Genética Molecular - Parcial 2 - PDF

PARCIAL 2 ENTERO.pdf juseco Genética Molecular 2º Grado en Biotecnología Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio Natural Universidad Politécnica de Valencia Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitid...

PARCIAL 2 ENTERO.pdf juseco Genética Molecular 2º Grado en Biotecnología Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio Natural Universidad Politécnica de Valencia Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 UNIDAD 3. EXPRESIÓN GÉNICA: TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN (CONTINUACIÓN DEL PARCIAL 1, APARTADO 3.1) PROMOTOR → Secuencia del propio DNA que indica a partir de donde se debe empezar a transcribir un gen, es decir, su posición. Las SECUENCIAS CONSENSO son secuencias muy conservadas en las cuales el promotor siempre suele ser igual: → Región -10 = TATAAT si está subrayado pueden variar → Región -35 = TTGACT ARN POLIMERASA O TRANSCRIPTASA (CARACTERÍSTICAS) ○ ATP, GTP, UTP, CTP ○ v = 40 nucleótidos / s ○ Requiere Mg2.+ ○ Puede actuar como helicasa ○ No necesita cebador ○ Error = 10-4/10-5; mayor que en la ○ El molde es DNA (NO RNA) replicación pero minimizado por el nª ○ Síntesis 5’ → 3’ de copias Es una holoenzima y el factor σ ayuda al reconocimiento. 2. TRANSCRIPCIÓN EN CÉLULAS PROCARIOTAS 2.1 INICIACIÓN → 3 pasos 1. Unión del promotor → ɑ y σ reclutan la enzima central hacia el promotor. Complejo cerrado 2. Desnaturalización del promotor → Complejo abierto El factor σ70 tiene la región σ2 en la región -10. Esta presenta dos recesos que fijan cada uno una base de la cadena no plantilla. Es energéticamente favorable romper pdh y unir la base por lo que no hay que hidrolizar ATP. La RNA pol permanece estacionaria y atrae hacia ella DNA aguas abajo hasta que se produce el ESCAPE DEL PROMOTOR, en la que σ se separa. En el sitio de inicio se inserta el primer rNTP complementario a la cadena de DNA. 3. Se forma el complejo de transcripción lineal → RNA pol + DNA molde + primer rNTP 2..2 ELONGACIÓN → el enzima recorre el gen completo añadiendo rNTP hasta la señal de terminación 2.3 TERMINACIÓN → las secuencias de terminación suelen tener 40 pb y son importantes en procariotas, ya que el siguiente gen en dirección 5’ puede estar muy cerca. La secuencia de terminación SÍ se transcribe a RNA, y hay dos tipos de terminación: 1. Terminación intrínseca → secuencia autocomplementaria rica en G-C. Se transcribe y sus 1 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 bases se aparean formando una horquilla (estructura tallo-asa). Sigue una secuencia rica en A que induce la terminación de la transcripción, la liberación del transcrito y se cierra la doble hélice. 2. Terminación dependiente de RHO → RHO es una proteína hexamérica grande que interactúa físicamente con el transcrito y facilita la terminación. 2.4 REVISIÓN DE LA RNA POL La pol de elongación sintetiza, revisa y corrige errores en el transcrito: 1. Edición pirofosfolítica → la enzima cataliza la eliminación de un ribonucleótido incorrecto reincorporando Ppi. 2. Edición hidrolítica → RNA pol retrocede 1 o más nucleótidos y escinde el error. 3. TRANSCRIPCIÓN EN CÉLULAS EUCARIOTAS ○ Ocurre dentro del núcleo ○ Regulación compleja con intensificadores y silenciadores ○ Pre-RNA → hnRNA (nuclear heterogéneo) → mRNA (splicing) ○ Hay 3 tipos de RNA pol → tipo I (rRNA, nucleolo), tipo II (mrNA y snRNA, nucleoplasma), tipo 3 (tRNA, RNA 5S, nucleoplasma) La RNA pol II forma un complejo preiniciación (PIC) con GTF y el promotor. Destaca en este complejo el TFIID (factor de transcripción para la RNA polimerasa IID), el cual está compuesto por: 10 TAFs (TBP associated factors)y por TBP (TATA binding protein) que distorsiona el DNA. El ESCAPE DEL PROMOTOR requiere la fosforilación de la “cola” de la polimerasa y de la hidrólisis de ATP. El inicio de la transcripción in vivo requiere más proteínas (activadoras y represoras) y que se forma el complejo mediador → formada por muchas subunidades, algunas conservadas desde las levaduras hasta los humanos. Se forman bucles para poner en contacto proteínas con el PIC. Además, hay factores que estimulan el alargamiento y la revisión del RNA por la RNA pol. La RNA pol alargadora debe encargarse de las histonas, para lo cual se utilizan FACT, facilita la transcripción cromatídica). 3.1 MODIFICACIONES POST-TRANSCRIPCIONALES Son clave para el transporte del RNA del núcleo al citoplasma. Consisten en añadir la caperuza (7-metil guanosina) al extremo 5’ que protege de nucleasas e indica el inicio de la traducción, y en el extremo 3’ se añade la cola de poli-A. 2 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 Los genes eucariotas están formados por exones (regiones con info) e intrones (regiones sin info). Los intrones se eliminan por splicing → corte endonucleotídico de los extremos del intrón, su eliminación y ligamiento de los exones por RNA ligasas, Los genes eucariotas empiezan y terminan por exones y hay 3 tipos de intrones: ○ Grupo I → reacción autocatalítica. El intrón es la fuente de actividad enzimática para su propia eliminación. Hay 2 reacciones de transesterificación. Ocurre en ribozimas ○ Grupo II → reacción autocatalítica. Ocurre en mRNA / tRNA de mitocondrias y cloroplastos. ○ Grupo III → se forma el espliceosoma: conjunto de pequeños nRNA - snRNA y proteínas con función catalítica. Ocurre en pre-mRNA de eucariotas. 3.2 REGULACIÓN EN EUCARIOTAS Elementos en cis (unidos al DNA) Elementos en trans (similar σ en procariotas) Caja TATA (-30/-24) Factores de transcripción genéricos (GTF) → Caja CAAT (-70/-80) se unen a TATA Elemento BRE (-23/-27) Activadores transcripcionales Elementos INR (+2 / +4) Silenciadores transcripcionales 4. EL CÓDIGO GENÉTICO ○ Lineal, basado en mRNa ○ Señales de inicio y fin ○ Codones → subud. tripletes ○ Se lee de forma continua ○ 1 codón → 1 aa (no ambiguo) ○ No hay codones solapantes ○ 1 aa → varios codones (degenerado) ○ Universal (raras excepciones) Hay 61 codones asignados a aa: → AUG codifica para metionina. Codón de inicio → UAA, UAG, UGA son codones de terminación → Solo el triptófano tiene 1 codón (UGG). El resto de aa tiene entre 2 y 6 codones Se observa un patrón de degeneración, en el cual diferentes codones que especifican el mismo aa solo difieren en la tercera letra. De esto deriva la hipótesis del tambaleo: los 2 primeros ribonucleótidos son más importantes que el tercero para atraer el tRNA, mientras que el tercero puede establecer un par de Watson y Crick o por un pequeño desplazamiento, un par distinto. La naturaleza ordenada del código indica que aa químicamente similares comparten 1 o 2 bases intermedias en los diferentes tripletes que lo codifican, lo que amortiguan el efecto potencial de mutaciones sobre la función de la proteína. 3 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 El código genético no es solapante → ribonucleótidos que corresponden a un polipéptido forman parte de 1 solo codón. Los genes pueden estar solapados → mRNA puede tener varios puntos de iniciación. ORF (open reading frame) → región codificadora de proteínas de cada mRNA compuesta por una hilera de codones no superpuestos contiguos. 4.1 HISTORIA DEL CÓDIGO GENÉTICO Brenner y Crick, en los 60, supusieron que la información debía estar codificada en tripletes de los cuatro nucleótidos. La primera evidencia sólida de esto fue el trabajo experimental de Crick, Barnett, Brenner y Watts-Tobin, para lo cual usar un mutágeno (acridina proflavina) y observaron las diferencias en la traducción cuando había inserciones y/o deleciones. Nirenberg y Matthaei descubrieron los los homopolímeros y heteropolímeros de RNA gracias a la síntesis proteica in vitro, gracias a la polinucleótido fosforilasa (produjeron mRNA) En 1964, Nirenberg y Leder realizan la técnica de unión al triplete (in vitro) → Una secuencia de 3 ribonucleótidos se une a un ribosoma y el codón atrae a un tRNA gracias al anticodón. Los tRNA unidos a distintos aa, se incuban en un filtro de nitrocelulosa y se observa que se retienen los ribosomas pero no el tRNA. Se analiza un tRNA con aa unido a un mRNA-ribosoma y se asigna un aa al codón. Como el código genético es degenerado más de codón especifica para el mismo aa. Khorana descubre los copolímeros con repeticiones, que son moléculas largas de RNA formadas por secuencias cortas de 2, 3 o 4 ribonucleótidos que se repiten muchas veces. 5. LA TRADUCCIÓN Es la síntesis de proteínas que utiliza la secuencia de mRNA como fuente de info. Es una serie lineal de aa cuya secuencia ha sido dictada por el código genético. 5.1 ELEMENTOS QUE PARTICIPAN EN LA TRADUCCIÓN 1. RNA DE TRANSFERENCIA (tRNA) Es un RNA pequeño con bases modificadas post-transcripcionalmente que potencian la eficacia de los pdh durante la traducción. Tiene forma de trébol (2D) o de L (3D), en 5’ tiene una G y en 3’ tiene CCA. Para cargar el aa en el tRNA se emplea la AMINOACIL ARNt TRANSFERASA. Hay 4 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 normalmente 20 (1 por aa) y el proceso ocurre en 2 pasos: → Transferir AMP a aa generando enlace éster de alta E → Transferir aa adenilado a un tRNA. El extremo -OH del tRNA rompe el enlace éster. Isoaceptor → tRNA diferente que carga el mismo aa Formar el aminoacil-ARNt depende de la forma, el tamaño, y los grupos químicos: si son parecidos la aminoacil-tRNA tiene un receso de edición. Esta enzima presenta una gran especificidad, ya que la RNA sintetasa reconoce el anticodón y el tallo aceptor, el cual tiene una base discriminatoria específica a cada aminoácido 2. RIBOSOMAS (y factores asociados) 3. mRNA 5.2 PASOS DE LA TRADUCCIÓN EN PROCARIOTAS 1. FASE DE INICIACIÓN → AUG codifica N-formilmetionina 1.1. mRNA se une a la sub. pequeña junto con los factores de iniciación IF 1, 2 y 3. En el proceso participa la secuencia Shine-Dalgarno: secuencia consenso (AGGAGG) complementaria a una secuencia 3’ del RNA 16S (secuencia anti-Shine-Dalgarno). IF1 se coloca en el sitio A IF3 se coloca en el sitio E → impide unión de sub. grande 1.2. tRNAfmet se une al codón correspondiente del sitio P liberando IF3. IF2 es unido al tRNA gracias a GTP 2. 1.3. Se coloca la subunidad grande liberando IF1 e IF2 gracias a GTP 1.4. Se forma el COMPLEJO DE INICIACIÓN → ribosoma 70S + mRNA + tRNAfmet FASE DE ELONGACIÓN → basada en la reacción peptidil-transferasa 2.1. EF-Tu inserta tRNA en el sitio A (vamos a llamar 2 a este tRNA) 2.2. tRNA 2 gira sobre sí mismo para permitir el enlace (catalizado por rRNA 23S) 2.3. tRNA 1 sin aa pasa al sitio E y después sale del ribosoma (?) 2.4. mRNA se transloca 3 bases a la izquierda gracias a EF-G (dependiente de GTP) 2.5. tRNA 2, que tiene el péptido, pasa al sitio P 2.6. Se repite con todos los codones hasta el codón de terminación 5 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 El mRNA libre se puede asociar a otro ribosoma para formar un POLISOMA 3. FASE DE TERMINACIÓN 3.1. Aparece en el sitio A un codón de terminación/de stop/ sin sentido → UGA, UAA, UAG 3.2. Entra RF1 o RF2 en el sitio A, lo cual desencadena la separación del péptido gracias a RF3 (unido a GDP) 3.3. Sale RF 1/2 y el GDP de RF3 se transforma en GTP 3.4. Sale RF 3 con GDP + Pi y se une al sitio A el RRF, es el factor de reciclaje ribosómico que imita a un tRNA 3.5. Se mete EF-G al sitio A provocando la salida de los tRNA de los sitios E y P 3.6. Sale EF-G gracias a IF 3, el cual se une al sitio E 3.7. Se desensambla el ribosoma, sale el mRNA y el polipéptido se pliega para forma la proteína. 5.3 DIFERENCIAS EN EUCARIOTAS ○ La transcripción y la traducción tienen lugar en compartimentos diferentes. ○ Múltiples oportunidades para la regulación de la expresión génica. ○ Ribosomas más grandes y complejos con mayor nº de factores. 2 poblaciones de ribosomas: citoplasmático o asociados al retículo endoplásmico rugoso (eER) ○ mRNA disponible más tiempo antes de su degradación y este es procesado (caperuza) ○ mRNA se encuentra poliadenilados (cola PoliA) ○ Tienen la secuencia de Kozak, en vez de la de Shine-Dalgarno → 5’- A/G_ _AUGG - 3’. Facilita la unión del mensajero a la subunidad pequeña ○ tRNAmet en vez de tRNAfmet como primer aa En eucariotas hay modificaciones post-traduccionales que son importantes en la función de la proteína. Estas pueden ser: 1. Eliminación/modificación del aa correspondiente al extremo N-terminal 2. Modificación de los residuos de los aa. Las más comunes son metilaciones y acetilaciones. 3. Recorte de las cadenas polipeptídicas 4. Eliminación de secuencias señalizadoras → dirigen a la proteína a donde debe actuar 5. Formación de complejos con metales 6 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 UNIDAD 4. RECOMBINACIÓN Y TRANSPOSICIÓN 1. CONCEPTOS GENERALES DE RECOMBINACIÓN DEFINICIÓN → Cualquier proceso que dé lugar a la formación de un nuevo DNA a partir de moléculas distintas. Es un proceso de redistribución de la información genética que permite al organismo intercalar parte de una cadena de ADN en otra. Es esencial para la evolución ya que permite generar nuevas combinaciones alélicas, recuperar combinaciones y crear nuevas reorganizaciones de genes. Además puede regular la expresión génica. Hay 2 tipos: 1. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA → ocurre entre zonas con mucha homología, es decir, entre regiones equivalentes, aunque no exactamente iguales. 2. RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA → se produce entre regiones distintas y puede ser: específica de sitio (en dianas específicas) o no específica de sitio o transposición (segmento corto de DNA se mueve de un lugar a otro) 2. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Es una potente fuerza evolutiva que permite la diversidad genética, la conservación de la identidad genética y reparar el DNA. PROCARIOTAS EUCARIOTAS MANTENIMIENTO DEL GENOMA Reparación roturas de doble cadena y re-inicio de horquillas de replicación detenidas Reparación roturas de doble cadena y re-inicio de horquillas de replicación detenidas GENERACIÓN DIVERSIDAD Promoción de intercambio genético entre gDNA y el que entra por transducción o conjugación. Realizar el entrecruzamiento y asegurar la segregación de cromosomas en la división. En mitosis puede ocurrir pero es MUY raro. Los pasos generales de la recombinación homóloga son: 1. Realización de cortes en el DNA 2. Alineación de las dos moléculas de ADN homólogas 4. Desplazamiento de esta unión a lo largo de las cadenas 5. Resolución de la unión de Holliday 3. Formación de la estructura de Holliday 2.1 MODELO DE HOLLIDAY Propuesto 1964 Primero se alinean las cadenas homólogas y se rompe 1 cadena de cada duplex. A continuación se forma la unión de Holliday, que es una unión cruzada de las cadenas a nivel de la rotura, la cual se va desplazando a lo largo de las cadenas. En este punto aparecen los heteroduplex. Para la resolución de la unión hay dos posibilidades de escisión que generarán 2 combinaciones génicas: 7 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 1. Productos recombinados o de “empalme” → entrecruzamiento en los genes flanqueantes a un gen concreto. 2. Producto en (Vertical) “parche” o no recombinado → solo cambia un gen concreto. (Horizontal) Sin embargo, este no es el modelo real. Se ha comprobado que el inicio de la recombinación ocurre a partir de roturas bicatenarias por lo que realmente ocurre: rotura bicatenaria + reparación. Hay enzimas que producen esta rotura (Spo11 en euc.) e implican la síntesis adicional de ADN. 2.2 MODELO DE ROTURA Y REPARACIÓN DE DOBLE CADENA Primero se alinean las cadenas homólogas y se rompen las dos cadenas de uno de los cromosomas. A continuación un fragmento invade la doble hebra del otro cromosoma y abre una burbuja. A partir de los extremos 3’ de estos fragmentos de ssDNA se empieza a sintetizar DNA y se forma una doble unión de Holliday. Para la resolución de la unión hay dos posibilidades de escisión que generarán dos combinaciones génicas: 1. Productos recombinados o de “empalme” → entrecruzamiento; un resolución de cada tipo 2. Producto en “parche” o no recombinado → no hay entrecruzamiento; dos resoluciones =. 8 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 En E. coli está el sistema RecBCD → El CHI (crossover hotspot instigator) es un punto del DNA cuya secuencia es GCTCCTGG y es reconocido por la proteína RecBCD 1. Rec B = helicasa 3’ → 5’ + nucleasa 3. Rec D = helicasa 5’ → 3’ 2. Rec C = reconoce CHI La cadena que invade la doble hélice se desplaza hasta encontrar una secuencia homóloga y se produce apareamiento en la misma. Rec A es una proteína de intercambio de cadenas que está implicada en la búsqueda de la homología (puede albergar varias cadenas), en la generación de regiones de apareamiento y estira el DNA hasta detectar complementariedad de bases entre dos moléculas de DNA. En eucariotas está muy conservada → Rad51 y Dmc1. Para la migración y la resolución se emplean proteínas Ruv: 1. Ruv A → se une a las cuatro hebras de la unión de Holliday 2. RuvB → ATPasa que se une en extremos opuestos de la unión y permite el desplazamiento. La hidrólisis de ATP hace que RuvAB gire el DNA 3. RuvC → endonucleasa que reconoce específicamente la unión y permite la resolución. Corta preferentemente en ATTG, siempre que se encuentre en una unión de Holliday. 2.3 RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA EN EUCARIOTAS FACTORES QUE CATALIZAN LA RECOMBINACIÓN PASO EN E. COLI EN EUCARIOTA Inducción roturas bicatenarias - Spo11 Procesamiento roturas DNA para generar monocadenas para la invasión Helicasa - nucleasa RecBCD Apareamiento de DNA homólogos e invasión cadenas Proteína RecA Rad51, Dmc1 Reconocimiento unión de holliday y migración de las ramas RecBCD - Resolución de la unión RuvC - En eucariotas la recombinación ocurre en la profase I meiótica, en la cual de un precursor 2n se generan 4 gametos n genéticamente distintos (exclusiva de líneas germinales). La rotura de los heteroduplex y su reparación puede provocar conversiones génicas → divergencia en la segregación esperada de los alelos que altera la frecuencia genotípica en gametos. Durante este proceso se elimina parte de una cadena y se sintetiza con la hebra complementaria como molde. 9 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 3. RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA: RECOMBINACIÓN CONSERVATIVA ESPECÍFICA DEL SITIO (CSSR) RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA → Se produce entre regiones no equivalentes dando lugar a reordenaciones en el genoma, por lo que es una gran fuente de variabilidad. En el proceso participan recombinasas, de las cuales hay dos familias → serina recombinasas y tirosina recombinasas. RECOMBINACIÓN CONSERVATIVA ESPECÍFICA DEL SITIO (CSSR) → ocurre entre dos secuencias definidas llamadas sitios de recombinación, en las cuales hay una secuencia de unión específica a recombinasa (ubicadas simétricamente) y una secuencia de corte y resellado por recombinasa (región crossing-over). Pueden ocurrir tres reordenaciones → inserción de un segmento de DNA en un sitio específico (ej. integración fago λ), deleción de un segmento de DNA o inversión de un segmento de DNA. La especificidad de recombinación se produce por la complementariedad de 15 a 30 bases de 2 cadenas de DNA. Esto es reconocido por una recombinasa y puede ser tirosina-recombinasa o serina-recombinasa EL FAGO λ Su DNA se integra en sitios predeterminados del DNA bacteriano. En el proceso no intervienen proteínas Rec y los DNA solo se recombinan en un sitio, gracias a la formación de un complejo sináptico. Conceptos que hay que saber: ○ attP → sitio de integración del fago (attachment Phage) ○ attB → sitio de integración de la bacteria (attachment Bacteria) ○ Región O → 15 pb que es idénticas en ambos, ○ Profago → forma integrada y flanqueada a la izquierda por attL (BOP') y a la derecha por attR (POB') ○ Int (integrasa) → actividades típicas de una recombinación: endonucleasa y ligasa. Cortes de 7pb en attP y attB para permitir la unión ○ IHF (Integration Host Factor) → Orienta las moléculas doblando el DNA de un modo determinado para permitir la recombinación Ventaja evolutiva de los sitios específicos de integración del fago → si el DNA se inserta aleatoriamente hay un alto riesgo de desaparición de la especie por aparición de mutaciones insercionales. Limitando la inserción a determinados sitios poco críticos, evitamos el potencial mutagénico de la inserción 10 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 3.1 FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LA RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA 1. CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA → se activan / inactivan genes alternativos. Ej. recombinasa Hin (H-inversion) de Salmonella y activación de los genes flj de la flagelina (producción flagelos 2. ACTIVACIÓN DE GENES EN EUCARIOTAS → ej. locus MAT en levaduras 3. REENSAMBLAJE DE GENES DEL SIST. INMUNITARIO EN VERTEBRADOS → la recombinación genética en linfocitos permite generar distintos anticuerpos y receptores de linfocitos T que se requieren para la respuesta inmune. Hay genes V, D y J que se reorganizan en el desarrollo y la recombinación genera hasta 107 combinaciones posibles. 4. OBTENCIÓN DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS (biotec) → se insertan sitios de recombinación que flanquean el gen marcador y se promueve la recombinación entre los sitios y la deleción del gen, ○ El sistema Cre/lox → el gen cre una recombinasa específica de secuencia llamada Cre. Los sitios que reconoce y recombina Cre se llaman secuencias loxP (34pb). De por sí, con las secuencias loxP no ocurre nada pero si la célula expresa cre, la recombinación de Cre con estas secuencias produce un corte entre los sitios loxP, se unen las secuencias de DNA por loxP y se degrada el DNA cortado. LoxP proviene originalmente del bacteriófago P1, pero pueden ser artificialmente insertadas en animales o plantas para producir el corte preciso de DNA, sin que existan problemas de cortar otras partes del genoma. 4. RECOMBINACIÓN HETRÓLOGA: TRANSPOSICIÓN La transposición es un proceso de recombinación no homóloga que mueve un fragmento de DNA de un sitio a otro dentro de la misma cadena o entre cadenas distintas. Estos elementos son TRANSPOSONES O ELEMENTOS TRANSPONIBLES y son fuente de muchas mutaciones espontáneas. En general, la inserción no requiere afinidad de secuencia y puede producirse en cualquier parte del genoma y si lo que se inserta son exones o promotores ocurren mutaciones. Los primeros fueron descubiertos por Barbara McClintok en 1950, cuando publicó un trabajo sobre los elementos Ac/Ds. Hay dos tipos de repeticiones características en los transposones: 1. Repeticiones terminales invertidas → 9-40 pb complementarias de forma invertida. 2. Repeticiones directas flanqueantes → 3-12 pb que se producen durante el proceso donde se ha insertado el transposón. Longitud variable pero = por transposón. Se producen porque el transposón genera cortes escalonados donde se inserta. 11 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 4.1 TRANSPOSICIÓN CONSERVATIVA VS REPLICATIVA La transposición conservativa es aquella en la que cuando el transposón se mueve el sitio del que proviene queda vacío por lo que no aumenta el número de copias del transposón en la célula. Sin embargo la transposición replicativa supone que quede una copia del transposón del sitio del que salta aumentando el número de copias. En la transposición conservativa la transposasa genera roturas de dobles en la secuencia de origen y a cada lado de la secuencia donde se va a insertar (los extremos 3’ de la región receptora integra el fragmento). En la transposición replicativa una resolvasa resuelve el cointegrado haciendo una recombinación recíproca → une extremos del DNA aceptor original y libera el genoma donante de nuevo con su transposón. En este caso las transposasa genera roturas de una sola hélice en la secuencia de origen. 4.2 ELEMENTOS TRANSPONIBLES EN PROCARIOTAS Las secuencias de inserción (IS) es el elemento más simple en bacterias y llevan la información genética para sintetizar la transposasa necesaria para su movimiento. Los transposones compuestos están formados por 2 copias de IS. Cada una tiene secuencias invertidas y hay repeticiones directas flanqueando ambas. El DNA entre las dos IS no es necesario para el movimiento pero puede portar info. genética como para la resistencia a antibióticos. Además, la transposasa producida por una de las dos es responsable de la transposición de ambas. Los transposones no compuestos no tienen secuencia IS. Poseen genes que codifican para la transposasa y producen repeticiones directas flanqueantes cuando se insertan al azar. 4.3 ELEMENTOS TRANSPONIBLES EN EUCARIOTAS Los elementos transponibles de DNA son similares a los de las bacterias y tienen repeticiones invertidas cortas. Pueden ser autónomos (gen para la transposasa) o no autónomos (no tienen gen de la transposasa, se mueven usando la de otro elemento). En todos los organismos existen ambos. Los retrotransposones son los más abundantes y tienen 2 repeticiones directas largas (LTR) que tienen las repeticiones invertidas. Se trasladan a partir de intermediarios de RNA (transposición replicativa) y la integrasa es la encargada de catalizar la inserción del elemento transponible. 12 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 Los retrotransposons con cola poli-A no tienen regiones terminales invertidas sino que son distintas: 5’-UTR y 3’-UTR + cola poli-A. Estos codifican para ORF1, proteína de unión al RNA) y ORF2, que actúa como transcriptasa reversa y endonucleasa. Ocurre el splicing reverso; ○ El promotor está en la región 5’-UTR y se transcribe a RNA con los genes ○ En la traducción es cuando se generan las dos ORF, las cuales forman un complejo ORF1/ORF2 que se une al RNA. ○ El elemento se inserta en una región diana del DNA, normalmente rica en T. ○ Para la inserción se realiza un corte en una de las cadenas, se forma un heteroduplex (DNA-RNA) y se sintetiza la primera cadena de cDNA. Se degrada el RNA mientras se sintetiza la segunda cadena del cDNA. Finalmente se ensambla el nuevo DNA con el viejo. Los elementos SINEs (Short Interspersed Nuclear Element) son retrotransposones poli-A no autónomos que no codifican transposones. Es el nombre colectivo para las secuencias o elementos Alu (13ç5 genoma humano) que se transponen con las proteínas ORF2 de los LINEs. Los elementos LINEs (Long Interspersed Nuclear Element) son retrotransposones poli-A autónomos que codifican para proteínas ORF1 y ORF2 y que suponen el 20% del genoma humano. 13 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 UNIDAD 5. MUTACIÓN Y REPARACIÓN DE ERRORES 1. GENERALIDADES Y TIPOS DE MUTACIONES Si bien el DNA almacena la información genética de forma estable, para permitir su transmisión de forma fidedigna, la adaptación a nuevos ambientes y condiciones es imprescindible para la supervivencia. Por eso es necesaria la capacidad de generar nuevas variantes alélicas, lo que es conocido como plasticidad genética. Esto hace que deba existir un equilibrio entre la estabilidad y el cambio o variabilidad del DNA. Las mutaciones (naturales o artificiales) son la mayor fuente de nueva variabilidad y existen mecanismos de reparación para mitigar su aparición y mantener este equilibrio. Las mutaciones se clasifican por origen, causa, localización, naturaleza molecular o efecto fenotípico. CLASIFICACIÓN CAUSA TIPO Adaptativas → se induce por un estrés determinado Aleatorias → ocurren al azar antes de la situación de estrés, que es lo que muestra su efecto LOCALIZACIÓN Autosómica o ligados al sexo → según el tipo de cromosoma Somáticas o germinales (pasan a la descendencia)→ según el tipo de célula NATURALEZA MOLECULAR Sustituciones (*) → no cambian el número de pares de bases Inserciones / deleciones → cambian el número de pares de bases. Cambian la pauta de lectura EFECTO FENOTÍPICO Pérdida de función, nulas, knockout → inhabilita función de prot. o gen Ganancia de función → proporciona actividad nueva Recesiva, dominante → según expresión en heterocigosis Morfológicas, bioquímicas o comportamiento Reguladoras → afectan expresión de genes Letales Condicionales → efecto notorio en ciertas condiciones Neutrales → no tienen efecto aparente. Polimorfismos (útiles en selección) * SUSTITUCIONES Son mutaciones puntuales, en los que cambia la identidad de una base: transiciones (mismo tipo de base) o transversiones (tipos distintos, purina ←→ pirimidina). Los efectos dentro del ORF son: 1. Mutación sin sentido → cambia el triplete y codifica para un codón de stop 2. Mutación con sentido → cambia el triplete y codifica para otro aa 3. Mutación silenciosa → cambia el triplete y codifica para el mimo aa 14 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 2. MUTACIONES ESPONTÁNEAS Surgen con diferente frecuencia según el organismo y el gen y dependen de muchos factores como la sensibilidad o la reparación de mutaciones. Muchas mutaciones ocurren por errores durante la replicación del DNA, aún si las polimerasas tienen sistemas de corrección de errores. En regiones repetidas pueden producir horquillas en el DNA haciendo que haya duplicaciones o deleciones. Las principales causas de mutaciones espontáneas durante la replicación son cinco: 1. CAMBIOS TAUTOMÉRICOS → Las bases pueden existir en distintas formas que se diferencian en la posición de un H+, y aunque las formas anómalas se dan en MUY baja frecuencia estas generan apareamientos anómalos. Las mutaciones causadas por cambios tautoméricos se fijan en dos rondas de replicación, tras las cuales se obtiene ½ con bases normales y ½ con bases mutadas. 2. INSERCIONES O DELECIONES → En regiones repetidas se pueden producir horquillas en la cadena de DNA sintetizada o en la molde produciendo en inserciones (si es en la sintetizada) o deleciones (si es en la molde). 3. DESPURINACIÓN → Es un cambio químico espontáneo en el que se elimina una purina (en bases púricas, A y G) en una cadena intacta formando un sitio apurínico. Suele repararse, pero sino se hace se inserta en la replicación un nucleótido al azar (sobre todo A) 4. DESAMINACIÓN → Cambio químico espontáneo en el que se pierde un grupo amino y forma un grupo ceto. ○ En citosina → pasa a uracilo → aparea con adenina ○ En adenina → pasa a hipoxantina → aparea con citiosinas ○ En 5’-metil citosina (metilación natural) → pasa a timina → cambia C-G por A-T 5. DAÑO OXIDATIVO (CONDICIONES DE ESTRÉS) → Las formas reactivas de oxígeno que se producen durante el metabolismo celular pueden inducir modificaciones en el DNA que generan emparejamientos erróneos durante la replicación. 3. MUTACIONES INDUCIDAS Están producidas por agentes externos naturales o artificiales. Dentro de los agentes mutágenos, son importantes: 1. ANÁLOGOS DE BASES → sustancias químicas con estructura similar a alguna de las bases estándar del DNA y que las sustituyen en la replicación. Ej: 5’ bromouracilo y timina 2. AGENTES ALQUILANTES → sustancias químicas que ceden alquilos a grupos amino o ceto produciendo emparejamientos erróneos. Ej: EMS (top en mutagénesis vegetal) 3. COLORANTES DE ACRIDINA → su estructura les permite intercalarse entre las bases, provocando inserciones y deleciones y por tanto cambios en la pauta de lectura. Ej. proflavina y naranja de acridina. 4. RADIACIÓN UV → hace que se formen dímeros entre bases adyacentes, especialmente 15 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 entre T-T. Los dímeros distorsionan la configuración del DNA inhibiendo la replicación normal y provocando que la célula no pueda dividirse y muera. Es un agente esterilizante. 5. RADIACIONES IONIZANTES → los rayos cósmicos (X, Ɣ, etc.) tienen una longitud de onda muy pequeña y son muy energéticos, lo que hace que al pasar por las células generen radicales libres y roturas de cadena. 4. PREVENCIÓN DE ERRORES Hay mecanismos para prevenir mutaciones o sus consecuencias como la pigmentación de piel (la melanina es un fotoprotector UV) o la protección contra radicales libres (ej. antioxidantes). La duplicación génica es el proceso por el que se originan nuevas copias de un mismo gen (frecuente en eucariotas), lo que proporciona robustez mutacional → permite incrementar la tolerancia a las mutaciones y adaptarse a nuevas condiciones de estrés. Los genes que resultan de la duplicación génica pueden sobrevivir durante largos periodos evolutivos permitiendo que los organismos toleren mutaciones desestabilizadoras. 5. REPARACIÓN DE ERRORES 5.1 ACTIVIDAD EXONUCLEASA 3’ → 5’ La mutación más habitual es la inserción de un nucleótido erróneo por la DNA pol, lo que soluciona ella misma ya que tiene actividad exonucleasa 3’ → 5’. 5.2 CORRECCIÓN DE EMPAREJAMIENTOS ERRÓNEOS (MISMATCH REPAIR) En 1976 Paul Modric empezó a estudiar el mecanismo de reparación de apareamientos incorrectos en E. coli, y en 1989 logró reproducir in vitro el mecanismo. Este se basa en las proteínas MutL, MutS y MutH, que identifican la región metilada y con el emparejamiento erróneo: ○ MutS reconoce el emparejamiento erróneo y recluta a MutL que queda enlazada y activa a MutH, ○ MutH al activarse produce un corte en la cadena y una exonucleasa elimina todo el fragmento entre el corte y el error ○ La helicasa UvrD desenrolla a partir de este corte y una exonucleasa corta y degrada la cadena hasta la región desapareada. ○ DNA pol III y DNA ligasas reparan la cadena Este mecanismo reduce el error a 10-8 o 10-9. En eucariotas hay Homólogos de MutS (MSH). Si bien en estos organismos no se usa la metilación para identificar la cadena neosintetizada, la identificación de estas ocurre por la discontinuidad de la cadena formada hasta la ligación. 16 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 5.3 SISTEMA SOS O DE SÍNTESIS DNA TRANSLESIÓN Ocurre cuando la DNA pol se encuentra con un error tan grande que no puede continuar la replicación, por lo que es un último recurso ya que va a fijar muchas mutaciones en las cadenas, pero al menos evita la muerte de la bacteria. Se usan DNA pol específicas, que necesitan una plantilla pero no utilizan la información de la misma, ya que meten cualquier nucleótido.. Si son dímeros de timina, debido a que son relativamente comunes, hay pol que suelen añadir AA. 5.4 REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE BASES (BER) Descubierta por Tomas Lindahl en 1974, gracias a la identificación en bacterias de glicosilasas que eliminan las bases dañadas. En E. coli hay DNA glicosilasas específicas del tipo de daño que cortan el enlace entre la base y el azúcar formando un sitio apirimidínico / apúrico (AP). Una AP endonucleasa reconoce la lesión, la corta y es reparada por los mecanismos generales de reparación. Un ejemplo de lesión que solucionan son las oxidaciones de guanina que generan OxoG, capaz de aparear tanto con A como con C (relacionado con el cáncer colorrectal). El mecanismo es el siguiente: 1. Se genera OxoG ante un estrés oxidativo 2. La glicosilasa OxoG lo reconoce y lo elimina. El error es reparado (explicado párrafo ↑) 3. Si la glicosilasa no se ha dado cuenta del error y el DNA con OxoG se replica, hay una glicosidasa de seguridad. 4. Esta elimina el nucleótido con el que se ha apareado OxoG 5. La glicosilasa OxoG puede volver a actuar (detecta que no hay apareamiento de bases) 6. Si el error se mantiene, puede generar un cambio de un par G-C a uno A-T 5.5 REPARACIÓN DE DAÑOS CAUSADOS POR UV 1. FOTORREPARACIÓN → las fotoliasas son enzimas que revierten los dímeros de timina que solo se activa en presencia de luz visible ya que necesita un fotón de luz azul. La fotoliasa reconoce el dímero de timina y se une a él. Al incidir la luz, se activa y transfiere la energía a través de FADH2 al dímero, rompiendo el enclave y permitiendo el enlace A-T correcto. Esto ocurre en procariotas y muchos eucariotas pero NO en humanos. 2. REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS → depende del sistema Uvr. Una escinucleasa del complejo Uvr localiza y corta una región a ambos lados del dímero T-T o de la lesión (en bacterias 12-13 nucleótidos; en humanos 27-29 nucleótidos. Una vez se ha escindido el error, DNA pol I rellena el hueco y se sella todo por una DNA ligasa. Es un sistema que repara lesiones más grandes que afectan a varios nucleótidos o a la doble hélice y que pueden estar provocadas por varios factores. La corrección puede estar ligada a la transcripción. En eucariotas RNA pol II actúa detectando errores y TFIIH homólogos de Uvr: XPA y XPD cuando se va a transcribir el gen corrigen el fallo evitando que llegue al 17 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 transcrito. Ejemplo de enfermedad por fallo en el sistema de reparación → xerodermia pigmentosa: es una enfermedad autosómica recesiva causada por fallos en los componentes del complejo Uvr (top escinucleasa) lo que hace que se acumulen las mutaciones al no poder repararlas. Síntomas: atrofia e hiperqueratosis de la piel, ulceraciones de córnea y tumores cutáneos y metástasis. 5.6 RECOMBINACIÓN COMO SISTEMA DE REPARACIÓN Es un tipo de reparación post-replicativa. Si el error bloquea la replicación la DNA pol se lo salta dejando un hueco y por recombinación homóloga se recluta la cadena complementaria y se inserta en frente de la lesión. El hueco se transfiere a la otra cadena molde para que sea reparada por DNA pol y DNA ligasa. Si no hay un homólogo se puede producir por NHEJ (non-homologous end joining). NHEJ se unen para reparar la doble cadena por varias proteínas y con participación de sistemas de reparación de linfocitos. Defectos en enzimas que realizan este proceso provocan hipersensibilidad a radiaciones ionizantes y otros agentes mutagénicos e inmunodeficiencia. 18 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 UNIDAD 6. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN PROCARIOTAS 1. INTRODUCCIÓN E IDEAS GENERALES Los genes se expresan, son transcritos a proteínas y el mRNA se traduce a proteínas. pero esto no sigue una pauta (1 gen → 1 mRNA → 1 proteína), sino que las proteínas y los mRNA que se observan se encuentran a distintos niveles en células distintas, incluso en la misma pero en distintos momentos. Por tanto, debe existir una regulación a nivel de transcripción y de traducción. La capacidad de regulación en todos los estadíos del desarrollo es lo que ha permitido la evolución, entendiéndose como paso de procariotas a eucariotas unicelulares y de ahí a eucariotas pluricelulares en los que se va aumentando el grado de complejidad. Es una de las claves en las que se basa la teoría endosimbiótica. La regulación de la expresión génica más sencilla ocurre a tres niveles: 1. Transcripcional → decidir qué genes se van a expresar 2. Post-transcripcional → impide o no la traducción del mRNA 3. Post-traduccional → se influye sobre el procesado de polipéptido a proteína En el caso de procariotas, estos tienen que ser capaces de responder a los estímulos ambientales y sus necesidades metabólicas. Es especialmente importante que puedan regular su actividad por que no controlan muchas condiciones que determinan su homeostasis, por lo que se adaptan a los cambios o mueren. 2. CONCEPTOS IMPORTANTES 1. GENES INDUCIBLES → son aquellos que en los que la presencia de un inductor activan su expresión (está silenciado normalmente). Normalmente, suelen estar implicados en el metabolismo (TOP catabolismo) de la propia sustancia inductora: habitual que en las rutas catabólicas de una sustancia el inductor sea el sustrato de la misma, por ejemplo: la lactosa induce la expresión de los genes del operón lac y un antibiótico índice la expresión de un gen de resistencia. SUSTANCIA INDUCTORA → al estar presente activa el gen. 2. GENES REPRESORES → son aquellos que en los que la presencia de un represor reprimen su expresión (se expresa normalmente). Normalmente, suelen estar implicados en el metabolismo (TOP catabolismo) de la propia sustancia represora: habitual que en las rutas anabólicas de una sustancia el represor sea el sustrato de la misma, por ejemplo: el triptófano reprime la expresión de los genes trp. SUSTANCIA REPRESORA → al estar presente reprime el gen. 3. OPERÓN → conjunto de genes implicados en la misma función formados por: 19 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 ○ GEN REGULADOR → gen que actúa en la expresión de los genes estructurales codificando para una proteína específica llamada activador o regulador. Puede estar lejos de los genes que están siendo regulados ○ OPERADOR → la proteína reguladora actúa sobre él. Está entre el promotor y los genes estructurales que se están regulando ○ GENES ESTRUCTURALES → gen o conjunto de genes que al transcribirse permiten la síntesis de los enzimas (o el enzima) implicado en la función del operón. 4. CONTROL NEGATIVO → por defecto el gen se expresa y hay que inhibirlo para que no lo haga. La función del gen regulador es “apagar” la transcripción de los genes estructurales. 5. CONTROL POSITIVO → por defecto el gen no se expresa y hay que activarlo para que lo haga. La función del gen regulador es “activar” la transcripción de los genes estructurales. 6. PROMOTOR + OPERADOR → secuencias reguladoras en cis. = REGIÓN REGULADORA 7. FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN → elementos de actuación en trans que se unen a las secuencias cis para controlar la transcripción de los genes. 3. OPERÓN LACTOSA (lac) EN E. COLI La fuente de C habitual es la glucosa y la lactosa no suele encontrarse en el medio por lo que las enzimas que la metabolizan suelen estar inhibidas. Si no hay glucosa pero sí lactosa, la bacteria la metaboliza para obtener glucosa y la [ ] de estas enzimas codificadas por el operón lac aumenta. El operón lac está formado por: 1. 3 genes estructurales → se transcriben como un mRNA policistrónico que en la traducción da lugar a los 3 enzimas a. lacZ → β-glicosidasa. Lactosa → Fru + Gal b. lacY → permite el paso de lactosa al interior de la bacteria c. lacA → galactosa transacetilasa. Degradación de catabolitos del metabolismo de la Gal 2. 1 región reguladora (promotor + operador) 3. 1 gen regulador El estudio del promotor ha sido posible gracias a mutaciones estructurales, que afectan a genes estructurales, y a mutaciones constitutivas, que afectan gen represor I haciendo que se exprese lac sin lactosa (lac I-) o que afectan al operador (mutaciones OC). IPTG son sustancias que sirven como sustrato y evitan el efecto regulador de la lactosa, por lo que permiten ver el efecto inicial (no depende de interacción E-S). 3.1 CONTROL NEGATIVO DEL OPERÓN lac 20 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 Descrito por Jacob y Monod en 1960. 1. Si no hay lactosa, el gen lac I codifica para la proteína represora Lac I, que reprime la transcripción de los genes lac uniéndose al operador. 2. Si hay lactosa, esta se une a Lac I (proteína alostérica) provocando que cambie de conformación y ya no se pueda unir al operador. Sin Lac I en el operador, los genes lac se pueden transcribir. 3. MUTACIÓN I- → la proteína Lac I represora está alterada y ya no se puede unir al operador, por lo que hay una expresión constitutiva de los genes estructurales. 4. MUTACIÓN OC → la región operadora está alterada y varía el sitio de unión de Lac I haciendo que no se pueda unir al operador, por lo que hay una expresión constitutiva de los genes estructurales. 3.2 CONTROL POSITIVO DEL OPERÓN lac Es un control más refinado, y ocurre porque si hay glucosa y lactosa en el medio, la bacteria usaría glucosa pero la lactosa seguiría activando la expresión del operón lac. Para controlarlo existe un control positivo mediado por la proteína CAP y que es un sistema de represión por catabolito: se basa en la [ ] de la glucosa: 1. En ausencia de glucosa → los niveles de cAMP aumentan y se forma el complejo cAMP-CAP, que se une al sitio CAP del promotor formando un complejo estable. Este complejo facilita su reconocimiento por parte de la RNA pol y permite que los genes estructurales se transcriban. 2. En presencia de glucosa → la glucosa inhibe la adenilciclasa responsable del paso de ATP a cAMP por lo que los niveles de este bajan y no se forma el complejo cAMP-CAP. Sin este complejo, ni CAP ni la RNA pol tienen la afinidad suficiente para unirse a la región promotora del operón, por lo que se inhibe la expresión de lac aunque haya lactosa en el medio. Se considera un ejemplo claro de control positivo porque por defecto los genes no se expresan pese a que haya lactosa en el medio, y, para que esto ocurra debe activarse el complejo cAMP-CAP. 4. OPERÓN TRIPTÓFANO (trp) EN E. COLI Es un operón que codifica para los cinco enzimas necesarios para la síntesis del triptófano, el cual se expresa de forma constitutiva (se inhibe por la presencia de triptófano). Comparándolo con el operón lac, los genes se transcriben como un solo mRNA policistrónico pero en este caso el represor se encuentra cerca del operón. El operón trp está formado por: 21 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 1. 5 genes estructurales → A, B, C, D y E 2. 1 región reguladora → promotor (trp P), operador (trp O), secuencia líder (L, 162 nucleótidos) y región atenuadora (A) 3. 1 gen regulador represor → trp R Igual que en el operón lac se observan 2 casos posibles: 1. En ausencia de trp → se produce un represor pero este se encuentra en una forma inactiva que no se puede unir al operador para inactivar el operón y se permite la transcripción. 2. En presencia de trp → se produce el mismo represor, pero al unirse el trp provoca en él una transformación alostérica. El represor pasa a una forma activa, que se puede unir al operador y se inhibe la transcripción. 4.1 ATENUACIÓN DEL OPERÓN trp La atenuación es la terminación prematura de la terminación gracias a la región atenuadora (A) situada entre la secuencia líder y los genes estructurales. Si bien este mecanismo ocurre en varios procariotas, el mecanismo más entendido es el de los operones que son reprimibles y están involucrados en las síntesis de aa. En este caso, se regula por la disponibilidad del aminoacil-tRNA correspondiente al aa concreto (ej. de trp para el operón trp). Es un mecanismo adicional de inhibición de la transcripción para permitir aumentar el rango de la regulación → es capaz de modificarla 1000 veces, en vez de las 100 del operón lac. El mecanismo se basa en la formación de la formación de horquillas de terminación o de antiterminación. En la región atenuadora hay 4 secuencias (1-4) que se pueden aparear entre ellas y depende de cómo esto ocurra se generará una horquilla u otra: 1. Si hay trp en el medio, la región ORF (precedido por AUG) con 2 tripletes UGG (trp) de la secuencia líder permite la síntesis del péptido líder. Al sintetizarse este péptido, la zona 1 avanza dentro del ribosoma hasta el codón de parada haciendo que solo sea posible el apareamiento entre 3-4 formando una horquilla de terminación → no se transcriben los genes estructurales. 2. Si hay poco trp, no se puede sintetizar el péptido líder lo que supone una parada de la traducción. Cuando esto ocurre queda expuesta la región 2 del atenuador que se aparea con la región 3 formando una horquilla de antiterminación → permite la transcripción de los genes estructurales sintetizando más triptófano (hay otro AUG). 5. REGULACIÓN DEL INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN POR SUSTITUCIÓN DE SUBUNIDADES 22 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 DE LA RNA POL Ocurre tanto en eucariotas como en procariotas y es una estrategia directa en la que la subunidad s estándar de la célula vegetativa normal es desplazada y sustituida por otras subunidades diferentes, que están codificadas por genes distintos. La RNA pol es una holoenzima que, con la nueva subunidad s reconoce e inicia la transcripción a partir de otro tipo de promotor, permitiendo que se transcriban operones que no se expresaban. En E. coli, cuya unidad s estándar es la s70, hay dos ejemplos: 1. La respuesta al choque por calor → si se somete la bacteria a un estrés térmico se inducen genes (de respuesta al calor o al estrés, Hsg) cuyos productos intentan evitar los daños ocasionados. Esta respuesta está provocada por la subunidad sH o s32, que reconoce los genes correspondientes, los cuales tienen un promotor con la región -10 distinta. 2. Ayuno de N → si hay una escasez de nitrógeno, por ejemplo porque no hay amonio, la subunidad s54 o sN reconoce promotores distintos que permiten obtener el N de fuentes más raras. 6. SISTEMAS DE REGULACIÓN DE VARIOS COMPONENTES: TRANSDUCCIÓN DE LA SEÑAL La molécula señal no entra en la célula, sino que es reconocida por un receptor, el cual es modificado cuando ocurre la interacción con la molécula. Este receptor, a su vez, puede modificar a otra proteína (activadora o represora). Puede haber más de una proteína reguladora ya la señal va pasando de una a otra llegando al represor o activador final. Este proceso es la traducción de la señal y una de las modificaciones más frecuentes que ocurren son la fosforilación / desfosforilación que está mediada por quinasas y fosfatasas. Estos sistemas de componentes son muy abundantes en bacterias, en E. coli destacan dos (hay +50): 1. Sistema Ntr de utilización de fuentes de N → responde ante los niveles de amonio y permite el uso de fuentes alternativas de N 2. Sistema de respuesta ante la osmolaridad → la HPK EnvZ fosforila al regulador OmpR cuando hay un aumento de la presión osmótica. OmpR controla las proporciones relativas de dos porinas OmpC y OmpF, haciendo que predomine la primera (poro más pequeño). 7. REGULACIÓN MEDIADA POR RNA ANTISENTIDO (antisense RNA) Hay genes que codifican cadenas de RNA que, además, son complementarias a los mRNA de otros genes. Estos RNA pequeños se unen al mensajero formando una doble hélice de RNA que bloquea la traducción del mRNA induciendo su degradación. Existen tanto en procariotas como en eucariotas y es una estrategia muy útil para modificar la transcripción de forma artificial mediante transgénesis. 23 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 UNIDAD 7. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN EUCARIOTAS 1. INTRODUCCIÓN E IDEAS GENERALES Al igual que en procariotas, en eucariotas la función génica debe regularse para adaptarse al medio, pero además, en los eucariotas complejos es necesario coordinar la expresión de los genes en los diferentes tipos celulares. Se necesitan más niveles de regulación ya que las células de los diferentes órganos deben poder comunicarse. Las diferencias fundamentales entre procariotas y eucariotas que afectan a los tipos de mecanismos de regulación y a su funcionamiento son: 1. No hay operones splicing del mRNA 2. Más cromosomas y más compactados 6. mRNA es más estable y duradero 3. Hay más info. genética 7. Mecanismos 4. La traducción y la transcripción ocurren eliminación más complejos en compartimentos diferentes. 5. Antes de 8. No todos los genes se expresan en una de la traducción ocurre el célula La regulación ocurre a 7 niveles: 1. Condensación del DNA → las zonas muy condensadas no son funcionales (heterocromatina) 2. Transcripcional 3. Splicing (post-transcripcional) → procesado del mRNA. En algunos tipos celulares una parte puede ser considerada un intrón, pero que en otros tipo puede actuar como un exón. 4. Transporte (post-transcripcional) 5. Degradación del mRNA (post-transcripcional) 6. Traduccional 7. Post-traduccional → modifica proteína y su actividad 2. CONTROL POR LA ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA Los cromosomas exponen más los genes activos. Los cromosomas interfásicos están descompactados pero tienen una estructura ordenada dentro del núcleo y se encuentran en regiones concretas llamadas territorios cromosómicos. Los genes que no se deben transcribir se mantienen condensados y los que sí se deben transmitir se descondensan de forma ordenada. Además, los genes activos se suelen situar en el borde del canal cromosómico (no siempre) y se corresponden a las fibras de cromatina descondensada que emergen de las masas de cromatina condensada. 24 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6757280 GENÉTICA MOLECULAR 2 Se pueden visualizar in situ cromosomas completos lo que permite identificar regiones de distintos cromosomas que interaccionan entre ellos. Las factorías de transcripción son sitios con muchos factores de transcripción y RNA pol donde los lazos de cromatina de diferentes cromosomas pueden congregarse. Se cree que las factorías son áreas especializadas en una función común. 3. CONTROL DE LA TRANSCRIPCIÓN: EPIGENÉTICA DEFINICIÓN → conjunto de modificaciones reversibles y potencialmente heredables del DNA e histonas que afectan a la expresión génica sin alterar la secuencia del DNA Gran parte del fenotipo depende del DNA, pero otra de las modificaciones (metilaciones y acetilaciones TOP) que sufre, las cuales proporcionan diferencias que permiten que la lectura del material genético sea distinto en cada individuo. Es el nivel más fino de regulación ya que son pequeñas secuencias de DNA las que son controladas. Además. la epigenética es responsable de que el material genético sea capaz de adaptarse a los cambios sin modificar la información, ya que marca la información útil en el momento adecuado. 3.1 METILACIÓN DEL DNA Una de las modificaciones (2/7%, reversibles) más comunes es la metilación de bases y azúcares. Después de la replicación del DNA se metila con un patrón específico del tejido (marca epigenética). La base más habitual metilada es la citosina que se encuentra en pares CG. El estado de metilación se puede determinar mediante enzimas de restricción que reconozcan estos pares: algunos enzimas no cortan la secuencia si la citosina está metilada, por lo que por comparación del número de fragmentos generados por dos enzimas se puede medir el grado de metilación. Por tanto, el efecto de la metilación es la regulación de la expresión génica de forma indirecta, lo cual es evidenciado por: 1. La relación inversa entre el grado de metilación y la expresión → a mayor metilación, menos expresión. En hembras el cromosoma X inactivo tiene mayor grado de metilación. 2. Los patrones de metilación son específicos de tejido → una vez establecidos, lo heredan todas las células de ese tejido. 3. Si se incorpora un análogo que no se puede metilar (5'-azacitidina), se provocan cambios en la expresión del gen 25 Reservados todos los d