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TEMA 14: DEGRADACIÓN POR AUTOFAGIA. DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS Y ENFERMEDADES HUMANAS. 1) AUTOFAGIA: DIFERENTES TIPOS 2) MACROAUTOFAGIA Y MICROAUTOFAGIA 3) AUTOFAGIA MEDIADA POR CHAPERONAS (CMA) 4) DIFERENTES TIPOS DE MITOFAGIA 5) AUTOFAGIA Y ENFERMEDADES HUMANAS ¿Para qué sirve la degradación de prot...

TEMA 14: DEGRADACIÓN POR AUTOFAGIA. DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS Y ENFERMEDADES HUMANAS. 1) AUTOFAGIA: DIFERENTES TIPOS 2) MACROAUTOFAGIA Y MICROAUTOFAGIA 3) AUTOFAGIA MEDIADA POR CHAPERONAS (CMA) 4) DIFERENTES TIPOS DE MITOFAGIA 5) AUTOFAGIA Y ENFERMEDADES HUMANAS ¿Para qué sirve la degradación de proteínas? 1) Sistema de reciclaje. aa → síntesis de proteínas nuevas 2) Control de calidad: degradación de proteínas dañadas 3) Defensa celular: eliminación de patógenos 4) Homeostasis celular: limita la vida de una proteína *proceso específico y muy regulado 2 mecanismos: lisosomas/autofagia y ubiquitina/proteasoma Tráfico celular a los lisosomas y autolisosomas exocitosis 1) AUTOFAGIA: DIFERENTES TIPOS. Autofagia (auto-digestión citoplasmica, Christian DeDuve 1966) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) La mayor vía de tráfico que lleva carga a la vacuola/lisosoma para su degradación y reciclaje. Es evolutivamente conservada y existe en casi todos los eucariotas. El nivel basal contribuye a correcto equilibrio de funciones celulares básicas. (homeostasis y control de calidad) balance energético. Reciclaje de nutrientes reciclar partes de la célula que están obsoletas degradación de complejos proteicos que no se pueden degradar por proteasomas remodelado de tejidos defensa celular contra patógenos puede ser inducida como respuesta adaptativa (ej. estrés nutricional) sirviendo como una fuente de energía Tipos de Autofagia Macroautofagia* Mitofagia* Peroxifagia Reticulofagia etc… NS S/ NS S S Microautofagia * con chaperonas NS S Autofagia mediada por chaperonas (CMA)* S S: selectivo; NS: no selectivo La autofagia es un campo muy joven. Incremento en la investigación sobre la autofagia. Premio Nobel en Medicina y Fisiología 2016 Yoshinori Ohsumi Mecanismo de la autofagia 2) MACROAUTOFAGIA Y MICROAUTOFAGIA inducida Pie de figura Cytosolic proteins can enter the lysosome for degradation by at least three autophagic pathways. a | During macroautophagy, proteins are sequestered along with other cytosolic components and organelles by a de novo-formed isolation membrane that expands and seals to form a double-membrane-bound vesicle, the autophagosome. Degradation occurs when autophagosomes fuse with lysosomes. Selective variations of this process, in which distinct substrates (aggregate proteins or organelles) are targeted for degradation, and their names, are also depicted. b | During microautophagy, invaginations at the surface of the lysosome or late endosomes trap cytosolic material, including proteins, and are then internalized after membrane scission and degraded in the lumen of the organelle. Cytosolic material can be sequestered 'in bulk' or selectively with the help of a cytosolic chaperone that recognizes the substrates. c | During chaperone-mediated autophagy, soluble cytosolic proteins containing a targeting motif are recognized by the cytosolic heat shock cognate 70 (HSC70) chaperone and its co-chaperones, which deliver the substrate to the membrane of the lysosome. After docking onto the cytosolic tail of the lysosomal receptor, the substrate protein unfolds and crosses the lysosomal membrane through a multimeric complex. Substrate translocation requires a lumenal HSC70 chaperone and is followed by rapid degradation in the lysosomal lumen. Iniciación causada por estrés: falta de nutrientes, hipoxia, estrés oxidativo, agregación de proteínas, estrés en el RE. Reclutamiento de proteínas ATG a sitios llamados PAS (phagophore assembly sites). 2) Nucleación de una doble membrana de aislamiento en forma de copa (fagóforo). 3 Posiblemente a partir de la membrana del RE. ¿Participación de otras membranas? 3) Secuestración de la carga y expansión. Dependiente de la 4 5 poliubiquitación de la carga y reclutamiento de receptores selectivos de autofagia. 4) Cierre del fagóforo. Se forma el autofagosoma. 6 En todos los pasos hasta aquí participan las proteínas ATG. 5) Maduración. Las proteínas ATG se despegan gradualmente de la membrana externa y se recluta la maquinaria para el transporte hacía los lisosomas (quinesina) y la 7 fusión con los lisosomas (SNARE etc). ATG: genes relacionados con la autofagia. Descubiertos en los años 6) Fusión con el lisosoma formando 90. Hasta hoy aprox. 30. Median muchos pasos. Tiempo de formación un autolisosoma. de un autofagosoma en mamíferos: 5-10 min. Ø: 0,5-1,5 µm. 7) Reciclaje de nutrientes Los pasos en la autofagia 1 2 1) El sellado de un autofagosoma Doble membrana Durante la autofagia el fagóforo con doble membrana se expande, y al final el autofagosoma se cierra con la ayuda de ESCRT I y III. Asociación de complejos SNARE y fusión de la membrana del autofagosoma con el lisosoma formando un autolisosoma. (NOTA: la membrana interna del autofagosoma se degrada) (Zhen at el. (2021) The EMBO Journal) De dónde viene la membrana del autofagosoma? ¿RE o mitocondria? Además MP, Golgi, ERGIC, ERES endosomas de reciclaje. HOT TOPIC Complejos ESCRT Modelo de “cuna” Formación de vesículas COPII Hidrólisis de GTP GEF GAP asociada a la vesícula A) Sec12 (GEF) recluta Sar1, activación e inserción de la hélice-α (curvatura) B) Reclutamiento de Sec23/24, reconocimiento de la carga por Sec24, unión de Sec13/31 (curvatura). Sec16 y TFG: factores que organizan la cubierta. C) Hidrolisis de Sar1-GTP provocada por una GAP asociada a la membrana de la vesícula y desprendimiento de la vesícula. No intervienen ni la dinamina ni las proteínas BAR. D) Pérdida de la cubierta Un modelo para el contacto entre ERES-ERGIC y la biogénesis del autofagosoma. homeostasis falta de nutrientes ERES se remodela y contacta al ERGIC mediante proteínas de amarre (TMED9) (distancia 23nm). SEC12 relocaliza al ERGIC y se forman vesículas COPII que incorporan la LC3 lípidada. Sirven para la formación del fagóforo. Asociación de ATGs. a In steady-state conditions, SEC12 (dark red oval) associates with CTAGE5 (purple oval) and localizes to the ERES. TFG (orange oval) tethers ERES and COPII vesicles for protein cargo transport to the ERGIC and Golgi. b Upon starvation, SEC12-ERES is enlarged and surrounds the ERGIC, the process of which is dependent on FIP200 (green oval) and CTAGE5. The remodeled ERES forms a contact with the ERGIC via TMED9–SEC12 interaction, which is independent of TFG and leads to the relocation of SEC12 to the ERGIC (i) and/or transactivation of COPII vesicle formation on the ERGIC by ERES-localized SEC12 (ii). c The ERES–ERGIC contact triggers the assembly of ERGIC–COPII vesicles as a membrane template for LC3 lipidation, a potential vesicular pool for the assembly of the pre-autophagosomal membrane. Li et al. (2022) Cell Research 32:119 – 138 Microautofagia No selectiva: implica autofagia de citoplasma por la membrana lisosomal mediante la formación de un tubo autofagico y la fisión de vesículas. Es en parte constitutiva pero puede ser inducida por falta de nitrógeno. Ayuda en mantener el tamaño del lisosoma, la homeostasis celular y la supervivencia en condiciones de falta de nitrógeno. Selectiva: ayudan chaperonas. selectiva tubo autofagico con restricción en el cuello no selectiva *Complejos ESCRT 3) AUTOFAGIA MEDIADAD POR CHAPERONAS (CMA) Una forma selectiva de la autofagia para translocar proteínas citosólicas una por una a través de la membrana (no degrada orgánulos). Existe solamente en mamíferos. -Únicamente degrada proteínas citosólicas con una secuencia señal aminoterminal KFERQ (≈ 30 % de proteínas citosólicas). -El complejo LAMP-2A (Lysosome-asociated membrane protein type 2ª) es responsable para la translocación. Las proteínas se translocan una por una al lisosoma. -CMA es constitutivamente activa en muchas células pero puede ser activada por estrés nutricional. Muchas veces macroautofagia y CMA actúan de manera sincronizada o secuencial. KFERQ Resumen 1) La autofagia es una vía que lleva material a los lisosomas para su degradación y reciclaje. 2) La autofagia se puede dividir en 3 procesos: 1) La (macro)autofagia. Puede ser inespecífica (grandes volúmenes de citoplasma o específica (orgánulos y microorganismos). Formación de un fagóforo que se fusiona con los lisosomas. 2) La microfagia. Se secuestran componentes citosólicos directamente por la membrana lisosomal. No se conoce el mecanismo. 3) La autofagia mediada por chaperonas (CMA). Se translocan proteínas desplegadas (con una secuencia KFERQ) con la ayuda de chaperonas a través de la membrana lisosomal. 3) Las autofagias son procesos que contribuyen a la homeostasis entre síntesis proteica y degradación. Son procesos constitutivos en muchas células pero se activan máximamente en situaciones de estrés como por ejemplo estrés nutricional o estrés por daño proteico. La mitocondria Siglo 19: observación con el MO 1960s: producción de energía por fosforilación oxidativa (OXPHOS) “powerhouse of the cell” Después: Papel en transducción de señales metabólicas y de estrés Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) Inducción de apoptosis Mecanismos de control de calidad aseguran la homeostasis celular bioenergética. Disfunción mitocondrial o regulación errónea de la homeostasis mitocondrial pueden causar condiciones patofisiológicas como Cáncer Neurodegeneración Envejecimiento Mutaciones en genes que codifican para proteínas mitocondriales causan enfermedades asociadas a las mitocondrias 4) DIFERENTES TIPOS DE MITOFAGIA Autofagia no selectiva vs mitofagia (reclutamiento selectivo) Falta de nutrientes Material para la reutilización. Eliminación de mitocondrias. 1) Control de número. (parte del desarrollo) 2) Control de calidad. Mitocondrias dañadas que están perdiendo su potencial de membrana. Acoplada a la biogénesis de nuevas mitocondrias. Non-selective autophagy occurs when cells are deprived of nutrients. It degrades a range of cytosolic contents, including proteins and many types of organelles. After their recruitment into isolation membranes, cytosolic components are sealed into autophagosomes that fuse with lysosomes. The degradation of these components in the lysosome supplies building blocks for re-use and for metabolism to provide ATP. b | By contrast, mitophagy occurs to eliminate mitochondria, either to regulate their number or to specifically remove ones that are damaged. Mitochondria are selectively recruited into isolation membranes, which seal and then fuse with lysosomes to eliminate the trapped mitochondria. Dos mecanismos de mitofagia Mitofagia mediada por BNIP3L o no dependiente de PINK1 y parkina). (asociada al desarrollo ej. eritrocitos en procesos de maduración). BNIP3L: proteína de membrana mitocondrial LC3-II: proteína lipidada asociada al fagóforo. Mitofagia que depende de PINK1 y parkina (mitocondrias dañadas). PINK1: proteína quinasa PARK2 (parkina): ubiquitina ligasa Parzych and Klionsky (2014) 4 vías de control de calidad en mitocondrias degradación de proteínas solubles oxidadas o no plegadas como primea línea de defensa UPRmt y Retrotranslocación de proteínas de la membrana externa y degradación en proteasomas (Tema 15) Sugiura A et al. EMBO J. 2014;33:2142-2156 Parkina: E3 ubiquitina ligasa que es reclutada por PINK1 Vesículas derivadas de mitocondria (MDV) Hasta aquí daño reversible PINK1: Quinasa que acumula alrededor de la mitoc. dañada Mitofagia Daño irreversible Tema 10 Sensores de estrés Situación de estrés celular: la respuesta de la célula a proteínas desplegadas (UPR). Se activan 3 vías paralelas: Ire1, ATF6 y PERK La respuesta es la síntesis/activación de factores de transcripción en el citoplasma y se translocan al núcleo donde regulan la transcripción de genes implicados en el plegamiento y degradación del mRNA. Al mismo tiempo se para la síntesis de ciertas proteínas para bajar la cuantidad proteica. Factores de transcripción Regulación de genes La respuesta mitocondrial a proteínas no plegadas (UPRmt). Comunicación mitocondria núcleo. factor de transcripción Schulz and Haynes (2015) Estrés mitocondrial por la acumulación de proteínas mal plegadas. ATFS1(TF) normalmente es importado a la mitocondria donde es degradado. En situación de estrés, no se transloca a la mitocondria sino al núcleo donde induce una variedad de genes entre ellos genes que codifican chaperonas y proteasas. Mitochondria-derived vesicles (MDV) y mitofagia Estrés oxidativo Control de calidad MDV - daño aún es reversible Mitofagia - daño no reversible * Los 2 procesos son dependientes de PINK1 y Parkina * La generación de MDV es una repuesta rápida al estrés mitocondrial. Envía la carga oxidada a los lisosomas para preservar la integridad del orgánulo Sugiura et al. (2014) 5) MITOFAGIA MEDIADA POR PINK1 (quinasa) Y PARKINA (E3 ubiquitina-ligasa) En mitocondrias sanas. La translocación parcial de PINK1 depende del potencial de membrana Eliminación del péptido señal La parkina no se activa MTS - PINK1 se transloca parcialmente a través de TOM40. - Exposición de la señal MTS N-terminal a la matriz. Ese proceso depende del potencial de membrana. La MTS es eliminada. - El segmento transmembrana se para en la membrana interna y es procesado por PARL. - El péptido procesado se suelta y PINK1 se retrotransloca al citosol donde se degrado por proteasomas. - La parkina no se activa. Eiynama and Okamoto (2015) Current Opinion in Cell Biology En mitocondrias dañadas PINK1 recluta Parkina Reclutamiento de doble membrana y formación del fagosoma - PINK1 no llega a la matriz debido a la falta de potencial de membrana e interactúa con TOM40. PINK1 dimeriza, se cross fosforila y se activa. - PINK1 fosforila la parkina y la ubiquitina. - La parkina se activa y añade ubiquitinas a proteínas sustrato que se fosforilan por PINK1. - Reconocimiento de la mitocondria por receptores del fagóforo. Eiynama and Okamoto (2015) Current Opinion in Cell Biology Dos vías para deshacerse del material dañando: Exosomas y autofagia como mecanismos coordinados para el mantenimiento de la homeostasis celular. material extracelular Baixauli et al. (2014) + enfermedades Loss of Proteostasis. Endogenous and exogenous stress causes the unfolding of proteins (or impairs proper folding during protein synthesis). Unfolded proteins are usually refolded by heat-shock proteins (HSP) or targeted to destruction by the ubiquitin-proteasome or lysosomal (autophagic) pathways. The autophagic pathways include recognition of unfolded proteins by the chaperone Hsc70 and their subsequent import into lysosomes (chaperonemediated autophagy) or sequestration of damaged proteins and organelles in autophagosomes that later fuse with lysosomes (macroautophagy). Failure to refold or degrade unfolded proteins can lead to their accumulation and aggregation, resulting in proteotoxic effects. Resumen 1) Hay dos tipos de mitofagia. a) La mitofagia mediada por BNIP3L o no dependiente de PINK1 y de parkina (regulación del número de mitocondrias en el desarrollo) b) La mitofagia dependiente de PINK1 y de parkina (eliminación de mitocondrias dañadas). 2) La mitocondria tiene varios procesos propios para reparar daños menos graves. Degradación de proteínas oxidadas, UPRmt y MDV. La mitofagia es un proceso final que se activa solamente en respuesta a un daño no reversible. 5) AUTOFAGIA Y ENFERMEDADES HUMANAS The role of autophagy in aging is manifested by the removal of aggregated proteins. Similarly, in neurodegenerative disorders, accumulation of neuronal proteins has been attributed to be removed by autophagy. Equivalently, autophagy show a protective role in the removal of lysosomal stored components thereby demeliorating lysosomal storage disorders. On the other hand, autophagy has also proved beneficial in evading various foreign pathogens, thereby contributing to the innate immunity. The role of autophagy in diabetes and obesity has been shown to decrease adiposity and insulin resistance. In the context of cancer, autophagy has shown to play a dual role where it serves as a tumor suppressor during initial stages but protects the tumor cells during the later stages. Canbalismo: células se comen otras células. Estructuras “cell-in-cell” en cáncer. Flechas blancas: células ingeridas y vivas Flechas azules: células ingeridas y muertas Flechas rojas: células parcialmente ingeridas. Células comiéndose bolas de látex Canibalismo de células tumorales o de células del microentorno. Es una respuesta a la falta extrema de nutrientes. Se encuentra muchas veces en células metastáticas y por eso se usa como marcador de una prognosis mala. Entosis: Tipo de fagocitosis en la que células tumorales engullen otras células tumorales vivas. Competición entre células tumorales. No se ingiere células muertas. Tiene lugar en condiciones de estrés nutricional. Depende de la tensión celular. Células más rígidas serán ingeridas por células más deformables. Las ganadores son las células más deformables y las perdedores son las células más rígidas. ¿Selección de células mecánicamente mas deformables y a consecuencia más invasivas y malignas? perdedora Los diferentes destinos de la células internalizada ganadora proceso parecido a la autofagia Bibliografía básica Alberts et al. Molecular Biology of the Cell 6ª ed. Chapter 13. Transport from the trans Golgi network to lysosomes. Lodish et al. Molecular Cell Biology. 6th ed. Chapter 9. Bibliografía complementaria Aman et al (2021) Autophagy in healthy aging and disease. NATURE AGING 1:634-650. Eiyama and Okamoto (2015) PINK1/Parkin-mediated mitophagy in mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology 33:95-101. Kotiadis et al. (2013) Mitochondrial quality control and communications with the nucleus are important in maintaining mitocondrial function and cell death. Biochimica y Biophysics Acta 1840: 1254-1265. Li et al (2022) A new type of ERGIC–ERES membrane contact mediated by TMED9 and SEC12 is required for autophagosome biogenesis. Cell Research 32:119–138. Sugiura et al. (2014) A new pathway for mitochondrial quality control: mitochondria-derived vesicles. The EMBO Journal 33:2142-2156.