Biologia Molecolare: Replicazione e PCR
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Questions and Answers

Quale direzione specifica la polimerasi quando sintetizza un nuovo filamento di DNA?

  • 5' -> 5'
  • 5' -> 3' (correct)
  • 3' -> 5'
  • 3' -> 3'

Quale direzione specifica il filamento stampo del DNA quando viene letto durante la replicazione?

  • 5' -> 3' (correct)
  • 3' -> 3'
  • 3' -> 5'
  • 5' -> 5'

Quale è il ruolo del primer nella replicazione e nella PCR?

  • Il primer è un filamento di DNA che si lega alla DNA polimerasi
  • Il primer è un enzima che separa i due filamenti di DNA
  • Il primer funge da punto di partenza per la DNA polimerasi (correct)
  • Il primer è un filamento di DNA che si lega a una specifica sequenza di DNA e ne permette la replicazione

Quale delle seguenti affermazioni è vera riguardo alla PCR?

<p>La PCR è un processo che copia solo una piccola parte specifica di una molecola di DNA. (A)</p> Signup and view all the answers

Quale enzima viene utilizzato nella PCR per sintetizzare nuovo DNA?

<p>DNA polimerasi (D)</p> Signup and view all the answers

Perché la DNA polimerasi utilizzata nella PCR deve essere termostabile?

<p>Perché la PCR viene condotta a temperature molto elevate (B)</p> Signup and view all the answers

Quale dei seguenti non costituisce un'applicazione tipica della PCR?

<p>Produrre farmaci (B)</p> Signup and view all the answers

Qual è la differenza principale tra la replicazione del DNA e la PCR?

<p>La replicazione del DNA si verifica in vivo, mentre la PCR si verifica in vitro. (D)</p> Signup and view all the answers

Cosa determina la Tm di un primer?

<p>La sequenza del primer (B), La lunghezza del primer (C)</p> Signup and view all the answers

Quale formula è usata per calcolare la Tm di un primer?

<p>Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C (A)</p> Signup and view all the answers

Qual è la Tm del primer 1, 5’ CTTTTGGCATAGACCACATGCCA?

<p>58.6°C (B)</p> Signup and view all the answers

Quale è la temperatura di annealing per i due primers forniti nel testo?

<p>52.1°C (C)</p> Signup and view all the answers

Perché è importante evitare sequenze ripetute invertite in un primer?

<p>Possono causare la formazione di strutture secondarie che rendono il primer non funzionale (C)</p> Signup and view all the answers

Quali sono i potenziali problemi se la Ta dei due primers è molto diversa?

<p>Amplificazione asimmetrica (A), Formazione di dimeri dei primer (C)</p> Signup and view all the answers

Qual è la possibile causa della formazione di dimeri di primer?

<p>Sequenze complementari fra i primers (C)</p> Signup and view all the answers

Qual è il corretto range di temperatura di annealing per i due primers forniti nel testo?

<p>51.1°C - 53.6°C (A)</p> Signup and view all the answers

Quale componente nella tipica miscela di reazione PCR è responsabile della denaturazione del DNA?

<p>Calore (D)</p> Signup and view all the answers

Quale è il ruolo dei primer nella reazione PCR?

<p>Fornire il punto di partenza per la replicazione del DNA (D)</p> Signup and view all the answers

Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alla PCR?

<p>La PCR utilizza una polimerasi che è attiva a temperature elevate. (A)</p> Signup and view all the answers

Quale è la funzione del 10X PCR Buffer?

<p>Controllare il pH della reazione (D)</p> Signup and view all the answers

Quale è la funzione dei dNTPs nella reazione PCR?

<p>Fornire i nucleotidi necessari alla polimerasi (A)</p> Signup and view all the answers

Quale componente determina la quantità di DNA prodotto al termine della reazione PCR?

<p>La quantità di DNA stampo iniziale (C)</p> Signup and view all the answers

In quale fase della reazione PCR avviene la replicazione del DNA?

<p>Allungamento (A)</p> Signup and view all the answers

Quale componente è responsabile della sintesi di nuove copie di DNA durante la PCR?

<p>Polimerasi (D)</p> Signup and view all the answers

Qual è la regione di interesse che viene amplificata nella PCR?

<p>La sequenza di DNA tra il primer forward e il primer reverse (A)</p> Signup and view all the answers

Quali sono i tre passaggi principali di un ciclo di PCR?

<p>Denaturazione, annealing, estensione (D)</p> Signup and view all the answers

Quale temperatura è utilizzata per la denaturazione del DNA durante la PCR?

<p>Circa 95°C (C)</p> Signup and view all the answers

Quale temperatura è ottimale per l'annealing dei primer durante la PCR?

<p>Circa 55°C (A)</p> Signup and view all the answers

Quale temperatura è ottimale per l'estenzione del DNA durante la PCR?

<p>Circa 72°C (D)</p> Signup and view all the answers

Quale enzima principale viene utilizzato nella PCR?

<p>DNA polimerasi (A)</p> Signup and view all the answers

Qual è lo scopo dei primer nella PCR?

<p>Fornire un punto di inizio per la DNA polimerasi (B)</p> Signup and view all the answers

Cosa succede al numero di copie del DNA bersaglio durante ogni ciclo di PCR?

<p>Raddoppia (B)</p> Signup and view all the answers

Qual è il ruolo del 'minimum stem size' nella progettazione dei primer?

<p>Determina la stabilità del primer (A)</p> Signup and view all the answers

Qual è il ruolo del 'minimum 3’ overlap' nella progettazione dei primer?

<p>Determina la specificità del primer (C)</p> Signup and view all the answers

Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alla primabilità dei primer?

<p>La primabilità è la capacità del primer di legarsi al DNA stampo. (A)</p> Signup and view all the answers

Quale fattore influenza maggiormente il numero di copie di DNA bersaglio ottenute dopo un dato numero di cicli di PCR?

<p>L'efficienza della DNA polimerasi (D)</p> Signup and view all the answers

Qual è il vantaggio principale della PCR rispetto ad altre tecniche di amplificazione del DNA?

<p>È più sensibile (D)</p> Signup and view all the answers

Quale delle seguenti applicazioni è possibile grazie alla PCR?

<p>Tutte le precedenti (A)</p> Signup and view all the answers

Qual è la temperatura di denaturazione del DNA durante il ciclo della PCR?

<p>94°C (A)</p> Signup and view all the answers

Dopo quanti cicli di PCR si ottengono 8 molecole di DNA, dato che si inizia con una molecola?

<p>3 cicli (B)</p> Signup and view all the answers

Quale fase della PCR si svolge a 72°C?

<p>Estensione (B)</p> Signup and view all the answers

Qual è l'obiettivo principale della PCR?

<p>Amplificare specifiche sequenze di DNA (C)</p> Signup and view all the answers

Quale delle seguenti fasi NON è parte della PCR?

<p>Traspirazione (A)</p> Signup and view all the answers

Qual è la temperatura di denaturazione nel processo della PCR?

<p>94°C (D)</p> Signup and view all the answers

Nella PCR, quale fase avviene dopo la denaturazione?

<p>Annealing (C)</p> Signup and view all the answers

Durante quale fase della PCR viene sintetizzato il nuovo DNA?

<p>Estensione (A)</p> Signup and view all the answers

Quale delle seguenti affermazioni è corretta riguardo alla temperatura di estensione nella PCR?

<p>È di 72°C (B)</p> Signup and view all the answers

Quanto è importante la fase di denaturazione nella PCR?

<p>È fondamentale per separare i filamenti del DNA (B)</p> Signup and view all the answers

Quante cicli sono tipicamente eseguiti in una PCR?

<p>Dieci (C)</p> Signup and view all the answers

Qual è l'output finale desiderato della PCR?

<p>DNA amplificato (C)</p> Signup and view all the answers

Quale dei seguenti passaggi è incluso nel ciclo della PCR?

<p>Denaturazione e annealing (B)</p> Signup and view all the answers

Flashcards

Tm primer

Temperatura di melting, dipende dalla lunghezza e sequenza degli primers.

Formula Tm

Tm = 4(G+C) + 2(A+T)°C, usata per calcolare la Tm dei primers.

T annealing (Ta)

Temperatura di annealing, 2-5°C sotto la più bassa Tm dei primers.

Amplificazione asimmetrica

Si verifica quando i primers hanno Tm molto diverse.

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Dimeri di primers

Amplificazione indesiderata causata da sequenze complementari tra primers.

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Sequenze ripetute invertite

Sequenze che possono ripiegarsi su se stesse, creando problemi di amplificazione.

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PCR

Reazione a catena della polimerasi, metodo per amplificare specifiche sequenze di DNA.

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Progettazione primers

Processo di creazione di primers specifici per amplificare sequenze target nel DNA.

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Polimerasi

Enzima che sintetizza il DNA in direzione 5' a 3'.

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Direzione di sintesi

La polimerasi sintetizza il DNA dalla estremità 5' all'estremità 3'.

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DNA stampo

La molecola di DNA su cui la polimerasi lavora durante la PCR.

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Primer

Sequenze di RNA o DNA che iniziano la sintesi durante la PCR.

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DNA polimerasi termostabile

Forma di polimerasi resistente al calore utilizzata nella PCR.

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Oligonucleotide

Sequenza breve di nucleotide, usata come primer nella PCR.

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Replica del DNA

Processo di duplicazione del DNA identico.

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Denaturazione

Processo in cui il DNA si separa a 94°C.

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Annealing

Fase in cui gli primer si legano al DNA.

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Estensione

Fase in cui si sintetizza nuovo DNA a 72°C.

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Cicli PCR

Processo che si ripete per amplificare DNA.

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Temperatura di denaturazione

Temperatura di 94°C necessaria per separare il DNA.

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Temperatura di estensione

Temperature di 72°C per la sintesi del DNA.

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Moltiplicazione del DNA

Dopo 3 cicli PCR, si ottengono 8 molecole di DNA.

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Nuovo DNA

DNA amplificato creato attraverso il processo PCR.

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Temperatura di annealing

La temperatura ottimale per legare i primers durante la PCR.

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Cicli di PCR

Fasi ripetute di separazione e annealing dei filamenti di DNA.

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Amplificazione esponenziale

Aumento esponenziale del numero di copie di DNA.

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Complementarietà

Il legame tra basi nucleotidiche di DNA con arrangiamenti specifici.

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Primability

Misura della capacità di un primer di legarsi al DNA target.

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Stabilità di match

Probabilità che un primer rimanga legato durante la PCR.

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Filamenti di lunghezza omogenea

Frammenti di DNA amplificati con lunghezze uniformi.

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Resa teorica

Previsione del numero di copie di DNA dopo 'n' cicli di PCR.

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3' e 5' end

Le estremità del DNA che guidano il processo di replicazione.

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Overlap

L'area in cui le sequenze si sovrappongono durante l'annealing.

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Frammento desiderato

Segmento specifico di DNA che si intende amplificare nella PCR.

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Componenti della PCR

Includono buffer, dNTPs, primer e polimerasi.

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Buffer PCR

Soluzione che mantiene un ambiente ottimale per la reazione.

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dNTPs

Nucleotidi deossiribonucleici, mattoni del DNA.

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Polimerasi termostabile

Enzima che sintetizza nuovi filamenti di DNA.

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Amplificazione del DNA

Aumento della quantità di DNA tramite cicli di temperatura.

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Study Notes

Introduzione alla PCR

  • La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica per amplificare frammenti di DNA con estremità note.
  • Inventata da Kerry Mullis nel 1983, la PCR divenne efficiente nel 1988 grazie all'enzima Taq DNA polimerasi, resistente ad alte temperature.
  • Questo metodo è essenziale per la biologia molecolare.

Funzionamento della PCR

  • La PCR permette di amplificare e isolare segmenti specifici di DNA (ampliconi) da genomi di organismi viventi o DNA artificiali.
  • Le dimensioni degli ampliconi variano da poche decine di paia di basi a 15-20 mila paia di basi.
  • L'amplificazione avviene tramite cicli di sintesi del DNA, delimitati da due inneschi sintetici (primers) complementari alle estremità del DNA da amplificare.

La Polimerasi

  • Il DNA è una doppia elica antiparallela.
  • La sintesi del DNA avviene sempre nella stessa direzione per ogni elica, ma in senso opposto.
  • La direzione di sintesi è 5' → 3'.
  • Le polimerasi sintetizzano DNA o RNA a partire da un innesco 3' libero sul template.
  • La polimerasi scorre sulla elica di DNA template in direzione 3' → 5'.

PCR - Reazione a catena della polimerasi

  • È il metodo per produrre in vitro grandi quantità di una sequenza specifica di DNA da DNA intricato.

  • Il principio è ispirato alla replicazione del DNA.

  • I passaggi coinvolti sono: denaturazione della doppia elica di DNA, appaiamento dei primers sul DNA a singolo filamento (ssDNA), sintesi ed estensione della nuova elica a partire dal primer ad opera della Taq-polimerasi.

  • Il ciclo si ripete per creare molteplici copie del DNA.

Fasi della PCR

  • Denaturazione: Il DNA viene denaturato mediante riscaldamento a circa 92-95°C.
  • Annealing: La miscela viene raffreddata per permettere ai primers di appaiarsi alle regioni complementari del DNA stampo. La temperatura di annealing è compresa tra 50 e 65°C.
  • Allungamento: La temperatura viene aumentata a 68-72°C per consentire alla DNA polimerasi di sintetizzare il filamento complementare allo stampo a partire dall'innesco.

Cicli della PCR

  • I cicli della PCR comprendono denaturazione, annealing e allungamento.
  • Il numero di cicli varia da 30 a 35, influenzato dalla lunghezza del frammento.
  • Il tempo in ogni fase dipende dalla lunghezza del frammento.

Componenti della reazione PCR

  • Stampo: DNA a doppio filamento.
  • Primers: Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti del DNA bersaglio.
  • Deossiribonucleotidi trifosfati: dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
  • Tampone contenente cloruro di magnesio: lo ione Mg2+ è essenziale per il funzionamento dell'enzima.
  • Enzima: Taq polimerasi, termostabile, estratto dal batterio termofilo Thermus aquaticus.

Progettazione dei primers

  • Lunghezza: 16 basi o più per garantire la specificità.
  • Tm: Temperatura di Melting, che dipende dalla sequenza e lunghezza dei primers.
  • Ta: Temperatura di Annealing che è solitamente 5°C al dì sotto del Tm più basso.

Altre informazioni

  • La PCR è usata per amplificare un segmento specifico di DNA.
  • Utilizzata in varie applicazioni biologiche.
  • Lo schema PCR mostra i passaggi di amplificazione del DNA.
  • La resa teorica di PCR aumenta esponenzialmente con il numero di cicli.
  • La PCR richiede una serie di componenti essenziali per ottenere il prodotto desiderato.

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PCR - Reazione a Catena della Polimerasi (PDF)

Description

Questo quiz esplora concetti chiave relativi alla replicazione del DNA e alla tecnica della PCR. Gli argomenti trattati includono la direzione di sintesi dei filamenti, il ruolo dei primer e le differenze tra replicazione e PCR. Metti alla prova la tua conoscenza sulla biologia molecolare e le tecniche di amplificazione del DNA.

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