Hübridisatsioonitehnikad

Hübridisatsioonitehnikad

• Kahe erineva päritolu komplementaarse nukleiinhappe üksikahela kokkusegamisel toimub nendevaheline hübridisatsioon, mille käigus nukleiinhapete ahelad paarduvad omavahel vesiniksidemete abil, moodustades hübriidse kaksikahela.
• Hübridiseerides proovides on eesmärgiks tuvastada sihtmärk DNA-s homoloogilisi järjestusi, kasutades proovis teadaolevaid järjestusi.
• Proovid koosnevad tavaliselt teadaoleva nukleiinhappe molekulide homogeensest populatsioonist, märgitud radioaktiivse, keemilise, fluorestsentsvõi muu märgisega.
• Sihtmärk, otsitavad järjestused, koosnevad heterogeensest nukleiinhapete populatsioonist.
• Nukleiinhapete dupleksi stabiilsust hinnatakse sulamistemperatuuri Tm kaudu. See on keskpunkt, mille juures kaheahelaline DNA läheb üle üheahelaliseks.
• Tm mõõdetakse DNA optilise tiheduse kaudu. Lämmastikalused absorbeerivad tugevalt ultraviolettvalgust λ=260nm juures, kaheahelaline DNA aga vähem kui vabad nukleotiidid. Seda nimetatakse hüpokroomseks efektiks.
• DNA-DNA hübriidi Tm-i vähendab 1% formamiidi lisamine umbes 0.6°C võrra, samas kui 6M uurea vähendab Tm-i ca 30°C võrra.
• Tm tõuseb 16.6°C võrra kui monovalentsete katioonide (näit.Na+), kontsentratsioon tõuseb 1 kord soolakontsentratsioonide vahemikus 0.01 kuni 0.40M NaCl.
• Konkureeriv hübridisatsioon kasutatakse DNA kordusjärjestustest tingitud tugeva signaali blokeerimiseks. Märgitud proov denatureeritakse ja lastakse reaassotsieeruda kas märkimata totaalse genoomse DNA või kõrge korduste arvuga DNA järjestuste suhtes rikastatud DNA manulusel.
• Proovis asuv kõrgelt korduv DNA assotsieerub proovis leiduvate kordustega, blokeerides nende seostumise hübridisatsiooni käigus.
• Valepaardumised (mismatch) kahe ahela vahel vähendavad Tm-i. Keskmiselt vähendab 1% valepaardumisi dupleksi Tm-i umbes 1°C võrra.
• Molekulaarhübridisatsioon on üks tänapäeva molekulaardiagnostika põhimeetodeid.

Hübridisatsiooni meetodid

• Fluorestsents in situ hübridisatsioon ehk FISH: Kasutatakse kromosoomide metafaasi või prometafaasi preparaate, mis on töödeldud RNaasi ja proteinaasK-ga. Denatureeritakse formamiidiga ja rakendatakse erinevaid fluorestseeruvaid märkeid.
• Southern blot hübridisatsioon: Restrikteeritud (genoomne) DNA lahutatakse geelelektroforeesil fragmentide pikkuse järgi, denatureeritakse, kantakse filtrile ja immobiliseeritakse. Filtrit hübridiseeritakse uuritava geeni suhtes spetsiifilise märgitud prooviga.
• Koe in situ hübridisatsioon: Märgitud prooviga hübridiseeritakse koelõiku RNAd, mis on tehtud kas parafiinplokkidest või külmutatud kudedest. Eelistatult kasutatakse üheahelalist komplementaarset RNA proovi ehk riboproovi, kuna selle tundlikkus on suurem. Antisense riboproovid on komplementaarsed mRNA-le.
• Koloonia hübridisatsioon: VT: Kloonimise loeng
• Pööratud hübridisatsioon: Kasutatakse robotiga (microarrayer) tehtud filtreid ja DNA mikroarray’sid. Märkimata proov kantakse 2D struktuurina tahkele kandjale ja hübridiseeritakse lahuses oleva märgitud target DNA-ga. VT: Ülegenoomsete meetodite loeng.

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

• PCR on tänapäeva molekulaarbioloogide üks põhilisi töövahendeid, mida rakendatakse fundamentaaluuringutes, kliinilises praktikas ja kohtupraktikas.
• Kary Mullis sai PCR-i meetodi eest 1993. aastal Nobeli keemia preemia.
• Enne PCR-i teostamist on vaja teada vastavaid DNA järjestusi, mille alusel disainida 15-25 meersed sünteetsed oligonukleotiidid, mida nimetatakse praimeriteks.
• PCR koosneb kolmest etapist: denaturatsioon (93-95°C), annealing (50-70°C) ja ekstensioon.
• PCR-il kasutatava DNA polümeraasi puhul on oluline: termostabiilsus, ekstensioonireaktsiooni kiirus, protsessiivsus ja reaktsiooni täpsus (fidelity).
• Touch-down PCR-i meetodil tõstetakse reaktsiooni spetsiifilisust tehes esimesed tsüklid kõrgemal temperatuuril ja seejärel alandades annealing temperatuuri.
• Kvantitatiivne PCR (qPCR) on PCR-meetod, mille abil saab määrata algmaterjali kogust, näiteks DNA koopiaarvu meid huvitavas lookses.
• qPCR-is kvantitseeritakse kasutades kaht meetodit: absoluutse kvantiseerimise (AQ) meetod ja suhtelise kvantiseerimise (RQ) meetod.
• Real-aja kvantitatiivne PCR kasutab reportervärvi ja passiivset referentsvärvi, mis võimaldavad reaktsiooni jälgida ja kvantiseerida.

qPCR meetodid

• Kaheahelalise DNA-ga seonduvad värvid, näit. SYBR Green, fluorestseerivad ainult kaheahelalise DNA-ga seondudes, mis võimaldab kvantitseerida amplifitseeritud DNA kogust.
• TaqMan proovi 5’ otsa kinnitatud fluorestseeruv molekul toimib reportervärvina, võimaldades tuvastada meid huvitava järjestuse amplifitseerumist PCR’i käigus.
• Standard ehk teadaoleva koopiaarvuga sihtmärkjärjestust sisaldav DNA lahus või katsepunkt on vajalik qPCR-i puhul täpse kvantiseerimise jaoks.

See test käsitleb hübridisatsioonitehnikaid ja nende rakendusi DNA uurimisel. Quizz loodi selleks, et testida arusaamist DNA kahe ahela hübridiseerimise ja stabiilsuse hindamise kohta. Osalejad saavad teada, kuidas on saadud tulemused ja mõõtmised seotud nukleiinhapete omadustega.