Hübridisatsioonitehnikad
40 Questions
1 Views

Choose a study mode

Play Quiz
Study Flashcards
Spaced Repetition
Chat to lesson

Podcast

Play an AI-generated podcast conversation about this lesson

Questions and Answers

Mis juhtub DNA-DNA hübriidi Tm-iga, kui lisada 1% formamiidi?

  • Tm ei muutu.
  • Tm langeb umbes 0.6°C võrra. (correct)
  • Tm tõuseb 0.6°C võrra.
  • Tm langeb 30°C võrra.

    • Kuidas hinnatakse nukleiinhapete dupleksi stabiilsust?

  • Mõõdetakse vesiniksidemete arvu.
  • Määratakse nukleiinhapete pikkus.
  • Vaadatakse DNA optilist tihedust madalatel temperatuuridel.
  • Hinnatakse sulamistemperatuuri Tm kaudu. (correct)

    • Milline termint kirjeldab asjaolu, et kaheahelaline DNA absorbeerib ultraviolettvalgust vähem kui vabad nukleotiidid?

  • Hüpokroomne efekt. (correct)
  • Stabiilsus.
  • Komplementaarsus.
  • Hübridisatsioon.

    • Millise pikkusega on tavaliselt kromosoomide proovid?

    <p>15-20 nukleotiidi</p> Signup and view all the answers

    Millised ained destabiliseerivad nukleiinhappe dupleksi stabiilsust?

    <p>Formamiid ja 6M uurea.</p> Signup and view all the answers

    Kuidas muutub DNA optiline tihedus Tm juures?

    <p>See ulatub maksimumini.</p> Signup and view all the answers

    Millastes faasides valmistatakse kromosoomide proove?

    <p>Metafaasis ja prometafaasis</p> Signup and view all the answers

    Miks on Southern blot'i tehnoloogiat laialdaselt kasutatud?

    <p>Patogeensete mutatsioonide analüüsimiseks</p> Signup and view all the answers

    Mida moodustab heterogeensed nukleiinhappe molekulide populatsioonid?

    <p>Nukleiinhapete segu heterogeenseid järjestusi.</p> Signup and view all the answers

    Miks ei saa hübridiseerimist efektiivselt läbi viia, kui proovi Tm on liiga madal?

    <p>Sest see ei põhjusta aluste vahelisi sidemeid.</p> Signup and view all the answers

    Milline tehnoloogia on seotud fluorestsents in situ hübridisatsiooniga?

    <p>Koe in situ hübridisatsioon</p> Signup and view all the answers

    Mis on Tm ja millest see sõltub?

    <p>Tm on optilise tiheduse mõõt; see sõltub järjestuste komplementaarsusest.</p> Signup and view all the answers

    Mis toimub, kui tekib patogeenne mutatsioon kromosoomis?

    <p>Kaob restriktsioonisait</p> Signup and view all the answers

    Mis on riboproovide tundlikkuse eelised?

    <p>Neil ei teki homodupleksite probleeme</p> Signup and view all the answers

    Kuidas toimub Southern blot hübridisatsioon?

    <p>Geneetilise materjali denatureerimisega</p> Signup and view all the answers

    Mis juhtub, kui Ac→T mutatsioon toimub ß-globiini geenis?

    <p>See põhjustab restriktsioonisaiti vähenemist</p> Signup and view all the answers

    Mis juhtub Tm-i väärtusega, kui DNA ahelad leiavad komplementaarse monovalentse katiooni?

    <p>Tm-i väärtus tõuseb 16.6°C võrra.</p> Signup and view all the answers

    Kuidas mõjutab 1% valepaardumisi dupleksi Tm-i?

    <p>Vähendab Tm-i keskmiselt umbes 1°C võrra.</p> Signup and view all the answers

    Millised tingimused on vajalikud Cot-1 DNA määramiseks?

    <p>Temperatuur 65°C ja Na+ ioonide kontsentratsioon 300mM.</p> Signup and view all the answers

    Mis on konkuratiivse hübridisatsiooni peamine eesmärk?

    <p>Blokeerida tugevat signaali kordusjärjestustest.</p> Signup and view all the answers

    Kuidas mõjutavad kõrgelt korduvad DNA järjestused hübridisatsiooni käigus?

    <p>Need blokeerivad seondumise hübridisatsiooni käigus.</p> Signup and view all the answers

    Mis on Cot väärtus?

    <p>See on DNA kontsentratsiooni ja reaktsiooni aja suhe.</p> Signup and view all the answers

    Kuidas mõjutab denatureeritud DNA ahelate reassotsiatsioon Tm-i?

    <p>See suurendab Tm-i väärtust.</p> Signup and view all the answers

    Milline tehnika on peamine meetod molekulaardiagnostikas?

    <p>Molekulaarhübridisatsioon.</p> Signup and view all the answers

    Milline järgmistest väidetest on vale seoses PCR-i protsessiga?

    <p>Denaturatsioon toimub temperatuuril 50-70°C.</p> Signup and view all the answers

    Millised omadused on olulised PCR-il kasutatava DNA polümeraasi puhul?

    <p>Protsessiivsus ja reaktsiooni täpsus.</p> Signup and view all the answers

    Miks on oluline teada DNA järjestusi enne PCR-i tegemist?

    <p>Et disainida õige praimer, mis seondub DNA-ga.</p> Signup and view all the answers

    Mis juhtub Touch-down PCR-i esimestel tsüklitel?

    <p>Alguses kasutatakse kõrgemat temperatuuri, misjärel alandatakse temperatuuri.</p> Signup and view all the answers

    Mis on tüüpiline dNTP-de arvu polümeriseerimine ühe sekundi jooksul Taq polümeraasi puhul?

    <p>10-20 dNTP-d.</p> Signup and view all the answers

    Kuidas saavutatakse PCR-i reaktsiooni spetsiifilisus?

    <p>Tõstes temperatuuride vahemiku alguses.</p> Signup and view all the answers

    Kuidas sõltub annealing temperatuur praimerite Tm-ist?

    <p>Annealing temperatuur võetakse üldiselt ca 5°C alla Tm-i.</p> Signup and view all the answers

    Millised on Mutatsiooni A- ja S-alleelide eristamise meetodid?

    <p>Nende eristamine toimub DNA mikroarray-de abil.</p> Signup and view all the answers

    Milline värv on passiivne referentsvärv, mida kasutatakse PCR-i protseduurides?

    <p>Passiivne fluorestsentsvärv</p> Signup and view all the answers

    Milliseid meetodeid eristatakse reaalaja kvantitatiivse PCR-i (qPCR) puhul?

    <p>Absoluutne kvantiseerimine ja suhteline kvantiseerimine</p> Signup and view all the answers

    Miks on normaaliseerimine PCR-i protsessis vajalik?

    <p>Reaktsioonimahu või kontsentratsiooni kõikumiste tasandamiseks</p> Signup and view all the answers

    Milline on TaqMan proovi peamine omadus PCR-i kontekstis?

    <p>See sisaldab 5’ otsa kinnitatud fluorestsseeruvat molekuli</p> Signup and view all the answers

    Millised kaks tüüpi värve seondub kaheahelalise DNA-ga PCR-i käigus?

    <p>SYBR Green ja EvaGreen</p> Signup and view all the answers

    Kuidas saavutatakse fluorestsents-signaal reaalaja kvantitatiivse PCR-i (qPCR) puhul?

    <p>DNA amplifikatsiooni käigus</p> Signup and view all the answers

    Milleks kasutatakse reportervärvi PCR-i protsessis?

    <p>Tuvastama amplifitseeritud DNA sekvense</p> Signup and view all the answers

    Mis on absoluutse kvantiseerimise (AQ) meetodi eesmärk qPCR-is?

    <p>Arvutada DNA koopiate täpset arvu</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Hübridisatsioonitehnikad

    • Kahe erineva päritolu komplementaarse nukleiinhappe üksikahela kokkusegamisel toimub nendevaheline hübridisatsioon, mille käigus nukleiinhapete ahelad paarduvad omavahel vesiniksidemete abil, moodustades hübriidse kaksikahela.
    • Hübridiseerides proovides on eesmärgiks tuvastada sihtmärk DNA-s homoloogilisi järjestusi, kasutades proovis teadaolevaid järjestusi.
    • Proovid koosnevad tavaliselt teadaoleva nukleiinhappe molekulide homogeensest populatsioonist, märgitud radioaktiivse, keemilise, fluorestsentsvõi muu märgisega.
    • Sihtmärk, otsitavad järjestused, koosnevad heterogeensest nukleiinhapete populatsioonist.
    • Nukleiinhapete dupleksi stabiilsust hinnatakse sulamistemperatuuri Tm kaudu. See on keskpunkt, mille juures kaheahelaline DNA läheb üle üheahelaliseks.
    • Tm mõõdetakse DNA optilise tiheduse kaudu. Lämmastikalused absorbeerivad tugevalt ultraviolettvalgust λ=260nm juures, kaheahelaline DNA aga vähem kui vabad nukleotiidid. Seda nimetatakse hüpokroomseks efektiks.
    • DNA-DNA hübriidi Tm-i vähendab 1% formamiidi lisamine umbes 0.6°C võrra, samas kui 6M uurea vähendab Tm-i ca 30°C võrra.
    • Tm tõuseb 16.6°C võrra kui monovalentsete katioonide (näit.Na+), kontsentratsioon tõuseb 1 kord soolakontsentratsioonide vahemikus 0.01 kuni 0.40M NaCl.
    • Konkureeriv hübridisatsioon kasutatakse DNA kordusjärjestustest tingitud tugeva signaali blokeerimiseks. Märgitud proov denatureeritakse ja lastakse reaassotsieeruda kas märkimata totaalse genoomse DNA või kõrge korduste arvuga DNA järjestuste suhtes rikastatud DNA manulusel.
    • Proovis asuv kõrgelt korduv DNA assotsieerub proovis leiduvate kordustega, blokeerides nende seostumise hübridisatsiooni käigus.
    • Valepaardumised (mismatch) kahe ahela vahel vähendavad Tm-i. Keskmiselt vähendab 1% valepaardumisi dupleksi Tm-i umbes 1°C võrra.
    • Molekulaarhübridisatsioon on üks tänapäeva molekulaardiagnostika põhimeetodeid.

    Hübridisatsiooni meetodid

    • Fluorestsents in situ hübridisatsioon ehk FISH: Kasutatakse kromosoomide metafaasi või prometafaasi preparaate, mis on töödeldud RNaasi ja proteinaasK-ga. Denatureeritakse formamiidiga ja rakendatakse erinevaid fluorestseeruvaid märkeid.
    • Southern blot hübridisatsioon: Restrikteeritud (genoomne) DNA lahutatakse geelelektroforeesil fragmentide pikkuse järgi, denatureeritakse, kantakse filtrile ja immobiliseeritakse. Filtrit hübridiseeritakse uuritava geeni suhtes spetsiifilise märgitud prooviga.
    • Koe in situ hübridisatsioon: Märgitud prooviga hübridiseeritakse koelõiku RNAd, mis on tehtud kas parafiinplokkidest või külmutatud kudedest. Eelistatult kasutatakse üheahelalist komplementaarset RNA proovi ehk riboproovi, kuna selle tundlikkus on suurem. Antisense riboproovid on komplementaarsed mRNA-le.
    • Koloonia hübridisatsioon: VT: Kloonimise loeng
    • Pööratud hübridisatsioon: Kasutatakse robotiga (microarrayer) tehtud filtreid ja DNA mikroarray’sid. Märkimata proov kantakse 2D struktuurina tahkele kandjale ja hübridiseeritakse lahuses oleva märgitud target DNA-ga. VT: Ülegenoomsete meetodite loeng.

    Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

    • PCR on tänapäeva molekulaarbioloogide üks põhilisi töövahendeid, mida rakendatakse fundamentaaluuringutes, kliinilises praktikas ja kohtupraktikas.
    • Kary Mullis sai PCR-i meetodi eest 1993. aastal Nobeli keemia preemia.
    • Enne PCR-i teostamist on vaja teada vastavaid DNA järjestusi, mille alusel disainida 15-25 meersed sünteetsed oligonukleotiidid, mida nimetatakse praimeriteks.
    • PCR koosneb kolmest etapist: denaturatsioon (93-95°C), annealing (50-70°C) ja ekstensioon.
    • PCR-il kasutatava DNA polümeraasi puhul on oluline: termostabiilsus, ekstensioonireaktsiooni kiirus, protsessiivsus ja reaktsiooni täpsus (fidelity).
    • Touch-down PCR-i meetodil tõstetakse reaktsiooni spetsiifilisust tehes esimesed tsüklid kõrgemal temperatuuril ja seejärel alandades annealing temperatuuri.
    • Kvantitatiivne PCR (qPCR) on PCR-meetod, mille abil saab määrata algmaterjali kogust, näiteks DNA koopiaarvu meid huvitavas lookses.
    • qPCR-is kvantitseeritakse kasutades kaht meetodit: absoluutse kvantiseerimise (AQ) meetod ja suhtelise kvantiseerimise (RQ) meetod.
    • Real-aja kvantitatiivne PCR kasutab reportervärvi ja passiivset referentsvärvi, mis võimaldavad reaktsiooni jälgida ja kvantiseerida.

    qPCR meetodid

    • Kaheahelalise DNA-ga seonduvad värvid, näit. SYBR Green, fluorestseerivad ainult kaheahelalise DNA-ga seondudes, mis võimaldab kvantitseerida amplifitseeritud DNA kogust.
    • TaqMan proovi 5’ otsa kinnitatud fluorestseeruv molekul toimib reportervärvina, võimaldades tuvastada meid huvitava järjestuse amplifitseerumist PCR’i käigus.
    • Standard ehk teadaoleva koopiaarvuga sihtmärkjärjestust sisaldav DNA lahus või katsepunkt on vajalik qPCR-i puhul täpse kvantiseerimise jaoks.

    Studying That Suits You

    Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.

    Quiz Team

    Related Documents

    Hübridisatsioon ja PCR PDF

    Description

    See test käsitleb hübridisatsioonitehnikaid ja nende rakendusi DNA uurimisel. Quizz loodi selleks, et testida arusaamist DNA kahe ahela hübridiseerimise ja stabiilsuse hindamise kohta. Osalejad saavad teada, kuidas on saadud tulemused ja mõõtmised seotud nukleiinhapete omadustega.

    More Like This

    Use Quizgecko on...
    Browser
    Open
    Browser
    Browser