Hübridisatsioon ja PCR PDF

© 2024 Biotehnoloogia õppetool – Ants Kurg Hübridisatsioonitehnikad ja polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) Kahe erinevat päritolu komplementaarse kontsentratsioonide vahemikus 0.01 kuni nukleiinhappe üksikahela kokkusegamisel 0.40M NaCl. toimub nendeva...

© 2024 Biotehnoloogia õppetool – Ants Kurg Hübridisatsioonitehnikad ja polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) Kahe erinevat päritolu komplementaarse kontsentratsioonide vahemikus 0.01 kuni nukleiinhappe üksikahela kokkusegamisel 0.40M NaCl. toimub nendevaheline hübridisatsioon, mille 5. Destabiliseerivad ained: Iga 1% käigus nukleiinhapete ahelad paarduvad formamiidi lisamine vähendab DNA-DNA omavahel vesiniksidemete abil moodustades hübriidi Tm-i umbes 0.6°C võrra. 6M uurea hübriidse kaksikahela. vähendab Tm-i ca 30°C võrra. Hübridisatsioonitehnika on meetod uuritava nukleiinhappe molekuli eristamiseks hetero- Nukleiinhapete dupleksi stabiilsust hinnatakse geenses nukleiinhappe molekulide populat- sulamistemperatuuri Tm kaudu. sioonis proovi ja sihtmärgi (target’i) komple- See on keskpunkt mille juures kaheahelaline mentaarsuse alusel. DNA läheb üle üheahelaliseks. Tm-i mõõde- Proov (teadaolev järjestus) koosneb tüüpiliselt takse DNA optilise tiheduse kaudu. Nukleiin- meile teadaoleva nukleiinhappe molekulide happe lämmastikalused absorbeerivad homogeensest populatsioonist (kloonitud λ=260nm juures tugevalt ultraviolettvalgust, DNA või keemiliselt sünteesitud oligo- kusjuures kaheahelaline DNA absorbeerib nukleotiidid), mis on märgitud radioaktiivse, vähem kui vabad nukleotiidid. Seda erinevust keemilise, fluorestsents vms. märkega. nimetatakse hüpokroomseks efektiks ja see Sihtmärgi (otsitavad järjestused) moodustab tekib DNA ahelas olevate aluste elektron- nukleiinhapete segust koosnev heterogeenne süsteemide omavaheliste interaktsioonide tõttu. populatsioon. Kui kaheahelalist DNA-d aeglaselt kuumutada, Hübridiseerimise eesmärgiks on proovi siis UV valguse absorbtsioon λ=260nm juures teadaolevaid järjestusi kasutades tuvastada tõuseb vabu lämmastikaluseid iseloomustava homoloogilisi järjestusi sihtmärk DNA-s. väärtuse suunas. Tm on temperatuur, mille Kui proov või sihtmärk on kaheahelalised, siis juures asub optilise tiheduse nihke keskpunkt. kõigepealt nad denatureeritakse, kas Imetajate genoomide puhul, mis sisaldavad kuumutamisel või töötlemisel aluselises keskmiselt 40% GC paare on DNA sulamis- keskkonnas, seejärel segatakse proovi ja temperatuuriks füsioloogilistel tingimustel ca sihtmärgi üksikahelad kokku ja lastakse 87°C. komplementaarsetel aluspaaridel reassot- DNA, RNA ja oligonukleotiidide perfektsete sieeruda. Seejuures võivad moodustuda nii hübriidide Tm-e saab välja arvutada vastava homodupleksid proovi ja sihtmärgi DNA valemi alusel: ahelate vahel kui ka heterodupleksid proovi ja DNA-DNA hübriidi jaoks sihtmärgi DNA ahelate vahel. Tm=81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) – 0.61 Tekkivate hübriidide stabiilsust mõjutavad (% form) – 500/L järgmised faktorid: ja RNA-DNA hübriidi jaoks 1. Sulamistemperatuur. DNA kaksikahela Tm= 79.8°C + 18.5 (logM) + 0.58 (%GC) – 11.8 kuumutamisel katkevad DNA komple- (%GC)2 – 0.56(%form) – 820/L mentaarseid ahelaid kooshoidvad vesinik- Nendes valemites: sidemed. Kahe täiesti komplementaarse 1. M on monovalentsete katioonide DNA ahela lahutamiseks vajalik energia molaarsus hulk sõltub tervest hulgast faktoritest: 2. %GC on guanosiini ja tsütosiini protsent 2. DNA ahela pikkus: mida pikem on DNA-s dupleks seda rohkem vesiniksidemeid see 3. %form on formamiidi protsent sisaldab ja seetõttu on vaja rohkem energiat hübridisatsiooni lahuses nende lahutamiseks. Kui proovi pikkus on 4. L on dupleksi pikkus aluspaarides juba üle 500bp, siis DNA ahela pikkus Oligonukleotiidide puhul saab ligikaudse Tm-i enam rolli mängi. määramiseks kasutada ka Wallace reeglit: 3. Nukleotiidne koostis: GC paaride vahel Tm (°C) = 2 (A+T) + 4 (G+C) on kolm vesiniksidet ja AT paaride vahel kaks vesiniksidet, seetõttu on suurema GC Hübridisatsiooni stabiilsus sõltub molekulide paaride osakaaluga DNA-d stabiilsemad liigist – stabiilsus väheneb reas: võrreldes sellistega kus AT paaride % on RNA:RNA, RNA:DNA, DNA:DNA. kõrgem. Selleks, et iseloomustada kiirust, mille jooksul 4. Ioonne jõud: Tm tõuseb 16.6°C võrra kui DNA üksikahelad leiavad komplementaarse monovalentsete katioonide (näit. Na+) paarilise ja moodustavad dupleksi kasutatakse kontsentratsioon tõuseb 1 kord soola- reassotsiatsiooni kineetikat. See on määratud spetsiifilise DNA järjestuse algkontsentrat- 1  © 2024 Biotehnoloogia õppetool – Ants Kurg siooni poolt (C0) nukleotiidi moolides liitri Selleks kasutatakse totaalse DNA kõrgelt- kohta ja reaktsiooni ajaga sekundites (t). Kuna korduvate DNA järjestuste suhtes (nagu Alu, reassotsiatsioon on proportsionaalne (C0) ja (t) LINE-1) rikastatud fraktsiooni ja nimetatakse –ga siis on see väärtus (C0t) Nimetatakse ka Cot Cot-1 DNA-ks. (st. DNA mille Cot väärtus on väärtuseks. Standardtingimused on 1.0). temperatuuril 65°C ja Na+ ioonide Proovi ja sihtmärgi vaheline heterodupleks on kontsentratsioonil 300mM NaCl. termodünaamiliselt kõige stabiilsem täieliku Konkureeriv hübridisatsioon paardumise (perfect match) korral. Kui on Kasutatakse DNA kordusjärjestustest tingitud tegemist valepaardumisega (mismatch) kahe tugeva signaali blokeerimiseks. Märgitud proov ahela vahel, siis need vähendavad Tm-i. denatureeritakse ja lastakse reaassotsieeruda Keskmiselt vähendab 1% valepaardumisi kas märkimata totaalse genoomse DNA või (mismatch’e) dupleksi Tm-i umbes 1°C võrra. kõrge korduste arvuga DNA järjestuste suhtes Erinevad võimalused nukleiinhapete rikastatud DNA manulusel. Mõlemal juhul on hübridisatsiooniks proovis asuv kõrgelt korduv DNA tugevas liias Molekulaarhübridisatsioon on üks tänapäeva ja need järjestused assotsieeruvad proovis molekulaardiagnostika põhimeetodeid. leiduvate kordustega blokeerides nende Nukleiinhapete hübridisatsiooniks on palju seostumise hübridisatsiooni käigus. erinevaid võimalusi. Standard ja pööratud hübridisatsioonid Standard Märgitud proov lahuses Märkimata sihtmärk tahkel kandjal Dot-blot Iga märgitud DNA või RNA sageli DNA või RNA fraktsioneerimata kompleks, spotitud oligonukleotiid otse membraanile Southern blot Igasugune proov Kompleksne genoomne DNA (või individuaalsed DNA kloonid) restrikteeritud ja foreesil fraktsioneeritud, kantuna membraanile Northern blot Igasugune proov Kompleksne RNA populatsioon (näit. totaalne rakuline RNA või polüA+RNA) foreesil fraktsioneeritd kantuna membraanile Kromosoomide Tavaliselt märgitud DNA (sageli metafaasis) lüüsitud rakkude kromosoomid In situ genoomne kloon mikroskoobi klaasil hübridisatsioon Kudede Tavaliselt märgitud antisense RNA rakkudes fikseeritud koelõikudest mikroskoobi In situ riboproov või oligonukleotiid klaasil hübridisatsioon Koloonia blot Igasugune proov Rakukolooniad, mis on kasvatatud agarsöötmel ja kantud membraanile Faagi blot Igasugune proov Faagiga infitseeritud bakterikolooniad eraldatud peale agarsöötmel kasvatamist ja kantud membraanile Kloonide Igasugune proov Robotiga membraanile arrayformaadis spotitud hübridisatsiooni kloonid array Pööratud Märgitud sihtmärk lahuses Märkimata proov tahkel kandjal Pööratud dot-blot Kompleksne DNA Membraanile spotitud oligonukleotiidid DNA mikroarray Kompleksne DNA Robotiga mikroskoobi klaasile spotitud DNA kloonid Oligonukleotiid Kompleksne DNA Klaasile spotitud või in situ sünteesitud mikroarrayd oligonukleotiidid 2  © 2024 Biotehnoloogia õppetool – Ants Kurg Ajalooliselt tehti hübridisatsiooni eksperimente fragmendid samal ajal kui sirprakuline alleel kõigepealt vesilahuses, kuid seal on genoomis annab meile ühe 1.4 kb fragmendi. väiksema koopiaarvuga, eriti üksikut koopiat Lisaks mutatsioonanalüüsile saab Southern omavate, geenide, järjestuste kontsentratsioon blot’i kasutada geenide struktuuri ja organi- väga madal ja seetõttu võttis taoline satsiooni uurimisel (näit. geeni koopiaarvu reassotsiatsioon väga kaua aega. Näiteks ß- määramine), kloonimisel, geneetiliste kaartide globiin, mis on genoomis esindatud ühe koostamisel jne. koopiaga, moodustab vaid 0,00005% inimese Northern blot genoomsest DNA-st Erinevalt eelpool kirjeldatud Southern blot’ist Käesoleval ajal kasutatakse tahkele kandjale, kasutatakse Northern blot’i puhul enamasti nitrotselluloosile või nailonile seotud elektroforeesil lahutatud RNA-d. Põhiliselt nukleiinhappeid. kasutatakse Northern bloti meetodit geenide Alternatiiviks klassikalisele hübridisatsioonile ekspressiooni analüüsil ja ka RNA-de pikkuse on nn. pööratud hübridisatsioonid, mille mõõtmiseks.. puhul kandjale kinnitatakse märkimata proov ja Western blot hübridiseeritakse lahuses oleva märgitud Tegelikult ei kuulu Western blot nukleiin- sihtmärk DNA või RNA-ga. hapete hübridisatsiooni meetodite alla, kuid NB! Seega proov ei pea alati olema märgitud, nimekirja täielikkuse huvides olgu ta siin ära pööratud hübridisatsiooni korral märgitakse toodud. Western bloti abil uuritakse valke, mis sihtmärk. lahutatakse elektroforeetiliselt, kantakse filtrile Dot-blot hübridisatsioon ja tuvastatakse vastava valguga seonduvate Siia kuulub ka slot-blot hübridisatsioon. Nende märgitud antikehade abil. puhul kasutatakse restrikteerimata DNA-d. Kromosoomide in situ hübridisatsioon Võib kasutada alleelspetsiifilisi oligonukleo- Geenide ja teiste DNA fragmentide kaardis- tiide, et eristada alleele ühe nukelotiidi tamiseks hübridiseeritakse märgitud DNA positsiooni kaupa. proov in situ denatureeritud kromosomaalse ASO (Alleel-Spetsiifilised Oligonukleotiid) DNA-ga. Valmistatakse kromosoomide proovid on tavaliselt 15-20 nukleotiidi pikad ja metafaasi või prometafaasi preparaat, neid kasutatakse sellistel hübridisatsiooni töödeldakse RNaasi ja proteinaasK-ga, mille tingimustel, et dupleks proovi ja targeti vahel tulemusel saab osaliselt puhastatud kromo- oleks stabiilne vaid täiesti perfektse somaalse DNA, mis denatureeritakse komplementaarsuse korral. NB! ASO proovi formamiidiga. Rakendades erinevaid puhul paikneb muutuv (otsitav) nukleotiid fluorestseeruvaid märkeid on see tehnoloogia proovi keskel. fluorestsents in situ hübridisatsioon ehk FISH. Southern blot hübridisatsioon saanud väga laialt kasutatavaks meditsiinis. (Sir Edwin Mellor Southern-i nime järgi) Koe in situ hübridisatsioon Restrikteeritud (genoomne) DNA lahutatakse mRNA ekspressiooni uurimiseks kudedes. geelelektroforeesil fragmentide pikkuse järgi, Märgitud prooviga hübridiseeritakse koelõi- denatureeritakse, kantakse filtrile ning kude RNAd, mis on tehtud kas parafiin immobiliseeritakse selle külge. Filtrit hübridi- plokkidest või külmutatud kudedest. Eelistatult seeritakse uuritava geeni suhtes spetsiifilise kasutatakse üheahelalist komplementaarset märgitud prooviga. RNA proovi e. riboproovi kuna üheahelalise Southern blot’i on võimalik kasutada näiteks proovi tundlikkus on suurem, sest ei teki mutatsioonanalüüsiks. Kui tekib patogeenne probleeme homodupleksitega. Riboproovid, mutatsioon, siis selle tulemusel sageli kas kaob mis on komplementaarsed mRNA-le on tuntud või tekib restriktsioonisait. Näiteks sirprakulise kui antisense riboproovid. Kasutatakse nii aneemia korral põhjustab ühe nukleotiidi radioaktiivseid märgiseid kui ka fluorestsentsi, asendus (A→T) ß-globiini geeni kuuendas mida saab siis vastavalt jälgida fluorestsents- koodonis missense mutatsiooni (Glu→Val), mikroskoobi abil. mille tagajärjel kaob koodoneid 5 kuni 7 haarav Koloonia hübridisatsioonid MstII restriktsioonisait. Lähim MstII sait asub VT. Kloonimise loeng 1.2 kb upstream 5’ piirnevas regioonis ja 0.2 kb Pööratud hübridisatsioonid downstream esimese introni 3’ lõpus. Mõlemad Kasutatakse robotiga (microarrayer) tehtud restriktsiooni saidid on hästi konserveerunud. filtreid ja DNA mikroarray’sid (DNA kiipe), Seega, kui meil on inimese ß-globiini DNA mille puhul märkimata proov kantakse 2D proov, siis on selle abil võimalik eristada struktuurina tahkele kandjale ja hübridi- normaalse ßA-globiini ja mutantse ßS-globiini seeritakse lahuses oleva märgitud target DNA- alleele. Lõigates inimese genoomset DNA-d ga. VT: Ülegenoomsete meetodite loeng. MstII-ga saame normaalsel juhul 1.2 kb ja 0.2kb 3  © 2024 Biotehnoloogia õppetool – Ants Kurg Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) keemiliselt modifitseeritud Taq polümeraasi. Ensüüm satub reaktsioonisegusse alles Polümeraasi ahelreaktsioon on tänapäeva kuumutamisel, mille käigus vaha sulab või molekulaarbioloogide üks põhilisi töö- aktiveerub kuumutamise tagajärjel alles peale vahendeid, leides rakendamist mitte ainult antikehast või keemilisest modifikatsioonist fundamentaaluuringute juures vaid ka vabanemist. kliinilises- ja näiteks kohtupraktikas. Touch-down PCR: Reaktsiooni spetsiifilisuse Kary Mullis sai PCR-i meetodi eest 1993. tõstmiseks tehakse esimesed tsüklid kõrgemal aastal Nobeli keemia preemia. temperatuuril ja siis alandatakse annealing Enne kui asuda PCR-i tegema on vaja teada temperatuuri. vastavaid DNA järjestusi, mille alusel disainida praimerid, mis on tavaliselt 15-25 meersed PCR-il kasutatava DNA polümeraasi puhul on sünteetlised oligonukleotiidid. olulised: PCR ise koosneb kolmest etapist: 1. Termostabiilsus JOONIS 2. Ekstensioonireaktsiooni kiirus = ühes 1. Denaturatsioon. inimese genoomse DNA sekundis ühe molekuli ensüümi poolt puhul tüüpiliselt 93-95°C polümeriseeritud dNTP-de arv 2. Annealing e. praimerite seostumine DNA- 3. Protsessiivsus (vt. ensüümide loeng) le toimub tavaliselt temperatuuril 50-70°C 4. Reaktsiooni täpsus (fidelity) mis näitab sõltuvalt praimerite Tm-ist. Tavaliselt valesti lülitatud dNTP-de arvu täpselt võetakse see ca 5°C alla arvutatud Tm-i. lülitatud nukleotiidide suhtes. 3. DNA süntees. Tavaliselt 70-75°C juures. PCR-i eelised Mida arvestada praimerite disainimisel? 1. Kiire ja lihtne kasutada. Tavaliselt kulub 1. Selleks, et saaks kasutada mõistlikke fragmendi amplifitseerimiseks 2-3 tundi, kinnitumistemperatuure (annealing temp.) moodsamate meetodite puhul ka vähem. tuleks praimerid teha 20–30 aluse pikkused 2. Väga tundlik. Võimaldab näit. kasutada ja sulamistemperatuuriga (Tm) 50–70°C. vaid ühes rakus sisalduvat DNA-d. Kuid Kui võimalik võiks paaris kasutatavad väga suure tundlikkuse tõttu on alati oht praimerid olla sarnase Tm-iga. amplifitseerida üles ebasoovitavaid Sulamistemperatuuride arvutamise kohta järjestusi ja seetõttu tuleb suurt tähelepanu leiab arvukalt informatsiooni kirjandusest. pöörata võimalike saastus allikate 2. Praimerite GC sisaldus peaks olema 50– vältimisele. 55%. 50%-st palju väiksema GC sisaldu- 3. Robustne. PCR-i saab teha kasutades sega praimereid tuleks pikendada üle 20 algmaterjalina väga erinevaid materjale. aluse, et saavutada vajalik sulamis- temperatuur üle 50°C. PCR-i puudused 3. Vältida tuleks üksikute (või kahe) 1. PCR-i põhiliseks puuduseks on vajadus nukleotiidi kordusi, eriti praimeri 3`otsas. eelnevalt teada DNA järjestust mille alusel Viimane võib põhjustada sekundaarseid saab disainida PCR-i praimerid. hübridisatsioone. 2. PCR-i fragmendid jäävad suhteliselt lühi- 4. Kui võimalik, siis võiks praimeri 3`otsa keseks, pikki fragmente on väga raske stabiliseerimiseks asuda seal G või C saada. nukleotiid. 3. DNA replikatsiooni käigus tekivad vead, Disainimisel tuleks vältida sekundaar- sest tavaline Taq DNA polümeraas ei oma struktuure ning di- ja oligomeere moodus- “proof-reading” mehhanismi. tavaid praimereid. Selleks on hea kasutada praimerite disainimise arvutiprogramme. PCR-i kasutusvõimalused Mutatsioonanalüüs: Alleel-spetsiifiline PCR Erinevad PCR-i võimalused: ARMS (Amplification refractory mutation Nested PCR: esimese amplifikatsiooni pro- test). dukti kasutatakse teise amplifikatsiooni Praimerid disainitakse nii, et oleks võimalik template’na, kasutades uut komplekti prai- eristada alleele. Kui molekulaarhübridisat- mereid, mis asuvad esimesest praimerpaarist sioonil kasutatavate ASO proovide puhul asub seespool. mismatch nukelotiid järjestuse keskel, siis Hot-start PCR: ensüüm ja puhver lisatakse PCR-i puhul asub see praimeri 3’otsas, kuna eraldi ja hoitakse neid lahus kuni reaktsiooni polümeraasi töö on otseselt sõltuv 3’ otsa alguseni. Selleks kasutati varem näit. vaha, täpsest paardumisest. mille peale pipeteeriti ensüüm. Tänapäeval kasutatakse kas spetsiifilise antikehaga või 4  © 2024 Biotehnoloogia õppetool – Ants Kurg Geeni süntees PCR-iga Algtase (baseline) – PCR algtsüklid, kui Geeni süntees PCR-iga on kiirem ja odavam kui fluorestsentssignaali tugevus oluliselt ei muutu. osaliselt kattuvate oligonukleotiidide vahede Läviväärtus (threshold) – Fluorestsents- täitmine DNA polümeraasiga ja katkestuste signaali tase, mida kasutatakse lävitsükli CT sulgemine T4 DNA ligaasiga. määramiseks. Läviväärtus peab olema Kasutatakse osaliselt kattuvaid oligonuk- kõrgemal algtasemest kuid piisavalt madalal, et leotiide A ja B, mis täidetakse kasutades 3’OH see jääks PCR’i eksponentsiaalsesse faasi. rühmasid PCR-i DNA sünteesi faasis. Lisatakse Lävitsükkel, CT (threshold cycle) – PCR uus paar oligonukleotiide (C ja D), mis kattuvad tsükkel, millal fluorestsentssignaali tugevus osaliselt esimese PCR-i produkti lõppudega ja ületab läviväärtuse. tehakse teine PCR jne. Negatiivne kontroll (NTC, no template control) – Katsepunkt, mis ei sisalda DNAd. PCR-i kasutamine DNA sekveneerimisel Märklaudjärjestus (template) – Nukleotiidne Ehk tsükliline sekveneerimine järjestus, mida soovitakse tuvastada ja mõõta. VT: Sekveneerimise loeng. Passiivne referentsvärv (passive reference) – Fluorestsentsvärv, mis toimib igas katsepunktis PCR-i kasutamist suunatud mutageneesil sisemise referentsväärtusena, mille suhtes VT: Ensüümide loeng normaliseeritakse reportervärvi signaal. Normaliseerimine on vajalik reaktsioonimahu PCR-i kasutamine kriminalistikas või kontsentratsiooni kõikumiste tasanda- STR markerite (mikrosatelliitide) genotüpi- miseks. seerimine. PCR » automatiseeritud fragment- Reportervärv (reporter dye) – TaqMan proovi analüüs. Praegu kasutatakse ka Eestis 5’ otsa kinnitatud fluorestseeruv molekul. Combined DNA Index System (CODIS) Reportervärv võimaldab tuvastada meid süsteemi lookuseid. huvitava järjestuse amplifitseerumist PCR’i käigus. Reaalaja kvantitatiivne PCR (Real-time Standard (standard, calibrator, reference) – quantitative PCR või qPCR) Teadaoleva koopiaarvuga sihtmärkjärjestust Paljude PCR-i rakenduste puhul on vaja teada sisaldav DNA lahus või katsepunkt algmaterjali kogust, näit. DNA koopiaarvu meid huvitavas lookuses. Kvantiseerimiseks on qPCR-i puhul kasutatakse enamasti kaht üritatud kasutada erinevaid meetodeid, näit. võimalust: amplifitseerides meid huvitavat produkti koos Esiteks kaheahelalise DNA-ga seonduvaid mingi meile teada oleva koguse marker- värve, näit. SYBR Green. Reaktsioonisegusse järjestusega, kuid sellise nn. sisemise markeriga lisatud vaba SYBR Green värv ei fluorestseeru. on rahuldavat tulemust raske saavutada, sest Fluorestsentssignaali annab ainult kahe- tavaline PCR ei ole kvantitatiivne meetod. ahelalise DNA-ga seondunud värv. Meetod põhineb sellel, et mida rohkem tekib Lahendus on reaalaja kvantitatiivne PCR. amplifikatsiooni käigus kaheahelalist DNA-d, qPCR-i puhul eristatakse enamasti kaht seda rohkem SYBR Green’i sellega seondub meetodit: ning seda tugevama fluorestsentssignaali 1.Absoluutse kvantiseerimise (AQ) meetod. saame, mida siis kvantiseeritakse. See meetod võimaldab kalibratsioonikõvera abil tuvastada meid huvitava nukleiinhappe Teine võimalus on kasutada Taqman proove. koguhulka. Kalibratsioonikõvera saamiseks See on PCR-i segusse lisatav kolmas praimer, kasutatakse teadaoleva kontsentratsiooniga mille ühes otsas on fluorestsentsmärgis ja teises DNA lahuseid. Tavaliselt kasutatakse nn. “summutaja” (quencher). Kui see praimer kümnekordsete lahjenduste rida, mis koosneb on terve siis kustutatakse tekkiv fluorestsents viiest kuni seitsmest lahjendusest. signaal “summutaja” poolt, mis asub füüsiliselt 2.Teine enamkasutatav qPCRil põhinev fluorestsentsmärgise lähedal. PCR-i reaktsiooni kvantiseerimismeetod, relatiivne kvantiseeri- korral lagundatakse Taqman proov (praimer) mine (RQ) ehk suhtelise koguse määramine, ei Taq DNA polümeraasi 5’-3’ eksonukleaasse võimalda tuvastada uuritava molekuli aktiivsuse poolt tükkideks, mille tulemusel koguhulka, vaid selle muutust nn. endogeense fluorestsents märgis vabaneb ja annab referentsjärjestuse suhtes. ergastamisel fluorestsents signaali. Kasutatakse qPCR-i aparatuuri ning katse Fluorestsents signaali kasv reaktsiooni segus on käigus saadakse tulemina ajapunkt, millal proportsionaalne tekkiva amplifikatsiooni amplifitseeritud märklaud-järjestuse hulk ületas produkti hulgaga. teatava läviväärtuse. Mõisted VT: Joonis 5  © 2024 Biotehnoloogia õppetool – Ants Kurg TaqMan süsteem fluorestsentssignaal tekkis või siis ei tekkinud. Kasutatakse nii mutatsioonanalüüsil kui ka Fluorestsentssignaali andnud tilgakeste arv genotüpiseerimisel. Põhineb Taq DNA näitab, et nendes tilgakestes oli DNA template polümeraasi 5’-3’ eksonukleaassel aktiivsusel olemas ning see omakorda näitab DNA Reaal-aja kvantitatiivse PCR-i teema kontsentratsiooni uuritavas lahuses. kordamiseks võite vaadata järgmist videot: Võrreldes tavalise reaalaja PCR-iga on ddPCR- https://www.youtube.com/watch?v=YhXj5Yy4ksQ il järgmised eelised: 1) Antud meetod ei põhine standardkõverate ja ddPCR referentsproovide kasutamisel Lisaks tavapärasele reaalaja kvantitatiivsele 2) ddPCR-i reaktsioone ei mõjuta mitmesuguste PCR-ile on viimasel ajal järjest rohkem leidnud võimalike inhibiitorite sisaldus PCR-i segus. kasutust uue põlvkonna reaalaja PCR-i meetod 3) Meetod on väga tundlik võimaldades väga digitaalne PCR vedelikutilgas (digital- harva esinevate sihtmärk järjestuste droplet PCR- ddPCR). detekteerimist reaktsioonisegus. Reaktsioonisegu sisaldab samu komponente kui 4) Samuti võimaldab ddPCR meie poolt TaqMan PCR, kuid see jagatakse spetsiaalse soovitud sihtmärk molekulide absoluutset aparatuuri abil väikestesse vedelikutilkadesse kvantiseerimist. ruumalaga ca 1nl üritades saavutada olukorda, Puudusena võib välja tuua vaid suhteliselt mille puhul igasse tilka satub vaid üks template keeruka ja kalli aparatuuri. Kahe meetodi DNA molekul või ei sattu ühtki. Selliselt qPCR-i ja ddPCR-i võrdlemiseks VT: jagatakse reaktsioonisegu ca 20000 tilgaks. Siis https://www.youtube.com/watch?v=R92_RwoRSTk amplifitseeritakse neid vedelikutilkasid Kuidas täpselt ddPCR-i tehakse ning milleks sarnaselt tavalisele reaalaja PCR-ile ning seda kasutatakse VT siit: loetakse kokku mitme tilga puhul https://www.youtube.com/watch?v=Qwma-1Ek-Y4 PCR-i kasutamise võimalusi Genotüpiseerimine RFLP-d; STR-id Mutatsioonide uurimine Genoomsete mutatsioonide uurimine ja RT-PCR Punktmutatsioonide Alleel-spetsiifiline amplifikatsioon (ARMS) detekteerimine cDNA kloonimine Aminohappelisest järjestusest (degenerate oligonucleotide primed-DOP-PCRiga; cDNA lõppude kloonimisest RACE abil; vähesest materjalist cDNA raamatukogud Genoomse DNA kloonimine DNA perekonna uute liikmete kloonimine DOP-PCRiga; ühe-raku PCR ja kogu genoomi amplifikatsioon, subgenoomne amplifikatsioon DOP-PCRi või linker praimeeritud PCRiga Genoomi walking Pööratud (inverse) PCR; bubble linker (vektorett) PCR, Alu-PCR DNA sekveneerimine Kaheahelalise DNA sekveneerimiseks (otse) või kloonimiseks, millele järgneb sekveneerimine; tsükliline sekveneerimine In vitro mutagenees Kasutades 5` add-on mutageneesi rekombinantse PCRi produkti genereerimiseks; kasutades mismatch praimereid muutmaks kindlaksmääratud nukleotiidi Geeniekspressiooni uuringud RT-PCR; differential display r 6