Electroforesis de Ácidos Nucleicos 5.2

Electroforesis

• Es una técnica separativa usada para separar ácidos nucleicos y proteínas.
• La separación de macromoléculas depende de dos variables: carga y masa.
• Las moléculas se separan basándose en su velocidad de migración en un campo eléctrico.
• Un electrodo repele las moléculas, mientras que el otro las atrae.
• La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio.
• Esto hace que se desplacen cuando están en un campo eléctrico hacia el polo con carga opuesta.
• La fricción del gel (agarosa) afecta la separación de moléculas, principalmente ADN, según su tamaño.
• En electroforesis, los ácidos nucleicos con carga negativa migran hacia el polo positivo (ánodo).
• La electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel o matriz porosa, basada en su tamaño o peso molecular.
• El movimiento es generado por el campo eléctrico.

Concentración de geles de Agarosa

• Los geles de agarosa pueden tener diferentes concentraciones.
• Geles más concentrados tienen poros más pequeños, lo que permite separar mejor fragmentos pequeños.
• Geles menos concentrados tienen poros más grandes, permitiendo separar mejor fragmentos grandes.

Componentes de la Electroforesis

• Agarosa: Polímero natural extraído de algas, usado para crear un gel. La obtención implica una suspensión en un tampón que se calienta hasta disolución y luego se vierte en moldes con peines.
• El gel se enfría a temperatura ambiente hasta solidificar, y su densidad depende de la concentración de agarosa.
• Peine: Se utiliza para formar los pocillos en el gel, donde se colocan las muestras. Peines finos dan bandas más precisas, mientras que los gruesos menos.
• Tampón: Proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH constante. Aporta fuerza iónica para aumentar la conductancia del ADN.
• Los tampones de electroforesis para ADN bicatenario incluyen TAE y TBE, con diferentes proporciones de componentes.
• Marcadores de ADN: ADN de tamaño conocido (de peso molecular), colocado en el extremo del gel, usado para comparar la migración y estimar tamaños.

Efectos perjudiciales del calor en la electroforesis

• El calor generado durante la electroforesis puede causar efectos negativos.
• Aumenta la tasa de difusión de los iones en la muestra y el tampón, ensanchando las bandas.
• Puede crear corrientes de convección en la muestra, causando mezcla de las bandas.
• Se produce inestabilidad térmica y se disminuye la viscosidad del tampón, reduciendo su resistencia al medio.

Visualización de los ácidos nucleicos

• Se usa bromuro de etidio para visualizar ADN en gel.
• Se intercala en el ADN, y emite fluorescencia bajo luz UVA. Es tóxico.
• Para visualizar hay otros colorantes alternativos como Safe View.
• Se desconectan los cables y el gel se analiza en un transiluminador UV y se fotografían los resultados.

Pasos para realizar la electroforesis

• Los pocillos se cargan con las muestras usando una micropipeta.
• Se colocan marcadores de ADN conocido y controles positivos/negativos.
• Se conecta el equipo para aplicar el voltaje apropiado.
• El ADN se mueve hacia el polo positivo (ánodo) y su migración se sigue por el avance del colorante de carga.

Datos de electroforesis de ejemplo (Imagen 16)

• Se muestran fragmentos de ADN (marcadores o estándares).
• Los tamaños se indican en pares de bases (pb).

Datos de electroforesis de ejemplo (Imagen 21)

• Se muestran los fragmentos separados según sus tamaños en pb.