Chromatografické separačné metódy

Schopnosť metódy rozdeliť látky na základe jednej alebo viacerých špecifických vlastností.

Miera separácie jednotlivých zložiek zmesi, ktorá vyjadruje mieru rozlíšenia jednotlivých zložiek od seba.

Hodnotí teoretické možnosti daného separačného systému a používa sa na porovnanie viacerých analytických separácií.

Dvojfázový systém, kde sa analyt pohybuje medzi dvoma fázami a dochádza k ustáleniu rovnováhy jeho distribúcie.

Pomer koncentrácií analytu vo fázach, ktorý sa ustáli, keď sa rýchlosť prestupu častíc analytu cez rozhranie dvoch fáz vyrovná.

Rozdeľovanie látky medzi dve fázy: rozpúšťanie v kvapalnej fáze, difúzia v plynnej fáze, adsorpcia na povrchu tuhej fázy, chemisorpcia na fázovom rozhraní alebo vstup molekúl do pórov.

Výber separačného systému, kde prevláda jeden mechanizmus separácie.

Použitie rôznych prostredia (elektrolyty, prídavné látky) ovplyvňujúce migračnú rýchlosť iónov.

Analyty sa navzájom nereagujú a ich koncentrácie sa menia nezávisle od seba.

Rozdielne vlastnosti látok zmiešaných vo vzorke umožňujú ich oddelenie v chromatografickej kolóne.

Mobilná fáza (plynná, kvapalná alebo nadkritická tekutina) prenáša analyty cez stacionárnu fázu, ktorá je umiestnená v kolóne alebo tenkej vrstve na pevnom povrchu.

Analyty interagujú so stacionárnou fázou a rozdeľujú sa medzi mobilnú a stacionárnu fázu. Čím silnejšia interakcia so stacionárnou fázou, tým pomalšie sa pohybuje analyt v kolóne.

V dôsledku opakovanej interakcie s mobilnou a stacionárnou fázou a rozdielnej rýchlosti pohybu, sa analyty postupne oddeľujú do samostatných zón.

Zložky s nižšou afinitou k stacionárnej fáze sa dostávajú na koniec kolóny skôr ako zložky s vyššou afinitou.

Chemicky a konformačne odlišné analyty sú brzdené v kolóne rôznou rýchlosťou, čo umožňuje ich oddelenie.

Chromatografické metódy sa klasifikujú podľa typu mobilnej fázy, usporiadania fázového systému a spôsobu zavádzania vzorky.

Typ chromatografie, v ktorej sa separácia zložiek vzorky uskutočňuje na základe ich rôznej rozpustnosti v stacionárnej fáze (kvapalnej) a ich rozpustnosti a difúzie v mobilnej fáze (kvapalnej alebo plynnej).

Typ chromatografie, v ktorej sa separácia zložiek vzorky uskutočňuje na základe ich afinity k stacionárnej fáze. Stacionárna fáza je schopná viazať zo vzorky iba určité zložky, ktoré majú s ňou špecifický vzťah.

Typ chromatografie, v ktorej sa separácia zložiek vzorky uskutočňuje na základe ich rôznej veľkosti molekúl. Zložky sa separujú podľa veľkosti svojich molekúl na pórovitej stacionárnej fáze alebo géli. Menšie molekuly sa vo vnútorných priestoroch zdržujú dlhšie.

Typ chromatografie, v ktorej sa separácia zložiek vzorky uskutočňuje na základe ich rôznej schopnosti adsorbovať sa na povrch stacionárnej fázy (tuhej látky).

Typ chromatografie, v ktorej sa separácia zložiek vzorky uskutočňuje na základe elektrostatických interakcií medzi funkčnými skupinami stacionárnej fázy (ionexu) a iónmi analytov v roztoku.

Chromatografická metóda, pri ktorej je stacionárna fáza umiestnená v rúrke (kolóne) a mobilná fáza preteká cez voľné priestory medzi časticami stacionárnej fázy.

Typ chromatografie, ktorá sa dá vykonávať v kolóne alebo v plošnom usporiadaní.

Typ chromatografie, kde sa ako mobilná fáza používa plyn.

Zariadenie zodpovedné za konštantný a presný prietok mobilnej fázy cez chromatografickú kolónu.

Používa sa na presné a opakovateľné zavedenie vzorky do chromatografickej kolóny.

Dôležitá súčasť HPLC, ktorá obsahuje stacionárnu fázu a umožňuje separáciu zložiek vzorky.

Materiály, z ktorých sa vyrábajú chromatografické kolóny v HPLC, musia odolávať vysokým tlakom.

Dĺžka a priemer chromatografickej kolóny závisí od rozmeru častíc náplne a požiadaviek na analýzu.

Používa sa na separáciu zložiek vzorky na základe ich rozdielnej afinity k stacionárnej a mobilnej fáze.

Zrnité materiály s rôznou rozmerovou charakteristikou, používané v HPLC na separáciu látok.

Kolóny s veľmi malým priemerom, ktoré sa používajú na separáciu malých objemov vzoriek.

Zvýšená rýchlosť mobilnej fázy počas chromatografie spôsobuje rozšírenie zón separovaných látok. Molekuly látok sa vzďaľujú od seba kvôli rýchlemu toku mobilnej fázy.

Chromatografický rozlišovací faktor (Rij) je miera separácie dvoch susedných látok v chromatograme. Vyjadruje, do akej miery sa tieto látky od seba oddelia.

Kvapalinová chromatografia (LC) je metóda na separáciu zložiek v zmesi látok. Používa sa na analýzu kvapalných vzoriek alebo roztokov tuhých látok.

LC umožňuje separáciu rôznych typov látok, vrátane organických a anorganických, polárnych a nepolárnych, disociovateľných a nedisociovateľných.

Vzorka sa vstrekuje do prúdu mobilnej fázy a unáša sa cez kolónu s stacionárnou fázou. V interakcii s mobilnou a stacionárnou fázou sa látky separujú.

Výber zloženia stacionárnej a mobilnej fázy ovplyvňuje separáciu a elučné charakteristiky látok. Optimálny systém separácie je závislý na zložení analyzovanej zmesi.

Na detekciu separovaných zón sa v LC používa detektor. Získaný chromatografický záznam slúži na kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu zmesi.

V LC sa na separáciu látok využívajú adsorpcia, rozdeľovanie, výmena iónov, separácia podľa veľkosti a špecifické interakcie. V praxi sa často uplatňuje viac mechanizmov súčasne.

UHPLC (Ultra-vysokoúčinná kvapalinová chromatografia) je modernou technológiou, ktorá využíva kratšie kolóny s menším priemerom a menšími časticami sorbentu. Tým sa dosahuje rýchlejšia separácia pri vyšších tlakoch, čo umožňuje vysokú účinnosť, citlivosť a skrátenie času analýzy.

Odplyňovanie je kľúčové v HPLC a UHPLC. Bublinky v mobilnej fáze spôsobujú odchýlky v prietoku a nereprodukovateľnosť výsledkov. Používajú sa metódy ako ultrazvuk, vákuum, prebublávanie inertným plynom alebo membránové odplyňovanie.

Vysokotlakové čerpadlo je kľúčové zariadenie v HPLC/UHPLC. Je zodpovedné za tlakový gradient, ktorý tlačí mobilnú fázu cez kolónu a zabezpečuje rýchly a efektívny transport. Čerpadlo musí byť robustné a presné, aby sa zachovala stabilita tlaku a jednotnosť prietoku.

Detektor identifikuje a kvantifikuje analyty eluujúce z chromatografickej kolóny. Bežné typy detektorov sú UV/VIS, fluorimetrické, hmotnostné a elektrochemické. Výber detektora závisí od vlastností analytu a cieľa analýzy.

Zariadenie na dávkovanie vzoriek v HPLC sa používa na presné a opakovateľné dávkovanie vzoriek do separátora. Umožňuje presné ovládanie objemu vloženého vzorku, čo je dôležité pre reprodukovateľnosť výsledkov.

Chromatografická kolóna obsahuje stacionárnu fázu, ktorá interaguje s analytom a umožňuje jeho separáciu. Výber typu kolóny a stacionárnej fázy je kľúčový krok v procese optimalizácie separácie.

Základné zariadenie na HPLC sa dá doplniť o predkolónu (slúži na ochranu hlavnej kolóny pred kontamináciou), termostat (zabezpečuje stabilnú teplotu kolóny) alebo aj automatické dávkovače.

Vysokotlakové čerpadlo, dávkovač vzoriek a zber frakcií sú riadené riadiacou jednotkou HPLC. To umožňuje automatizáciu a kontrolu celého separačného procesu. Riadiaca jednotka tiež umožňuje sledovanie a vyhodnocovanie výsledkov analýzy.