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De l’ADN aux Protéines Transcription Pr. Soumeya BEKRI UFR Santé Rouen 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 1 Transcription L’information génétique contenue dans l’ADN peut être exprimée sous forme d’ARNm (transcription) puis de protéines (traduction de l’ARNm) La transcription des gènes en ARNm es...

De l’ADN aux Protéines Transcription Pr. Soumeya BEKRI UFR Santé Rouen 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 1 Transcription L’information génétique contenue dans l’ADN peut être exprimée sous forme d’ARNm (transcription) puis de protéines (traduction de l’ARNm) La transcription des gènes en ARNm est essentielle à tous les êtres vivants La molécule d’ADN nucléaire est retrouvée dans toutes les cellules possédant un noyau L’expression de cet ADN va être cellule-spécifique et correspond aux protéines nécessaires pour un type cellulaire donné Lieu d’exécution : 2 compartiments différents Transcription → noyau Traduction → cytoplasme 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 2 Transcription Eléments intervenant dans la transcription Brin ADN matrice ARN polymérases Ribonucléotides triphosphates (ATP, CTP, GTP, UTP) Energie La synthèse de l’ARN Ne nécessite pas d’amorce Se fait dans le sens 5’ → 3’ Se fait de manière antiparallèle à l’ADN matrice et complémentaire au brin matrice Ribonucléotides sont hybridés au désoxyribonucléotides du brin matrice → Hybride ARN/ADN 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 3 Transcription Brin ADN matrice Les deux brins d’ADN peuvent servir de matrice pour la transcription Chaque gène a un sens de transcription → un seul des 2 brins est utilisé La direction de l’ARN polymérase sur le brin d’ADN est déterminée par la position du promoteur et détermine le choix du brin matrice anti-sens L’ARN synthétisé de façon complémentaire du brin anti-sens sera identique au brin sens à deux exceptions près : 1. Thymine au lieu de l’Uracile 2. Ribose au lieu du Désoxyribose Gène 1 : promoteur à gauche donc l’ARN polymérase va de la gauche vers la droite (brin sens 5’ → 3’), Brin matrice le brin matrice anti-sens est 3’ → 5’ 5’ 3’ 3’ Gène 1 Gène 2 5’ Brin matrice 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 4 Transcription Brin ADN matrice Gène Site d'initiation : point de départ de la transcription au niveau de la région promotrice ou promoteur Unité de transcription : portion d’ADN contenant des exons (séquences codantes) séparés par des introns Site de terminaison 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 5 Transcription Brin ADN matrice Site d'initiation : Promoteur Région en amont des séquences codantes qui permet la fixation du complexe de pré initiation de la transcription (PIC) = ARN POL II + Facteurs de transcription d’initiation 2 modes de transcriptions Transcription dispersée plusieurs sites d’initiation sur un segment de 50 à 100 nucléotides (gènes constitutifs) Transcription ciblée un seul site d’initiation (expression régulée) Les promoteurs incluent les séquences en amont et en aval du site d’initiation ~250 – 300 pb 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 6 Transcription Brin ADN matrice Site d'initiation : Promoteur ELÉMENTS PROMOTEURS A Transcriptional regulatory regions 1. Promoteur principal (Core promoter) (specific) transcription factors La portion contenant le site d’initiation de la transcription Site de liaison de l'ARN polymérase -Skb Enhancer (basal) transcription factors ~~ +100 -100 Proximal promoter Core promoter Site de liaison des facteurs d’initiation de transcription 50 bp 2. Promoteur proximal Séquence proximale en amont du gène qui contient des éléments régulateurs 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 7 Transcription Brin ADN matrice Site d'initiation : Promoteur Les promoteurs principaux contiennent des motifs d'ADN qui sont très conservés et qui se lient aux protéines du PIC Il n'y a pas d'éléments promoteurs universels → les motifs diffèrent selon les gènes Core Promoter Elements -40 +1 Le site d’initiation (Inr) est le motif du promoteur principal le plus fréquent +40 1 1 BREu TATA BREd 31/01/2022 lnr MTE OPE Boîtes TATA et séquences BRE (B Recognition Element) séquences très conservées permet la liaison de protéines (TATA Binding Proteins) MTE (Motif Ten Element) DPE (Downstream core Promoter Element) Transcription_Pr. S. Bekri 8 Transcription Brin ADN matrice Eléments de régulation distaux Distal regulatory elements 1. Des régions distales lieu de la fixation des facteurs de transcription pour activer ou inhiber la transcription. - Motifs activateurs (enhancer) - Motifs inhibiteurs (silencer) 2. Les isolants (insulator) sont des séquences qui forment des complexes ADN-protéines et régulent la structure de la chromatine et l'expression des gènes 31/01/2022 Locus control region Transcription_Pr. S. Bekri lnsulator Silencer Proximal promoter elements Enhancer Core promoter 9 Transcription Ribonucléotides triphosphates Bases majeures Adénine (purine) - Uracile (pyrimidine) Guanine (purine) - Cytosine (pyrimidine) → 4 nucléotides majeurs : ATP, CTP, GTP, UTP Bases mineures 31/01/2022 Purines : Hypoxanthine et 7-méthyl-guanine Pyrimidines : Pseudo-uracile et 4-thiouracile Transcription_Pr. S. Bekri 10 Transcription Ribonucléotides triphosphates Les ribonucléotides (nucléosides triphosphates rNTP) diffusent au centre actif de l'ARN POL II par une ouverture en forme d'entonnoir qui se rétrécit en un pore chargé négativement Hydrolyse du ribonuléoside triphosphate rNTP → rNMP + Pyrophosphate + énergie nécessaire à la polymérisation 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 11 Transcription ARN polymérases 3 ARN polymérases dans les noyaux des eucaryotes ARN polymérases I et III ARNt, ARNr… Nucléole ARN polymérase II ARNm +++ Nucléoplasme Inhibiteurs des polymérases → mort cellulaire Inhibiteur ARN POL procaryote ARN POL eucaryote Mode d'action Application Anticancéreux Actinomycine D Acridine Oui Oui Intercalants de l’ADN : → déformation structurale de l'ADN → bloque le mouvement de l’ARN Pol Amanite Non Oui Inhibe l’ARN POL II Bloque synthèse des ARNm Toxique Rifampicine Oui Non Bloque la liaison des nucléotides Antibiotique (tuberculose +++) 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 12 Transcription ARN polymérases Site actif des ARN POL très conservé au cours de l’évolution ARN POL des bactériophages et des mitochondries → une seule chaîne ARN POL II → 12 sous-unités Fait partie du complexe de pré initiation (PIC) de la transcription qui inclut un grand nombre de facteurs d’initiation de la transcription (~70 polypetides) 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 13 Transcription ARN polymérases ARN POL II → 12 sous-unités RBP1 à 12 (RNA Binding Proteins) Les sous-unités RBP1 et RBP2 forment le centre catalytique de l’enzyme RBP9 est impliquée dans l’élongation RBP3 et RBP11 impliqués dans l’assemblage de l’enzyme RBP1 constitue un sillon 2 paires de mâchoires qui permettent la fixation à l’hélice ADN une supérieure RBP1 et RBP9 une inférieure RBP5 L’ADN prend place dans ce sillon où sont localisés des charges positives de l’enzyme Près du site catalytique, se trouve un pore → entrée des rNTP vers le site actif 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 14 Transcription ARN POL II ARN polymérase II des eucaryotes : plusieurs sous-unités. La grande sous-unité possède un domaine carboxy- terminal (CTD) composé de répétitions d’un motif conservé de sept acides aminés dont cinq peuvent être phosphorylés. Etapes de la transcription Initiation Elongation Phophorylation : Kn ses Serine 2 > K1n28 Kin28 Bur1 Bur1 31/01/2022 Serine 5 Ctk1 t,... t , ,,--~ ---------------' -,, ,~ ''.. -' --,,,,,....... -:..-: --___ __ , ,, J ;: Le niveau de phosphorylation du CTD détermine la fonction de l’ARN POL II. Terminaison -- ~ ,, J Serine 7... ---- _________ , + 1 Phosphatase~ Transcription_Pr. S. Bekri Rtr1 Ssu72 Fcp1 S u72 15 Transcription Site d'initiation de la trar Boîte TATA Initiation de la transcription }-+- 1 TBP TFIIO PIC..... Permet la fixation de l’ARN POL II sur le promoteur TFIIB Contient environ 70 polypeptides Facteurs de transcription TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE et TFIIH (DABFEH) TFIID complexe de plusieurs sous-unités contient une TBP Premier facteur à se fixer sur le promoteur et plie l’ADN a peu près à angle droit et permet ainsi le recrutement de l’ARN POL II et les autres facteurs 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri CTD Autres facteurs ARN polymérase Il 16 Transcription Formation du complexe prét raosc ri ptlo nnel Initiation de la transcription S' PIC TATAAA TFIIH catalyse ensuite l’ouverture de la double hélice d’ADN (hélicase) entre les positions −9 et +2 de part et d’autre du site d’initiation de la transcription (+1) pour former la bulle transcriptionnelle r~ Promoteur ATP AOP+P1 Ouverture du promoteur L'ouverture de l'ADN par ARN POL II nécessite une ADN translocase XPB (sous-unité de TFIIH) Cycle d'initiCltioos avortées S' -., 1 Après l’initiation, les facteurs de transcription se détachent sauf le TFIIF et l’ARN POL II commence l’élongation Promoteur Élongation "'.,,, Transcrits a: rtés 3' S' TATAAA 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 17 Transcription Initiation de la transcription PIC Le médiateur est un complexe protéique qui intervient au niveau du PIC Régule l'activité de ARN POL II Relaye les signaux des facteurs de transcription directement à l’ARN POL II Les régions distales qui portent des activateurs (enhancer) ou des inhibiteurs (silencer) associées aux facteurs de transcription viennent au contact du médiateur et l’information est communiquée à l’ARN POL II Le médiateur stimule la phosphorylation de l’ARN POL II par TFIIH au niveau du domaine Cterminal (CTD - chaine linéaire composée de répétitions d'heptapeptides en tandem) → facilite la transition vers l’élongation 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 18 Transcription Elongation Incorporation du premier ribonucléotide sous forme triphosphate Création de la liaison phosphodiester au niveau du 3’OH avec un autre ribonucléotide qui va libérer son pyrophosphate → libère l’énergie nécessaire à la réaction La synthèse de l’ARN se fait bien dans le sens 5’ → 3’ Le premier ribonucléotide en 5’ est sous forme triphosphate, les autres sont sous forme monophosphate La progression de la boucle de transcription induit des torsions→ Action d’une topoisomérase pour éliminer ces torsions 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 21 Transcription Elongation La pause peut entraîner le retour en arrière de la polymérase ou son arrêt Les facteurs d’élongation stabilisent l’ARN POL II et permettent d’éviter les pauses ou le redémarrage en cas de pause L’ARN Pol II peut s'arrêter devant les nucléosomes, mais aider par le facteur d’élongation TFIIS elle peut redémarrer 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 22 Transcription Elongation Maturation de l’ARNm : Formation de la coiffe en 5’ L’ARN en formation sort par un pore L’extrémité 5’ peut être dégradée par des exonucléases Une protection de cette extrémité est assurée par des enzymes dites de ‘’capping’’ pour former une coiffe dès le début de la transcription, ARN en cours de synthèse de 20 à 30 ribonucléotides Clivage d'un phosphate en 5’ du premier rNTP (phosphatase) Incorporation d’un GMP (guanyle transférase) Méthylation sur l’azote 7 du GMP (méthyle transférase) Méthylation en 2’ sur les riboses des 2 premiers nucléotides dans la plupart des ARNm 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 24 Transcription Elongation Maturation de l’ARNm : Formation de la coiffe en 5’ Des protéines spécifiques se lient à la coiffe et forment le ‘’cap binding complexe’’ (CBC) Rôles de la coiffe Spécifique des ARNm Protège l’ARNm de la dégradation Permet l'export de l'ARNm vers le cytoplasme Permet l’initiation de la traduction par recrutement de la petite sous-unité du ribosome 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 25 Transcription Elongation Maturation de l’ARNm : Epissage L'épissage est un processus co-transcriptionnel, les éléments qui interviennent pour son exécution et sa régulation font partie de la machinerie transcriptionnelle Excision des introns et ligation des exons → ARNm fonctionnel La séquence intronique des ARNm contient : En 5’ une séquence GU : site donneur d’épissage En 3’ une séquence AG : site accepteur d’épissage. Un site A de branchement à environ 30 nt du site accepteur 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 26 Transcription Elongation Maturation de l’ARNm : Epissage Complexe multimérique : spliceosome snRNP (small nuclear ribonucléoproteins particules). snRNP = ARNsn + protéines. 5 snRNP : U1, U2, U4, U5, U6, (U car riche en uracile) U1 se place sur le site donneur (5’) U1 Complexe E U2 se place sur le A de branchement U1-U2 Complexe A Recrutement des autres SnRNP = spliceosome 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 27 Transcription Elongation Maturation de l’ARNm : Epissage Reconnaissance des sites au niveau des jonctions intron-exon Recrutement des snRNP Clivage au niveau du site 5’ Transestérification entre la guanine du site 5’ et l’adénine du site de branchement (Formation du lasso de Lariat) Clivage du site 3’ Ligation des exons Le spliceosome et le lasso se détachent Le lasso est dégradé Les sous-unités du spliceosome se dissocient 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 28 Transcription Elongation Maturation de l’ARNm : Epissage Des séquences activatrices et inhibitrices participent à la régulation de l’épissage en s’associant à des Protéines riches en sérines et en arginines (SR) Protéines hnRNP (heterogenous nuclear ribonucleoproteins) → activent l’épissage → inhibent l’épissage Séquences introniques ISE : intronic splice enhancer ISS : intronic splice silencer Séquences exoniques ESE : exonic splice enhancer ESS : exonic splice silencer Ces séquences influencent l’épissage alternatif 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 30 Transcription Elongation Maturation de l’ARNm : Epissage alternatif 1 pré-ARNm peut permettre de générer plusieurs ARNm matures Les sites d’épissage utilisés au cours de la maturation peuvent aboutir à l’inclusion ou l’exclusion d’un exon donné Les protéines produites peuvent avoir des fonctions différentes → augmente la diversité Les principaux types d’épissage alternatif Un exon est ou non inclus (exon cassette), Des exons sont mutuellement inclus/exclus de l’ARNm, Sélection des sites donneurs/accepteurs d’épissage → un saut d’exon en 5’ ou en 3’ Un intron peut être retenu dans l’ARNm 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 31 Transcription Terminaison de la transcription Signal de terminaison de transcription ou séquence signal de polyadénylation en fin de séquence génique conservée au cours de l’évolution L’ARN POL II transcrit cette séquence en AAUAAA Cette séquence sur l’ARNm induit le recrutement de protéines spécifiques qui se lient au pre-ARNm et à l’ARN POL II et induisent l’activité d’une ribonucléase spécifique qui clive le pré-ARNm en cours de synthèse après ~10 à 15 nt en 3’ de cette séquence La polyadénylate polymérase ajoute une succession de A (200 à 250) en 3’OH de l’ARNm → queue poly(A) (ne provient pas de la séquence présente sur l’ADN génomique) Dissociation de l’ARN POL II 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 32 Transcription Terminaison de la transcription Rôles de la queue poly A Protection contre la dégradation Transport nucléo-cytoplasmique Recrutement du ribosome pour la traduction Signal de polyadénylation différentiel Il peut exister plusieurs sites de polyadénylation sur un gène La transcription peut s’arrêter à un premier signal de terminaison dans un type cellulaire pour générer un transcrit. La transcription peut continuer et s’arrêter au niveau d’un 2ème signal de terminaison en aval du premier dans une cellule différente → 2 ARN pré-messager différents → 2 protéines différentes 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 33 Transcription Export de l'ARNm vers le cytoplasme Processus critique L'ARNm en cours de synthèse est lié à de nombreuses protéines RNA-binding proteins (RBP) pour former des particules de ribonucléoprotéines (RNPm) RNPm mature est transloqué au niveau du pore nucléaire Intervention de protéines d’export → export vers le cytoplasme Contrôle qualité nucléaire 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 34 Transcription Dégradation des ARNm cytoplasmiques Demi-vie des ARNm très courte Première étape déadénylation → raccourcissement de la queue poly(A) Puis les ARN messagers sont dégradés selon deux voies Voie majeure (complexe Dcp1/Dcp2) : éliminer la coiffe en 5’ Voie mineure (exosome cytoplasmique + complexe SKI) dégrade l’extrémité 3’ 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 35 Transcription Dégradation des ARNm aberrants Malgré le premier niveau de contrôle qualité dans le noyau, des ARNm aberrants peuvent être exportés dans le cytoplasme Ces ARNm peuvent être traduits en donnant des produits toxiques et monopoliser inutilement la machinerie de la traduction Il sont reconnus par une machinerie complexe et dégradés 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 36 Transcription Dégradation des ARNm aberrants Trois types de transcrits aberrants : ARNm contenant un codon stop précoce (transcrits non-sens). ARNm ne possédant pas de codon stop (transcrits non-stop) ARNm contenant des séquences entrainant le blocage de la traduction (transcrits no-go) Ces transcrits sont respectivement reconnus et dégradés par trois mécanismes de contrôle qualité : Nonsense-Mediated mRNA Decay Non-Stop mRNA Decay No--‐Go mRNA Decay NMD NSD NGD Cette dégradation se fait de façon coordonnée avec la traduction 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 37 Transcription : 3D Les promoteurs et les régions terminales des gènes se colocalisent pendant la transcription, formant une structure en boucle → coordination entre les différents processus Initiation Fin de transcription Epissage Mercer TR, Genome Reseach 2013 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 38 Transcription Processus complexe Plusieurs centaines d’éléments intervenant de façon coordonnée Dépendant de l’énergie +++ Plusieurs points de contrôle qualité Un gène → plusieurs dizaines de protéines possibles 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 39 Transcription Sources Jean-Baptiste Briand. Etude du contrôle de la transcription envahissante par la terminaison de la transcription. Biologie moléculaire. Université Paris Sud - Paris XI, 2015 Elodie Zhang. Etude de facteurs impliqués dans le contrôle-qualité de l’expression des gènes, chez saccharomyces cerevisiae. Biologie moléculaire. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2017 Dvinge H, Febs Letter 2018 Dujardin G, médecine/sciences 2016 Xie Y, Traffic 2019 Chuangye Y Cold Spring Harb Perspect Biol 2019 Wang B, Biochim Biophys Acta. 2017 31/01/2022 Transcription_Pr. S. Bekri 40