Tema 12 DIyS 20232024 clase.pdf

TEMA 12 1) EL TRANSITO DESDE EL RE AL APARATO DE GOLGI El ERGIC (compartimiento intermedio ER-cis Golgi). ERES (ER exit sites) Clasificación de proteínas solubles y transmembrana en la vía secretora temprana. El papel del pH y la señal KDEL. 2) EL APARATO DE GOLGI El paso de cis a trans en el aparat...

TEMA 12 1) EL TRANSITO DESDE EL RE AL APARATO DE GOLGI El ERGIC (compartimiento intermedio ER-cis Golgi). ERES (ER exit sites) Clasificación de proteínas solubles y transmembrana en la vía secretora temprana. El papel del pH y la señal KDEL. 2) EL APARATO DE GOLGI El paso de cis a trans en el aparato de Golgi. Clasificación de proteínas en la red del trans Golgi. 3) LOS LISOSOMAS Transporte de la red del trans Golgi a los lisosomas. Los receptores MPR46, MPR300 y sortilina. Enfermedades lisosomales y su tratamiento (Seminario). El papel de los lisosomas en la reparación de membranas. La vía secretora temprana ERES (ER-exit sites): sitios donde se forman las vesículas Clasificación en la red del trans Golgi EL TRANSITO DESDE EL RE AL APARATO DE GOLGI. LA VÍA SECRETORA TEMPRANA. Formación de agregados tubulo-vesiculares por fusión homotípica de vesículas “Vías del ferrocarril” + dineina Agregados túbulo-vesiculares - Formación de agregados tubulo-vesiculares por fusión homotípica de vesículas COPII formando un compartimiento intermedio ER-cis Golgi (ERGIC). Solo en mamíferos. + - ERES (ER-exit sites) Agregados túbulo-vesiculares El ERGIC en el microscopio electrónico Marcador: ERGIC53 (proteína transmembrana) Posibles funciones del ER-Golgi Intermediate Compartment (ERGIC) - Tiene una composición diferente del RE y del Golgi - Estación de clasificación del tráfico anterógrado y retrógrado después del RE. - Sito de concentración de proteínas solubles que salen del RE por un proceso no selectivo. - Estación adicional de control de calidad de las proteínas basado en la conformación proteica y el plegamiento proteico. - ¿Es un orgánulo? Los sitios ERES (ER-exit sites) en mamíferos y plantas. Golgis: alrededor del núcleo. Interconectados en cinta. ERES dispersados. Golgis: dispersados por la célula. ERES están asociados a los Golgis. Clasificación de proteínas solubles y transmembrana en la vía secretora temprana. Sec24 (Organización de la Célula) Consideración general: Qué tipo de proteínas se clasifican? Nica Borgese J Cell Sci 2016;129:1537-1545 1) Proteínas solubles sin receptor específico 2) Proteínas solubles con receptor específico 3) Proteínas transmembrana con señal de exportación citosólica 4) Proteínas transmembrana sin señal de exportación citosólica Modelo de clasificación de proteínas solubles en la vía secretora temprana por COPII. Cuestión: ¿Cómo puede COPII reconocer las diferentes secuencias señal de las proteínas secretadas? Concepto de la jerarquía. 1 2 3 La pirámide jerárquica de la unión selectiva de proteínas. Cada nivel contribuye al rango de interacciones específicas. 1) diferentes homólogos de Sec24 2) diferentes sitios de unión en Sec24 3) diferentes receptores de carga 4) diferentes adaptadores Creación de especificidad y diversidad 4 Clasificación de proteínas transmembrana en la vía secretora temprana. 20-30% de las proteínas son proteínas transmembrana. Pero se sabe muy poco de su clasificación. No se basa en dominios transmembrana (DTM) con una cierta secuencia sino en propiedades físicas como por ej. su longitud y la hidrofobicidad. DTMs cortos y más hidrofílicos localizan al ER-Golgi, y DTMs más largos y hidrofóbicos a la MP. * La membrana del Golgi tiene más grosor que la del RE. Erv14: receptor que reconoce proteínas TM con DTM largos. COPII reconoce Erv14. Rer1: receptor que reconoce proteínas TM con TMD cortos. COPI reconoce Rer1. Cosson et al. (2014) Trends Cell Biol. 23:511-517. Modelo de interacción con receptores de clasificación (página previa) Reclutamiento de COPI Modelo de segregación de PTM según el grosor de su DTM. (A) Interaction with sorting receptors. In cis-Golgi cisternae, Rer1 interacts with the TMD of a subset of transmembrane proteins such as Sec12, Sec71 and Mns1. The Rer1 cytosolic domain then recruits the COPI coat, which returns bound proteins to the ER. Similarly, Erv1 binds proteins with long TMDs in the ER and concentrates them in COPII-coated ER exit vesicles. (C) Lipid partitioning. In reconstituted lipid bilayers, short TMDs segregate into thinner membrane domains while long TMDs are found in thicker membranes. In living cells, a similar mechanism coupled to the formation of transport vesicles may ensure differential transport of transmembrane proteins. La importancia del pH en la clasificación Modelos básicos de clasificación: El pH juega un papel Dancourt J, Barlowe C. (2010) Annu. Rev. Biochem 79:777802. Recuperación de las proteínas residentes en el ER. La señal KDEL. pH reconocimiento del parentesco para COPII para COPI ERGIC53, igual que el receptor KDEL, son unos receptores que viajan cíclicamente entre ER y ERGIC. Para eso necesitan una señal para COPII y otra para COPI Ampliado en cuestiones. Those ER resident proteins that escape from the ER are returned to the ER by vesicular transport. (A) The KDEL receptor present in vesicular tubular clusters and the Golgi apparatus, captures the soluble ER resident proteins and carries them in COPI-coated transport vesicles back to the ER. Upon binding its ligands in this low-pH environment, the KDEL receptor may change conformation, so as to facilitate its recruitment into budding COPI-coated vesicles. (B) The retrieval of ER proteins begins in vesicular tubular clusters and continues from all parts of the Golgi apparatus. In the neutral-pH environment of the ER, the ER proteins dissociate from the KDEL receptor, which is then returned to the Golgi for reuse. 2. EL APARATO DE GOLGI ¿Quién era Camillo Golgi? Premio Nobel en Fisiología y Medicina 1906 Corteno, Italia 1843 Padua, Italia 1926 Células de Purkinje en el cerebelo * www.nobel.se Golgi's drawings of the "internal reticular apparatus" that he observed in spinal ganglia (the different drawings illustrate the variety of features Golgi observed with his metal impregnation, from Opera Omnia). This intracellular structure is universally known nowadays as "Golgi apparatus El aparato de Golgi: N-glucosilación La matriz del Golgi O- glucosilación -esqueleto de proteínas que queda después de extracción con detergentes Clasificación de los productos del RE -componentes: espectrina, anquirina, actina y golginas Compartimientos ordenados EL PASO DE CIS A TRANS EN EL APARATO DE GOLGI El modelo de transporte vesicular vs. el modelo de la maduración de cisternas Protein trafficking http://www.youtube.com/watch?v=rvfvRgk0MfA&feature=related 1957 modelo de maduración de cisternas 1980-90s modelo de transporte vesicular 2000 modelo de maduración de cisternas o mixto???? ampliado en cuestiones Modelos de tomografía electrónica del aparato de Golgi Electron tomographic models of the Golgi apparatus. (A) Golgi stack from an Arabidopsis thaliana meristem cell. The different cisternae within the stack and the flanking trans-Golgi network (TGN) are colour-labelled. The ribosome excluding Golgi matrix is shown in white. Note how the matrix extends around the surface of the Golgi stack and associated TGN. The blue spheres are clathrin-coated vesicles at the TGN. Bar 500 nm. (b) Structure of the Golgi ribbon from a hamster pancreatic cell line. The Golgi stacks are laterally arranged within the Golgi ribbon. The cisternae are colour coded, going from cis to trans as indicated. Numerous transport vesicles that surround the Golgi stacks are shown in white. Note the close proximity of the vesicles to the Golgi stacks. Bar, 500 nm. Resumen 1) Se postula que en mamíferos hay entre el RE y el AG un compartimiento llamado ERGIC, que es una estación de clasificación adicional. Las vesículas COPII se forman en los sitios ERES. El transporte retrogrado entre ERGIC y RE tiene lugar mediante vesículas COPI. 2) Las proteínas pueden entrar en las vesículas COPII de distintas maneras. Proteínas solubles: ruta por defecto o unidas a receptores cuyos señales de clasificación citosólicas son reconocidas por Sec24. Proteínas transmembrana: reconocidas por sus señales de clasificación citosólicas, por receptores de clasificación que reconocen la longitud de sus DTM o por segregación de sus DTM. 3) El pH juega un papel en la clasificación antero- y retrogrado de proteínas solubles entre RE y Golgi. 4) El Aparato de Golgi (AG) es el sitio de puntos de la glucosilación y de la clasificación de proteínas. Las proteínas que salen del AG tienen 3 destinos: la membrana plasmática, las vesículas de secreción y los lisosomas. ALGUNAS DEFINICIONES ÚTILES Anterograde transport Membrane traffic pathway in which a linear assembly of membrane-bound compartments facilitates cargo movement towards the cell surface Retrograde transport Membrane traffic pathway in which a linear assembly of membrane-bound compartments facilitates cargo movement towards the ER ER exit sites (ERES) Specialized regions on the surface of endoplasmic reticulum (ER) membranes where coat protein complex II (COPII) coat subunits are recruited and assembled into COPII carrier vesicles that transport secretory cargo from the ER Unfolded protein response (UPR) A system of ancestral signalling pathways that are activated upon increased secretory protein load in the endoplasmic reticulum to ensure maintenance of cellular homeostasis ER–Golgi intermediate compartment (ERGIC) An organelle that is visible in most mammalian cells at the interface between the endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi and that is implicated in cargo concentration and sorting La vía secretora temprana Clasificación en la red del trans Golgi 1) Vesículas recubiertas de clatrina viajan a los endosomas-lisosomas 2) Secreción constitutiva a la MP 3) En células especializadas: vesículas de secreción regulada. ERES (ER-exit sites): sitios donde se forman las vesículas Vías de clasificación al sistema endolisosomal Procedentes de otras células Tema 13 Tema 12 Sin cubierta de clatrina. Se sabe poco. Staudt et al (2016) Int.J.Mol Sci. 18:1-15 3) LOS LISOSOMAS Christian de Duve 1974 Premio Nobel en Medicina o Fisiología Pie de figura de la diapositiva anterior. The lysosome comprises a specific set of luminal, integral-membrane and peripherally associated proteins. The lysosomal lumen contains acid hydrolases that degrade different substrates, enzyme activators and protective factors that aid in the degradation, as well as transport factors such as lipid transfer Niemann–Pick type C2 protein (NPC2), which shuttles free cholesterol to NPC1 for export from the lysosome. The acidic pH of the lysosomal lumen is maintained by a vacuolar ATPase (v-ATPase) embedded in the limiting membrane. In addition, the lysosomal membrane comprises highly glycosylated lysosome-associated membrane proteins (LAMPs) that among other functions protect the lysosomal membrane from degradation, ion channels and transporters that maintain ion homeostasis, cholesterol and other lipid transporters, solute carriers that participate in the export of sugars, nucleosides, amino acids and other products of lysosomal degradation, and SNAREs that mediate fusion of lysosomes with other organelles. The cytosolic face of lysosomes serves as a platform for the dynamic association of proteins and protein complexes (shown in the right part of the figure), including the mechanistic target of rapamycin complex 1 and its regulators that transduce nutrient and growth factor signals, transcription factors such as TFEB and TFE3 that regulate lysosome biogenesis, autophagy and energy metabolism, tethering factors that promote lysosome fusion or contacts with other organelles, adaptor or scaffold complexes that couple lysosomes to microtubule motors such as kinesins and dynein–dynactin and small GTPases that control the recruitment and activation of all of the aforementioned molecules. Ballabio A and Bonifacino JS (2020) Nature Reviews Molecular Cell Biology Clasificación de proteínas secretadas en el TGN. Se conocen bien Org. de la Célula No se conocen bien  M6PR Sortilina AP1 y GGA con clatrina Sorting of secretory proteins at the TGN is poorly understood. There are two well-described sorting principles at the TGN. This is the (A) receptor-mediated sorting of lysosomal hydrolases via M6P (Mannose-6-Phosphate) and the M6P receptor (M6PR) to the lysosome via endosomes, in clathrin-coated vesicles. Another class of soluble proteins is sorted via sortilin and clathrin to endosomes, eventually arriving to lysosomes. A specific signal in these proteins is recognized by sortilin, thereby permitting their sorting. Another process is the sorting of proteins destined to secretory storage granules (B). These molecules aggregate in the presence of low pH and Ca2+ in the TGN and these aggregates condense and mature from immature storage granules (ISG) into mature storage granules (MSG). CARTS transport Lysozyme C and PAUF to the cell surface (C). How other soluble secretory proteins destined to the apical and basolateral cell surface are sorted remains poorly understood (D). Reconocimiento de una hidrolasa lisosómica N-oligosacárido zona señal Escisión de GlcNAc (otra enzima) → M-6-P The GlcNAc phosphotransferase enzyme that recognizes lysosomal hydrolases in the Golgi apparatus has separate catalytic and recognition sites. The catalytic site binds both high-mannose N-linked oligosaccharides and UDP-GlcNAc. The recognition site binds to a signal patch that is present only on the surface of lysosomal hydrolases. The GlcNAc is cleaved off by a second enzyme, leaving the M6P exposed (not shown). Los receptores MPR300 y MPR46. MPR300 (independiente de cationes) Viaje: Golgi  endosomas  Golgi o membrana plasmática. Adaptadores: AP2, Ap1 y GGA. Vesículas de clatrina. Reconoce proteínas con M6P (hidrolasas ácidas) y también sin M6P como por ejemplo el IGFII (insulin-like growth factor II) MPR46 (dependiente de cationes) Viaje: Golgi  endosomas  Golgi. Adaptadores: AP1 y GGA. Vesículas de clatrina. NO viaja a la membrana plasmática! Reconoce exclusivamente hidrolasas ácidas con M6P. Transporte de las hidrolasas lisosómicas pH 7.4 Endocitosis mediada por receptor MPR300 MPR46 y MPR 300 M6P pH5 pH 6.5 pH 6 ¿Cómo se descubrieron las rutas de direccionamiento de proteínas a lisosomas independientes de M6P? - Estudiando las enfermedades de almacenamiento lisosomal. Grupo de enfermedades genéticas hereditarias debidas a mutaciones en los genes que codifican algunas enzimas lisosomales acúmulo del substrato no digerido en los lisosomas. Enfermedad de inclusión celular. Se acumula material no dirigido porque las hidrolasas ácidas con M6P no llegan a los lisosomas. Faltan múltiples enzimas de los lisosomas. Ausencia de GlcNAc fosfotransferasa necesaria para formar el marcador M6P. Pero: algunas hidrolasas sí, se encuentran en los lisosomas. Conclusión: debe de haber otra vía de clasificación. Vía independiente de manosa-6-fosfato ¿ Cómo se dirigen las proteínas de la membrana lisosomal a los lisosomas? Se dirigen en todas las células desde la red del trans Golgi hasta los endosomas tardíos y lisosomas a través de una vía independiente de M6P que implica señales contenidas en sus extremos carboxi-terminales Los receptores LIMP2 y Sortilina de la vía independiente de M6P Prosaposina= Activador de esfingolípidos neurotensina Secuencia señal Transportan hidrolasas desde el Golgi a los lisosomas en vesículas recubiertas de clatrina y con los adaptadores AP1 y GGA. Secuencia señal La vía biosintética de la catepsina D humana (hidrolasa ácida) 52kD 30kD: forma óptimamente activa y estable a bajo pH Fig. 1. Scheme of the biosynthetic pathway of human Cathepsin D. Cathepsin D (CD) is synthesised as precursor in the rough endoplasmic reticulum (RER) which travels to the Golgi complex (GC), wherein it acquires the mannose-6-phosphate (M6P), and eventually reaches the endosomes (EE, early endosome; LE, late endosome) via M6P-receptor (MPR)-dependent or alternative pathway. Pro-CD undergoes the first step of maturation leading to the intermediate form within the LE, and upon reaching the lysosomes it undergoes the last step of maturation leading to the double-chain mature form. Depending on cell type and extracellular stimuli proCD can be secreted extracellularly to some extent. La catepsina D en cáncer Defective Acidificatión of Intracellular Organelles Results in Aberrant Secretion of Cathepsin D in Cancer Cells. Kokkonen et al. (2004) J. of Biological Chemistry: 39982. COS-7 Riñón No metastática HT-29 Cáncer de mama No metastática MCF-7 Cáncer de mama CaCo-2 Cáncer de colon no acidifica no acidifica metastática metastática Acidificación de orgánulos en diferentes líneas celulares cancerosas normal Carcinoma de colon Vía de secreción constitutiva ¿Qué pasa en las células deficientes en la acidificación? Secreción de la procatepsina al espacio extracelular (clasificación errónea) → aumento de propiedades invasivas y metastáticas de células cancerosas. En el cáncer de mama es un marcador de mala prognosis. Papel de la catepsina D en el desarrollo del cáncer y la metástasis Clasificación equivocada Exocitosis activa Fig. 2. The multiple functions of cathepsin D in cancer development and progression. Cancer cells secrete large amount of proCD as a result of defective segregation into the endosomal-lysosomal pathway. At acid pH extracellular proCD becomes active as “pseudo-CD”. Mature CD (mCD) can be release by cancer cells through active exocytosis from lysosomes or following necrosis. Stromal cells also may contribute to the release of mCD into the extracellular space. Active CD degrades the proteins of the extracellular matrix (ECM) thus freeing growth factors that promote cancer cell proliferation and neo-angiogenesis. Receptores alternativos (con flechas verdes) para la clasificación de proteínas lisosomales Vistos en clase Funciones importantes de los lisosomas en procesos celulares. Main functions of the lysosome and their relationship with key cellular processes. Lysosomes are involved in the degradation and recycling of extracellular material, via endocytosis, and intracellular material, via autophagy. In these processes lysosomes fuse with late endosomes and with autophagosomes, respectively. The resulting breakdown products are used to generate new cellular components and energy in response to the nutritional needs of the cell. Lysosomes also undergo Ca2+ regulated exocytosis to secrete their content into the extracellular space and to repair damaged plasma membrane. Upon plasma membrane injury, lysosomes rapidly migrate to the damaged site and fuse with the plasma membrane to allow efficient resealing. More recently, lysosomes have been identified as signaling organelles that can sense nutrient availability and activate a lysosome-to-nucleus signaling pathway that mediates the starvation response and regulates energy metabolism. El papel de los lisosomas en la reparación de membranas. Sinaptotagmina: proteína sensora del Ca2+ localizada en la membrana lisosomal Fig. 2. Schematic representation of the most important stages in membrane repair, following the generation of a hole in the plasma membrane (a). As the Ca2+ concentration inside the cell is four orders of magnitude lower than outside the cell, because of a low resting Ca2+ permeability and the operation of the plasma membrane Ca2+ pump, the rupture of the plasma membrane will inevitably result in a major influx of Ca2+ from the external solution into the cytosol, which will activate the Ca2+ sensor synaptotagmin VII in the lysosomal membrane (b). This activates exocytosis of lysosomes (c). Endocytosis, also stimulated by the rise in the cytosolic Ca2+ concentration, most likely reduces the surface membrane area back to the control level (d). Finally the plasma membrane has been resealed and the normal transmembrane Ca2+ gradient can be restored (e). La reparación de la membrana plasmática por lisosomas: la hipótesis del parche. Ca2+ A) Célula no dañada con red de F-actina bajo de la membrana plasmática (MP). B) Daño a la MP y entrada de Ca2+ Despolimerización de la F-actina y desplazamiento de lisosomas a la MP con ayuda de la quinesina y la miosina. C) Fusión homotipica de lisosomas creando un parche. D) El parche se añade a la MP. Fusión heterotipica. E) Sellado F) Repolimerización de la Factina. Paul L. McNeil J Cell Sci 2002;115:873-879 © The Company of Biologists Limited 2002 Imagen de un fibroblasto en el proceso de sellado. En amarillo: lisosomas Paul L. McNeil J Cell Sci 2002;115:873-879 © The Company of Biologists Limited 2002 Como se pueden tapar agujeros en las membranas celulares Daño a la membrana por patógenos, sustancias químicas, radiación, estrés mecánico etc. citoesqueleto Respuesta celular para restaurar la integridad de la membrana. A) Membrana artificial autosellado espontáneo si no hay tensión de membrana. B) reducción de la tensión de la membrana 1) añadir más membrana (fusión de vesículas) 2) alterar de curvatura 3) romper el citoesqueleto asociado a la membrana C) Fusión homotípica de vesículas citoplásmicas formando una vesícula grande (ej. Lisosomas, modelo del parche) D) Formación de una vesícula hacia el citosol seguido de fusión con endosomas y lisosomas para la destrucción de la membrana dañada. E) Formación de una vesícula hacia el espacio extracelular formando una vesícula extracelular F) Macrófagos pueden escindir la membrana dañada. Zhen et al. (2021) The EMBO Journal, 40.e106922 Resumen 1) Los lisosomas son orgánulos especializados en la digestión de macromoléculas que contienen hidrolasas ácidas que funcionan a bajo pH. 2) Existen 2 receptores M6P (MPR46 y MPR300) en la red del trans Golgi que reconocen hidrolasas fosforiladas y dirigen su transporte a los endosomas tardíos donde el receptor y las hidrolasas se disocian. Los receptores se reciclan y las hidrolasas ácidas se transfieren a los lisosomas. También hay receptores MPR300 en la membrana plasmática que devuelven hidrolasas ácidas “escapadas” y unen a IGF-II. 3) Existe una vía independientes de M6P como la que usan los receptores LIMP2 y sortilina. 4) La clasificación errónea de las hidrolasas ácidas puede contribuir al potencial metastático de algunas líneas celulares cancerosas. 5) Los lisosomas participan en la reparación de membranas. Bibliografía básica Alberts et al. Biología molecular e la célula 5ª ed. Capítulo 13. Transporte des del ER a Través del Complejo de Golgi. Transporte desde la red del Trans Golgi a los lisosomas. Lodish et al. Molecular Cell Biology. 6th ed. Chapter 14.2. Early stages of the secretory pathway. Bibliografía complementaria Ballabio, A and Bonifacino JS. (2020) Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. NATURE REVIEWS MOLECULAR CELL BIOLOGY 21:101118. Brandizzi, F and Barlowe, C. (2013) Organization of the ER_Golgi interface for membrane traffic control. Nat Rev Mol Cell Biol. 14:382-392. Braulke and Bonifacio (2009) Sorting of lysosomal proteins. BBActa 1793:605-614. Ghosh, P.; Dahms, N.M.; Kornfeld, S. (2003) Mannose-6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews Molecular Cell Biology 4:202-212. Zhen et al. (2021) Sealing holes in celular membranes. The EMBO Journal 40:e106922.