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TEMA 9. TRANSPORTE TRANSMEMBRANA 1) DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS. PÉPTIDOS SEÑAL. 2) TRANSPORTE DE PROTEÍNAS A LAS MITOCONDRIAS. Translocadores proteícos. TOM40, TIM22, TIM23 , OXA, SAM y MIA40. Diferentes vías hacía la matriz mitocondrial, la membrana interna, el espacio intermembrana y la membran...

TEMA 9. TRANSPORTE TRANSMEMBRANA 1) DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS. PÉPTIDOS SEÑAL. 2) TRANSPORTE DE PROTEÍNAS A LAS MITOCONDRIAS. Translocadores proteícos. TOM40, TIM22, TIM23 , OXA, SAM y MIA40. Diferentes vías hacía la matriz mitocondrial, la membrana interna, el espacio intermembrana y la membrana externa. 3) TRANSPORTE DE PROTEINAS A LOS CLOROPLASTOS. Chaperonas citosólicas. Importación de proteínas al estroma y al tilaciode. 4) TRANSPORTE DE PROTEÍNAS A LOS PEROXISOMAS. Las mitocondrias y los cloroplastos: aspectos comparados - 2 membranas, los cloroplastos tienen un compartimiento más (el tilacoides) - Gradientes electroquímicos y síntesis de ATP (ATPasa de clase F) - Proteínas de transporte de electrones parecidas - Crecimiento y división desfasados respecto del ciclo celular - Crecimiento por incorporación de proteínas y lípidos. División por fisión. - Vía evolutiva: incorporación de bacterias fotosintéticas y no fotosintéticas en células ancestrales eucariotas -Transferencia de la mayoría del DNA al núcleo → importación de proteínas 1. DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS. PÉPTIDOS SEÑAL Existen muchas más secuencias! Proteínas de mitocondrias y cloroplastos En el genoma nuclear Humano: 13 proteínas Humano: 1000 proteínas Depende del organismo En DNA mitocondrial Transporte de proteínas entre orgánulos * * * 2. TRANSPORTE DE PROTEÍNAS A LAS MITOCONDRIAS - Matriz - Membrana interna - Espacio intermembrana - Membrana externa MICOS: sistema mitocondrial organizador de sitios de contacto y crestas (Org. de la Célula) Van der Laan et el, 2016 Current Opinion in Cell Biology 41:33-42 Direccionamiento de proteínas a las mitocondrias in vitro Mitocondrias con la cadena respiratoria funcional Importación de proteínas a la mitocondria: mapa chaperonas Los translocadores proteicos TOM, TIM22, TIM 23 , OXA y SAM TOM 40: translocador de la membrana externa SAM: inserción de proteínas en la membrana externa TIM: translocadores de la membrana interna Ø 1.5-2.5 nm TIM 23: Translocación hacia el espacio de la matriz o a la membrana interna TIM 22: Inserción de proteínas integrales en la membrana interna OXA: inserción de proteínas en la membrana interna Three protein translocators in the mitochondrial membranes. The TOM and TIM complexes and the OXA complex are multimeric membrane protein assemblies that catalyze protein transport across mitochondrial membranes. The protein components of the TIM22 and TIM23 complexes that line the import channel are structurally related, suggesting a common evolutionary origin of both TIM complexes. As indicated, one of the core components of the TIM23 complex contains a hydrophobic α-helical extension that is inserted into the outer mitochondrial membrane; the complex is therefore unusual in that it simultaneously spans two membranes. Importación de proteínas a la matriz mitocondrial chaperonas Transporte a la matriz mitocondrial 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Precursores desplegados (chaperonas tipo Hsc70) Unión a un receptor TOM20/22 Transferencia al translocador de la membrana externa (TOM40) Translocación a través de TOM40 Sitio de contacto. Translocación a través de TIM23 Recepción y arrastre de la proteína por el complejo PAM (contiene la chaperona Hsc70), hidrólisis de ATP y corte de la señal Plegamiento con o sin asistencia de chaperonas ¿Cómo se hizo? Estudio del transporte hacia la matriz mitocondrial usando proteínas de fusión: el experimento. Proteína de fusión: Péptido señal (31aa)-Espaciador (51aa)-Dihidrofolato reductasa (187aa) Resultado Transporte hacia la matriz mitocondrial: el péptido señal Rojo: aa con carga + Amarillo: aa no polares Azul: aa de cadena lateral polar no cargados Potencial de membrana int. (200mV) creado por el gradiente de H+, fruto de la Ej: Citocromo oxidasa 1) 2) 3) 4) N-t, 20-50 aa Secuencia variable Hélice-α anfipática con carga positiva (necesaria para su función) Eliminación por una peptidasa señal fosforilación oxidativa electroforesis Transporte hacia la matriz mitocondrial. Requerimiento energético. 1) Chaperonas citosólicas Hidrólisis de ATP 2) Gradiente electroquímico 3) Motor asociado al translocodor de la membrana interna (PAM) Hidrólisis de ATP Transporte hacia la matriz mitocondrial (características) 1 Secuencia señal reconocida por un receptor específico TOM20/22 y que se corta en la matriz Proteína desplegada para cruzar las 2 membranas a través de los translocadores (TOM40 y TIM23) en los puntos de contacto entre las 2 membranas 3 puntos de consumo energético Chaperonas en citosol y matriz (ATP) Potencial de membrana (H+) Transporte de proteínas a las mitocondrias Diferentes chaperonas - Matriz - Membrana interna - Espacio intermembrana - Membrana externa Los translocadores proteicos TOM, TIM, OXA y SAM TOM 40: translocador de la membrana externa SAM: inserción de proteínas en la membrana externa TIM: translocadores de la membrana interna Ø 1.5-2.5 nm TIM 23: Translocación hacia el espacio de la matriz o a la membrana interna TIM 22: Inserción de proteínas integrales en la membrana interna OXA: inserción de proteínas en la membrana interna Three protein translocators in the mitochondrial membranes. The TOM and TIM complexes and the OXA complex are multimeric membrane protein assemblies that catalyze protein transport across mitochondrial membranes. The protein components of the TIM22 and TIM23 complexes that line the import channel are structurally related, suggesting a common evolutionary origin of both TIM complexes. As indicated, one of the core components of the TIM23 complex contains a hydrophobic α-helical extension that is inserted into the outer mitochondrial membrane; the complex is therefore unusual in that it simultaneously spans two membranes. Transporte a la membrana mitocondrial interna Más de 1 secuencia señal 3 rutas diferentes: A, B y C Tim23 Tim23 Tim22 Ruta A   Proteínas con secuencia señal de matriz mitocondrial y una secuencia de parada de transferencia. Receptor Tom20/22 TIM23 Integración en la membrana Ruta B Proteínas con secuencia señal de matriz y secuencias (hidrofóbicas) reconocidas por la proteína Oxa1 Receptor: Tom20/22 TIM23 Desvío por la matriz También las proteínas codificadas en el DNA mitocondrial son insertadas por Oxa1 ¿Cómo funciona TIM23? Puede translocar proteínas hacía la matriz o integrarlas a la membrana interna. ¡OJO! Todas son proteínas citosólicas con secuencia señal para la mitocondria. Supercomplejo, sitios de contacto cambio Vía A TIM21 COX: citocromo c oxidasa bc1: complejo citocromo bc1 The TIM23 complex switches between an inner membrane sorting form and a matrix import form (track switch model). At an early stage of preprotein import, the TOM complex and the TIM23 complex directly associate to form a supercomplex for protein transfer from the outer to the inner membrane. At the level of the inner membrane, the TIM23 complex switches between two distinct forms depending on the signal information within the incoming substrate protein. Preproteins with an additional hydrophobic sorting signal associate with a PAM-free form of the TIM23 complex that is coupled to the cytochrome bc1 complex and cytochrome c oxidase (COX) via Tim21. This complex form catalyzes Dw-dependent preprotein sorting into the inner membrane. For preprotein import into the matrix, the TIM23 complex has to switch gears. It releases Tim21 and recruits the ATP-driven import motor PAM. Ruta C (“carrier pathway”) Proteínas con múltiples secuencias señal de mitocondrias, 6 segmentos transmembrana, y SIN secuencia señal de matriz. Receptor: Tom70 Con la ayuda de los “pequeños TIMs” Los “pequeños” Tim TIM22 Resumen de las 3 vías COX/bc1 PAM La inserción cotraduccional de proteínas sintetizadas en la mitocondria a la membrana interna *Proteínas altamente hidrofóbicas Mitochondrial genomes mainly code for hydrophobic proteins. The percentage of membrane proteins of all gene products encoded by the genomes of mitochondria (of the indicated organisms) and E. coli was calculated. Transmembrane domains were predicted using the TMpred algorithm. Proteínas sintetizadas en la mitocondria Humanos: 13 genes Levadura: 8 genes Mitochondrially encoded proteins in human and baker's yeast. (A) Mitochondrially encoded proteins of humans. Numbers refer to the amino acid residues of the proteins. Transmembrane domains in the proteins are indicated as red boxes. (B) Yeast mitochondrial DNA codes for eight proteins which represent subunits of cytochrome c reductase (cytochrome b), cytochrome c oxidase (Cox1; Cox2; Cox3), the ATP synthase complex (Atp6, Atp8, Atp9), and the ribosome (Var1). Cox2 and Atp6 are synthesized with N-terminal leader peptides which are removed by proteolytic cleavage of the inner membrane peptidase (Imp1/Imp2) and the Atp23 protease, respectively [85-87]. Acoplamiento de Cox1 (citocromo C oxidasa 1) síntesis a la inserción en la membrana interna (inserción cotraduccional) Mss51: activador traduccional Regulation of Cox1 synthesis. The protein Mss51 plays a central role in this process as this translational activator connects Cox1 synthesis to Cox1 assembly. Together with Pet309, Mss51 mediates translation of COX1 mRNA (1). Newly synthesized Cox1 is co-translational inserted into the inner mitochondrial membrane with the help of Oxa1 and Mba1 (2). Newly inserted Cox1 sequesters the Mss51 protein into a complex with Cox14 and Coa1 (3). This binding of Mss51 to Cox1 thereby prevents Mss51 to activate the synthesis of additional Cox1. Cox1 is further matured by the addition of the co-factors copper (aided by Cox15, Cox17, Cox19, and Cox23) and heme (involving Cox10 and Cox15), and the protein can continue to assemble into the functional cytochrome c oxidase complex (4). This assembly liberates Mss51 from the newly synthesized Cox1 (5), thus enabling Mss51 to activate translation of the COX1 mRNA (1). By this mechanism the level of de novo synthesis of Cox1 is adjusted to amounts that can be successfully assembled. Transporte al espacio intermembrana - Matriz - Membrana interna - Espacio intermembrana - Membrana externa Transporte al espacio intermembrana 1 ó más secuencias señal 2 rutas diferentes: A y B además de cisteínas Transporte al espacio intermembrana Ruta A, igual que la importación a la membrana interna con la intervención final de una peptidasa en la cara externa de la membrana interna Ruta B, maquinaria de ensamblaje MIA40 peptidasa Ruta B: Importación de proteínas ricas en cisteínas y su ensamblaje por MIA40. Proteínas con señal de residuos hidrofóbicos y cisteínas para el espacio intermembrana. Ejemplo: los pequeños TIMS. 1. 2. 3. 4. En el citosol el precursor está en un estado reducido y desplegado. Translocación por TOM40. Unión de MIA40 (oxirreductasa del espacio intermembrana) a través de interacciones hidrofóbicas y uniones SS intermoleculares transitorias. Transferencia de e- y formación de S-S → plegamiento. Transporte a la membrana externa - Matriz - Membrana interna - Espacio intermembrana - Membrana externa Vía del barril-β Precursores con 2 secuencias consecutivas codificando barriles-β (hairpin loop) en el extremo C-terminal. Ejemplos: TOM40 y porina. puente 1. 2. 3. 4. Importación del precursor por TOM40. Unión de los pequeños TIMs. Formación de un supercomplejo transitorio entre TOM40 y SAM con TOM22 de puente. Plegamiento de la proteína en la membrana externa. Control de calidad en la importación mitocondrial * Más en el tema 14 Vigilancia por chaperonas citosólicas Vigilancia de translocadores Vigilancia del plegamiento correcto de las proteínas de la matriz Song et al (2021) Nature Reviews Molecular Cell Biology 5:54-70 Vigilancia de la formación de complejos proteicos grandes ¿Y si la importación a la mitocondria no funciona? Enfermedades mitocondriales, enfermedades neurodegenerativas y cáncer. Palmer et al. 2021 FEBS Letters 595: 1107-1131 Resumen Proteínas destinadas a otro lugar que no es la matriz contienen de forma usual 2 o más secuencias señal, una de las cuales puede ser la secuencia señal de matriz (SSM). Proteínas destinadas a la membrana interna pueden integrarse por TIM23 o TIM22. TIM20/22-TOM40-TIM23  proteína con SSM y secuencia de parada  proteína con SSM y secuencia OXA → desvío por la matriz Proteínas sintetizadas en la mitocondria se importan a la matriz interna por OXA1. TIM70-TOM40-TIM22  No SSM, pero secuencias internas. Intervención de los pequeños TIMs. Proteínas destinadas al espacio intermembrana TOM20/22-TOM40-TIM23-peptidasa señal  Proteína con SSM y secuencia para el espacio intermembrana, además una señal para una proteasa que corta la SSM y otra señal para una proteasa del espacio intermembrana. TOM40  Proteína con señal de residuos hidrofóbicos y cisteínas. Plegamiento transitorio por MIA40 en el espacio intermembrana y formación de puentes S-S estables. Inserción de proteínas con barril-β en la membrana externa por un supercomplejo TOM40-SAM. 3. TRANSPORTE DE PROTEÍNAS A LOS CLOROPLASTOS ESTROMA - péptido señal amino terminal. Parecido a la mitocondria. Carga total +, pero no forma una hélice anfipática. - translocadores TOC y TIC (evol. rel. recientes), diferentes a la mitocondria, evol. independiente, sitios de contacto - Estroma* - chaperonas, péptido desplegado, hidrólisis de ATP y GTP. - Espacio intermembrana - ¡No hay gradiente electroquímico de H+! - Membrana Externa LOS TILACIODES - Membrana Interna - péptido señal hidrofóbico del tilacoide - Los tilacoides* - 4 rutas, translocadores ancestrales - Membrana de los tilacoides - 100 proteínas codificadas en el cloroplasto, 3000 en el citosol - ¡Sí, hay gradiente electroquímico de H+ El desarrollo de los cloroplastos y topología Formation of chloroplasts from proplastids begins by the light-induced budding of the inner membrane. This membrane is equivalent to the plasma membrane of the ancestral photosynthetic bacterium thought to have been incorporated into an early eukaryotic cell. The proplastid in darkadapted cells contains only the outer and inner chloroplast membranes. Light triggers the synthesis of chlorophyll, phospholipids, and chloroplast stroma and thylakoid proteins, and the budding of small vesicles from the inner chloroplast membrane. As the proplastid enlarges, some of the spherical vesicles fuse, eventually forming one continuous set of flattened thylakoid vesicles, some of which stack into grana. Thus, in the mature chloroplast, the stroma is equivalent to the bacterial cytoplasm; the thylakoid membrane, to the bacterial plasma membrane; and the thylakoid lumen, to the exterior of the bacterial cell. [See D. von Wettstein, 1959, J. Ultrastruct. Res. 3:235.] Chaperonas que llevan el péptido a la membrana del cloroplasto fosforilación Chaperonas citosolicas: El reconocimiento depende del péptido señal. Hsp 70 y Hsp 90: para péptidos señal NO fosforilados. Reconocidos por el receptor Toc 64 → Toc 34/159 → Toc 75 (canal en forma de barril β). Toc 64: receptor, Toc 34/159 (hidrolisis de GTP) Toc 75 : canal, barril β Hsp70 y 14-3-3: para péptidos señal fosforilados. Reconocidos por los receptores Toc 34/159 → Toc 75 (canal en forma de barril β). Importación de proteínas al estroma Señal, 6-12 residuos hidrofóbicos precedidos por algún aa básico (+) Receptores TOC reconocen la proteína y la presentan a translocador. Complejos TIC, translocan la proteína a través de la membrana interna Hsc70-like chaperona, tira del péptido Peptidasa en el estroma, corta la señal Energía: GTP y ATP NO HAY GRADIENTE DE H+ Translocación al tilacoide (Org. de la Célula) Energía: gradiente electroquímico y ATP Proteínas sec: translocadores bacterianos y del RE SRP: homologo a la SRP del RE TAT: translocador que puede importar proteínas plegadas Inserción espontánea: no necesita translocador 4. TRANSPORTE DE PROTEÍNAS A LOS PEROXISOMAS 1-0.2µm Esferas con 1 membrana Lugar de oxidación de lípidos y destoxificación (hepatocitos) Producción de precursores de carbohidratos No generan ATP como en las mitocondrias o cloroplastos No tienen DNA o ribosomas Importación Importación La información necesaria para la importación está en la secuencia PTS1 (C-t, SKL) o PTS2 (N-t). PTS1 6 1 -receptor soluble para PTS1 es Pex5, para PTS2 es Pex7 2 Dislocasa AAA-ATPasa 5 Poro transitorio 3 Ø10-15nm PTS1 no se elimina 4 Complejo exportador - se importan plegadas a través del translocador (compuesto de peroxinas). El receptor entra también. - el péptido señal PTS1 no se elimina. El receptor se exporta por un complejo exportador, se añade una ubiquitina y se extrae de la membrana. - necesita hidrólisis del ATP. No hay gradiente electroquímico. PTS receptor dynamics during peroxisomal matrix protein import. The shuttling of PTS receptors and co-receptors between the cytosol and the peroxisomal matrix can be divided into distinct steps: cargo-receptor recognition, receptor-cargo complex translocation across peroxisomal membrane, dissociation of receptor-cargo complex, receptor export to the cytosolic side of peroxisomal membrane, receptor ubiquitination and release to the cytosol, and deubiquitination for next round import. D: docking subcomplex; R: RING subcomplex; RR: receptor recycling machinery. The circle associated with the cargo denotes the PTS. Las vías de importación: resumen básico p. s. Nterminal p.s. interno Hsp70 y 14-3-3 p.s. fosforilado Hsp70/90 64 mitocondrias cloroplastos receptor soluble, vuelve al citoplasma peroxisomas Los péptidos señal son parecidos.. N-terminal, dominios α-helicales, residuos hidrofóbicos etc. Kunze and Berger (2015) Frontiers in Physiology 6:1-27. …pero acaban en el orgánulo correcto N-terminal targeting signals determine the transport route of proteins by the interaction with the receptor proteins. (A) Competition of receptor proteins: the N-terminal amino acid sequence of a newly synthesized protein can interact with all receptor proteins, which compete for the peptide sequence (peroxisomal Pex7, mitochondrial Tom20, chloroplast Toc34, and Srp54 for the ER) and with additional cytosolic proteins that might affect these interactions (Hsp70, Hsp90, 14-3-3 proteins). The choice of the transport route is based on the relative affinity of the peptide sequence to different receptor proteins. (B) Different import mechanisms generate a hierarchy of targeting signals: An N-terminal amino acid sequence is sequentially scanned by diverse receptor proteins, because these interactions occur at different time points during the production and folding of the protein. A newly synthesized protein either binds to the SRP to become translated into ER or it finishes translation in the cytosol Next, the protein either becomes folded or remains unfolded due to its interaction with chaperones, Unfolded proteins can interact with the mitochondrial receptor Tom20, the chloroplast receptor Toc34 or the Sec61 complex of the ER (translocon), Finally, folded proteins can either interact with the soluble receptor protein Pex7, which initiates their transport into peroxisomes, or they remain in the cytosol. Bibliografía básica Alberts et al. (2016) Biología molecular e la célula 6ª ed. Capítulo 12.Transporte de proteínas al interior de mitocondrias ,cloroplastos y peroxisomas. Lodish et al. (2016) Molecular Cell Biology. 8th ed. Chapter 13.4 y 13.5. Sorting of proteins to mitochondria, chloroplasts and peroxisomes. Bibliografía específica Kunze and Berger (2015) The similarity between N-terminal targeting signals for protein import into different organelles and its evolutionary relevance. Frontiers in Physiology 6:1-27. Ott y Herrmann (2010) Co-translational insertion of mitochondrially encoded proteins. Biochimica et Biophysica Acta 1803:767-775. Song et al (2021) Quality control of the mitocondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology 4:54-70. Wiedemann und Pfanner (2017) Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annu. Rev. Biochem 86:685-714. Illustrated in Figure 1 are two examples of multiple fluorescent protein labeling in living cells using fusion products targeted at sub-cellular (organelle) locations. The opossum kidney cortex proximal tubule epithelial cell (OK line) presented in Figure 1(a) was transfected with a cocktail of fluorescent protein variants fused to peptide signals that mediate transport to either the nucleus (enhanced cyan fluorescent protein; ECFP), the mitochondria (DsRed fluorescent protein; DsRed2FP), or the microtubule network (enhanced green fluorescent protein; EGFP). A similar specimen consisting of human cervical adenocarcinoma epithelial cells (HeLa line) is depicted in Figure 1(b). The HeLa cells were cotransfected with sub-cellular localization vectors fused to enhanced cyan and yellow (EYFP) fluorescent protein coding sequences (Golgi complex and the nucleus, respectively), as well as a variant of the Discosoma striata marine anemone fluorescent protein, DsRed2FP, targeting the mitochondrial network. La proteína fluorescente verde Estudio del transporte de proteínas a orgánulos La historia de la GFP Roger Tsien, USA Osamu Shimomura, USA Martín Chalfie, USA The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the Nobel Prize in Chemistry for 2008 jointly to Martin Chalfie, Osamu Shimomura and Roger Y. Tsien, "for the discovery and development of the green fluorescent protein, gfp". P. Balaram, “Missing Out on a Nobel Prize,” Current Science, 95: 997-998, 25 october 2008 , nos recuerda que el Premio Nobel de Química de 2008 que reconoce a Osamu Shimomura, Martin Chalfie y Roger Tsien por “el descubrimiento y desarrollo de la proteína fluorescente verde, GFP” ha olvidado a alguien. El “camionero” Douglas C. Prasher (excientífico descubridor del gen de la proteína GFP que abandonó la ciencia en 1997 tras una brillante, pero corta carrera). Mutantes de la GFP