos (xilol, baños en alcohol a distintos grados). 2. Incubación de la preparación con el anticuerpo primario. 3. Lavado de la preparación para eliminar el exceso de inmunoglobulinas no unidas a los antígenos. 4. Incubación del anticuerpo secundario conjugado a la peroxidasa. 5. Lavado para eliminar el exceso de anticuerpo. 6. Revelado: demostración histoquímica de la actividad enzimática de la peroxidasa unida al anticuerpo secundario. 7. Observación. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 50 Unidad Didáctica 1 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 51 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas Cáncer de mama RE HER2 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 52 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas Los anticuerpos también se pueden conjugar a sustancias fluorescentes en su región Fc (inmunofluorescencia). En este caso no se requieren reacciones enzimáticas. La detección se lleva a cabo con un microscopio de fluorescencia. La señal se pierde progresivamente con el tiempo. Para microscopía electrónica se emplean anticuerpo conjugados con partículas Inmunofluorescencia de células de carcinoma escamoso. En pesadas como el oro o ferritina, que al verde, el citoesqueleto de filamentos intermedios; en rojo, ser electrodensas permiten su una proteína de adhesión relacionada con la metástasis y en azul los núcleos celulares con una tinción para DNA (DAPI). visualización. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 53 Unidad Didáctica 1 Técnicas inmunohistoquímicas Two images produced using immunogold labeling and transmission electron microscopy: Electron microscopy reveals mitochondrial DNA in discrete foci. Bars: 200 nm. (A) Cytoplasmic section after immunogold labelling with anti-DNA; gold particles marking mtDNA are found near the mitochondrial membrane. (B) Whole mount view of cytoplasm after extraction with CSK buffer and immunogold labelling with anti-DNA; mtDNA (marked by gold particles) resists extraction. Iborra et al. BMC Biology 2004 2:9 doi:10.1186/1741-7007-2-9 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 54 Unidad Didáctica 1 Citometría de flujo BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 55 Unidad Didáctica 1 Citometría de flujo La citometría de flujo es una técnica de análisis del número, tamaño y forma de una suspensión celular. También sirve para cuantificar el número de células de determinadas poblaciones celulares marcadas específicamente con sustancias fluorescentes y para aislar poblaciones celulares. Especialmente útil para el estudio de poblaciones normales y patológicas de células sanguíneas y de médula ósea. El citómetro tiene los siguientes componentes: ✓ Sistema fluídico de transporte de muestras. ✓ Sistema óptico de iluminación de las partículas mediante láser (argón). ✓ Detector electrónico, que convierte la luz en señal digital. Las células pasan en un capilar muy fino de forma que pasan de una en una. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 56 Unidad Didáctica 1 Citometría de flujo Según van pasando las células, el rayo impacta sobre ellas y se produce una distorsión del rayo, que es la que es registrada por el detector. Este sistema cuantifica el número de eventos (células) que son impactados por el láser, pero también es capaz de analizar la forma y la complejidad interna de la célula. El grado de alteración que se produce cuando el láser atraviesa los límites celulares da lugar a una dispersión frontal (FSC, forward scatter) que se relaciona con el tamaño de la célula (a mayor FSC, mayor tamaño celular). La complejidad interna de las células produce una dispersión lateral u ortogonal (SSC, side scatter). Las células granulares o complejas producirán un mayor SSC. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 57 Unidad Didáctica 1 Citometría de flujo BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 58 Unidad Didáctica 1 Citometría de flujo Detección de linfocitos CD4 para monitorizar la carga vírica en pacientes Otra posibilidad es marcar una población celular infectados con VIH. específicamente con un fluorocromo. Un fluorocromo muy utilizado es el isotiocianoato de fluoresceína (FITC), que absorbe a 490 nm y emite a 525 nm. Por ejemplo, marcar los linfocitos B (CD19) con una anticuerpo anti-CD19-FITC, para distinguirlos de los linfocitos T o NK. La presencia de un número especialmente elevado de linfocitos B puede ser indicativo de una leucemia. Los marcadores de superficie se suelen emplear para caracterizar patologías concretas. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 59 Unidad Didáctica 1 Citometría de flujo Se pueden realizar también múltiples marcajes. Para ello hay que emplear diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromos diferentes. Además del FITC se suelen emplear: la ficoeritrina (PE, absorbe entre 480-565 nm, y emite a 578 nm) y la aloficocinina (APC, absorbe a 650 nm y emite a 661 nm). Ej. ¿cuántos linfocitos CD4+ expresan interferón ? BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 60 Unidad Didáctica 1  Citometría de flujo Los citómetros clásicos, con un solo rayo láser, permiten analizar 5 parámetros a la vez: FSC, SSC y tres canales de fluorescencia. Hoy en día existen equipos con capacidad para analizar 18 canales de fluorescencia, es decir 20 parámetros al mismo tiempo, para cada célula. Otros parámetros que pueden obtenerse a partir del citómetro de flujo son parámetros de ciclo celular: apoptosis, necrosis, número de mitocondrias, cantidad de ADN, actividad enzimática, presencia de determinados metabolitos, etc. Otros tienen capacidad de aislar células (Sorters). El campo diagnóstico de mayor aplicación: hematología. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 61 Unidad Didáctica 1 Cultivo celular BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 62 Unidad Didáctica 1 Cultivo celular Una de las herramientas más utilizadas en el campo de la biología celular. Las células cultivadas in vitro provienen de un órgano o tejido normal o tumoral. Estas células se mantienen en medios de cultivo de composición conocida y en condiciones de oxígeno y temperatura controladas (habitualmente, 37°C, 5% CO2 y 95% O2). Células hepáticas en cultivo BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 63 Unidad Didáctica 1 Cultivo celular Cultivos primarios Son aquellos que derivan directamente de células, tejidos u órganos tomados de un paciente o de un animal. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 64 Unidad Didáctica 1 Cultivo celular Líneas celulares Cuando las células de un cultivo primario adquieren capacidad ilimitada de multiplicación y son líneas puras (que no tienen contaminación de otros tipos de células). Constituyen herramientas de trabajo de fácil manipulación y ofrecen una fuente homogénea e ilimitada de células fácilmente caracterizables. http://software.broadinstitute.org/software/cprg/?q=node/11 BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 65 Unidad Didáctica 1  Wu X,et al. Conditional reprogramming: next generation cell culture. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2020; 10(8):1360-1381, BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 66 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 67 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Si se desea estudiar la composición química y la función de determinados orgánulos y otras partículas subcelulares, conviene separarlos del resto de componentes citoplasmáticos y nucleares. Lo primero que se ha de hacer es romper la membrana plasmática, lo que permitirá obtener una suspensión con todos los componentes subcelulares. Existen diversos métodos para romper las células. Uno de ellos es el choque hipotónico. Homogeneizadores mecánicos mediante la aplicación de ultrasonidos, presión u otras fuerzas (en soluciones isotónicas a bajas temperaturas). Un homogeneizado típico está constituido por una suspensión de orgánulos, componentes celulares y macromoléculas que podemos separar mediante centrifugación. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 68 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Centrifugación Las partículas o las células en suspensión tienden a sedimentar debido a la fuerza de la gravedad. Cuando un cuerpo se somete a centrifugación se genera una fuerza que tiende a escapar del centro de rotación (fuerza centrífuga). Las centrífugas son equipos que generan este tipo de fuerzas y cuentan con un rotor (donde se sitúan las muestras) y que giran a altísimas velocidades. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 69 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Centrifugación La fuerza centrífuga aplicada a una partícula es proporcional a la velocidad de rotación del rotor (en revoluciones por minuto, rpm) y su distancia con respecto al centro de rotación (en cm). La fuerza centrífuga relativa (FCR) se expresa en función de la fuerza de gravedad con la siguiente fórmula: FCR = 1.119 x 10-5 x r (cm) x V2 (rpm) La constante 1.1119 depende de la aceleración gravitacional FCR se expresa en unidades x g Por ejemplo, una FCR de 500 g significa una fuerza 500 veces superior a la fuerza de la gravedad. La velocidad a la que sedimentan las partículas depende de su masa y su densidad (directamente proporcional), así como de la densidad y viscosidad del medio en el que se encuentran (inversamente proporcional). BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 70 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Centrifugación Las moléculas y las estructuras subcelulares se pueden definir por un coeficiente de sedimentación que se expresa en unidades Svedberg (S) (1S = 10-13 s). Habitualmente se definen para la sedimentación en agua a 20ºC. El coeficiente refleja, no solo su masa, si no también su forma, su superficie expuesta y su densidad. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 71 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Centrifugación diferencial Aprovecha la propiedad de las partículas de mayor tamaño o densidad para sedimentar más rápido que aquellas de menor tamaño o densidad. Se basa en sucesivas centrifugaciones a velocidades crecientes. Cuando se requieren fuerzas superiores a 20.000 x g, se utilizan ultracentrífugas que trabajan en vacío para evitar sobrecalentamiento de la muestra y del equipo. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 72 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Centrifugación en gradiente de densidad La fuerza centrífuga aplicada a las partículas es contrarrestada por fuerzas de fricción (que dependen de la viscosidad del medio) y de flotación (directamente proporcional a la densidad del medio). La partícula no se mueve cuando su densidad es igual a la del medio (Sedimentación isopícnica o de equilibrio). En la sedimentación zonal, la densidad de las partículas que se debe separar es mayor a la densidad del medio de separación. Sustancias para preparar los gradientes: la sacarosa, la más utilizada, en concentraciones que van de un 5% (1,017 g/ml) a un 50% (1,23 g/ml). El cloruro de cesio es el componente preferido para separar ácido nucleicos. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 73 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Centrifugación en gradiente de densidad BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 74 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Centrifugación en gradiente de densidad BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 75 Unidad Didáctica 1 Fraccionamiento celular y centrifugación diferencial Centrifugación en gradiente de densidad La centrifugación diferencial también se aplica a células, para lo cual se emplean gradientes como Ficoll, Percol o Nicodenz. BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN 76 Unidad Didáctica 1