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TEMA 11. TRÁFICO VESICULAR. 1) TIPOS DE VESÍCULAS RECUBIERTAS 2) PROTEÍNAS DE CUBIERTA Y SUS ADAPTADORES Clatrina y sus adaptadores. AP1, AP2 y GGA. Otros adaptadores. 3) FOSFOINOSITOLES Vía anterógrada Vía retrógrada Vía endocítica 4) MECANISMOS QUE INTRODUCEN CURVATURA EN LA MEMBRANA Las epsinas...

TEMA 11. TRÁFICO VESICULAR. 1) TIPOS DE VESÍCULAS RECUBIERTAS 2) PROTEÍNAS DE CUBIERTA Y SUS ADAPTADORES Clatrina y sus adaptadores. AP1, AP2 y GGA. Otros adaptadores. 3) FOSFOINOSITOLES Vía anterógrada Vía retrógrada Vía endocítica 4) MECANISMOS QUE INTRODUCEN CURVATURA EN LA MEMBRANA Las epsinas y las proteínas BAR 5) MECANISMOS DE DESPRENDIMIENTO DE VESÍCULAS Las proteínas BAR y la dinamina 6) LAS VESÍCULAS COPI Y COPII Transporte del colágeno Representación esquemática de las vías mayoritarias del transporte vesicular en mamíferos. Algunas de las vías no están muy caracterizadas. COPI y COPII Clatrina, salvo AP3, AP4 y AP5 El sistema de endomembranas y las diferentes vesículas involucradas. GGA Dell Angelica and Bonifacino (2019) Annu Rev Cell Dev Biol. 35:131-168 Micrografías electrónicas de vesículas cubiertas formadas in vitro. Mecanismo general de la formación y fusión de una vesícula 3) pérdida de la cubierta 2) desprendimiento Premio Nobel en Fisiología y Medicina 2013 Por el estudio de los factores que regulan el tráfico vesicular James Rothman (USA) Randy Schekman (USA) Thomas Südhof (Alemania) 4) translocación 5) anclaje 1) formación 6) fusión Componentes que participan en la formación de vesículas recubiertas Proteínas de cubierta: Clatrina, subunidades de COPI y Sec13/Sec31 Proteínas adaptadoras: Adaptinas (AP1 y 2, GGA) para clatrina; AP3, 4 y 5 cubierta no identificada; subunidades de COPI; subunidad Sec24 de COPII. Todas reconocen secuencias señales. Proteínas reguladoras: pequeñas GTPasas ARF y Sar I 2) PROTEÍNAS DE CUBIERTA Y SUS ADAPTADORES Etapas en la formación de la cubierta vesicular de clatrina 1. Las interacciones laterales de los complejos clatrina-adaptina generan fuerzas que deforman la membrana y producen curvatura (en zonas de acumulación de receptores específicos de carga) 2. La dinamina (GTPasa citosólica) forma un anillo que acerca las hemimembranas posibilitando su fusión y la liberación de la vesícula 3 Organización de la Célula 1 2 dinamin a Figure 13-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 3. Desensamblaje y reciclado de la cubierta La cubierta de clatrina no es única. 1975 Barbara Pearse, MRC Laboratories, Cambridge, UK. Descubrió la clatrina Leonardo da Vinci Polen Icosaedro de pentágonos y hexágonos Esqueleto de radiolaria Proteínas asociadas a la CLATRINA (CLASPs) Más de 50 proteínas citosólicas juegan un papel en la formación de vesículas recubiertas de clatrina. Además de interacciones proteínaproteína son necesarias interacciones proteínalípidos (ensamblaje y selección de carga). Todas las proteínas se ensamblan de una manera ordenada. También participan proteínas accesorias. Moléculas adaptadoras para clatrina: las adaptinas Unión a proteínas accesorias Unión a la cubierta Unión a Arf Unión a la carga Unión a fosfoinositol Golgi-endosomes MP-endosomas poco caracterizado Golgi-lisosomas, no clatrina *heterotetrámeros Funciones. 1) Unión de la cubierta a la membrana 2) Selección de la carga 3) Reclutamiento de proteínas accesorias que regulan la formación de vesículas Interacción de AP2 con la membrana plasmática. Cambio conformacional inducido por lípidos. cargo receptors phosphoinositide PI(4,5)P2 endocytosis signals β2 curvatura µ2 σ2 α AP2 open 1) Interacción de AP2 con 4 fosfoinositoles. Solo uno está dibujado. 2) Cambio conformacional de AP2 (abierto) 3) Reconocimiento de la señal de endocitosis 4) Unión estrecha con la membrana e inducción de curvatura → reclutamiento de más complejos AP2 Las proteínas adaptadoras GGA (trans Golgi-endosomas) proteína monomérica, adaptadora para clatrina Proteínas accesorias clatrina Arf-GTP carga AP-5 3) FOSFOINOSITOLES El fosfatidilinósitol (PI) y los fosfoinositoles (PIP): marcadores de orgánulos y dominios en las membranas PI y PIP quinasas y fosfatasas Figure 13-10 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Fosfoinositoles y su localización membranosa Ayudan a reclutar proteínas adaptadoras Figure 13-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 4) MECANISMOS QUE INTRODUCEN CURVATURA EN LA MEMBRANA 2 mecanismos para crear asimetría en la membrana 1) Modificar la composición de lípidos de la monocapa creando monocapas diferentes respecto a la concentración de lípidos específicos o al número de lípidos o ambos. a) modificar lípidos (PC→lisoPC) b) cambiar fosfolípidos de capa (flipasas) 2) Insertar dominios hidrofóbicos o anfipáticos de proteínas (epsinas y proteínas BAR) 1a) Modificación de PC → lisoPC Monocapa plana Monocapa curvada positiva 1b) Cambiar fosfolípidos de capa (flipasas) Ejemplo: la flipasa Drs2p. Flipasa de fosfolípidos que juega un papel en la formación de vesículas AP1-clatrina en el trans-Golgi Activación sinérgica hélice anfipática de Arf-GTP + Epsina Modo de acción: 1) Activación sinérgica de la flipasa por ArfGEF y PI(4)P. Cambio de la fosfatidilserina de hoja y introducción de curvatura de la membrana hacia el citosol. 2) Arf-GEF estimula el intercambio de nucleótidos de Arf. Inserción de la hélice anfipática de Arf-GTP y dimerización de moléculas Arf-GTP introduciendo aún más curvatura. 3) Reclutamiento de AP1 y clatrina. 4) Reclutamiento de la epsina 2) Insertar dominios hidrofóbicos o anfipáticos de proteínas 1) La superfamilia de las EPSINAS Epsinas 1-3: función en la endocitosis mediada por clatrina (sitio de unión para AP-2) Epsina R: función en la formación de vesículas de clatrina (AP1/GGA) en el trans-Golgi AP1/GGA en trans Golgi Hélice anfipática Ejemplo: Interacción de la epsina R (enthoprotin) con la cubierta en el TGN Interactúa con: Clatrina Proteína adaptadora PIP Recluta también a la clatrina Epsina R 2) Las proteínas BAR introducen curvatura en las membranas Hélice anfipática La superfamilia de las proteínas BAR 1) Los dímeros de BAR reconocen membranas curvadas y las estabilizan. Forman uniones electroestáticas con lípidos cargados negativamente. 2) N-BAR: además tiene una hélice anfipática N-terminal que se inserta en la membrana e introduce más curvatura. 5) MECANISMOS DE DESPRENDIMIENTO DE VESÍCULAS Las proteínas BAR tienen una función en protrusiones, invaginaciones y fisión de membrana autoinhibición Pequeñas GTPasas? fosforilación interacción proteína -proteína inactivo activo Rao et al (2011) CMLS El papel de las proteínas BAR en la endocitosis andamio estrangulamiento Polimerización de actina (“cometas de actina”) Mecanismo. a) Reclutamiento de un receptor transmembrana a una depresión revestida de clatrina. b) Formación de un entramado de clatrina rodeando la carga. c) Reclutamiento de proteínas N-BAR (sienten la curvatura de la membrana). N-BAR introduce más curvatura insertando su hélice anfipática en la membrana. d) Formación de un andamio por proteínas N-BAR que tienen forma de banana y reclutamiento de las dinaminas. Activación de la polimerización de la actina por el complejo N-WASP-Arp2/3. e) Fisión mediada por la dinamina y transporte de la vesícula por el citoplasma mediado por cometas de actina. El papel de la dinamina en el desprendimiento de las vesículas revestidas de clatrina La dinamina: un miembro de la superfamilia de GTPasas de alto peso molecular Experimento que demuestra que la hidrólisis de GTP es necesaria para el desprendimiento de las vesículas cubiertas de clatrina. 1) lisis de terminales nerviosos (tienen mucha actividad endocítica). 2) incubación con GTP-γS (derivado del GTP que no puede ser hidrolizado). 3) obtención de la preparación para el ME e incubación con anticuerpos-antidinamina marcados con oro. 4) observación al ME: depresión recubierta de clatrina con dinamina polimerizada rodeando el cuello. 5) Conclusión: se pueden formar depresiones de clatrina en ausencia de hidrólisis de GTP pero la vesícula no se puede desprender. Los miembros de la familia de las dinaminas caveolas Los miembros de la familia de las dinaminas se encuentran en levadura, células animales y plantas. Están involucrados en diversos procesos celulares. (ver tabla de localización y funciones). Algunas se pueden autoensamblar. Experimento original: la GTPasa MxA inducida por el interferón α y β inhibe la importación de nuclecápsidas de Thogoto virus (familia de los virus de la gripe) Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids (1999) G. Kochs and O. Haller, PNAS 96:2082 (Artículo original) Experimento 1) Células 3T3 en cultivo transfectadas con proteína MxA (verde) y células control (sin transfección). 2) Microinjección de nucleocápsides virales (rojo) en ambas células. Incubación de 2hrs. 3) Microinjección de anticuerpos fluorescentes y detección en el microscopio confocal. Colocalización de MxA (verde) y nucleocápside (rojo) → amarillo Las GTPasas Mx (myxovirus resistance protein) Proteínas antivirales inducidas por interferón α y β. No se expresan constitutivamente ni se inducen por virus. MxA: citoplásmica. Se asocia con membranas intracelulares. Inhibe un amplio espectro de virus de DNA y RNA. MxB: localiza al poro nuclear. Inhibe HIV pero no los virus sensibles a MxA. Modelo de acción antiviral de MxA: 1) IFN induce proteínas MxA y su autoensamblaje. 2) Activación de la actividad GTPasa y reconocimiento de membranas víricas 3) Formación de complejos nucleocápside y MxA e inactivación Las proteíns Mx tienen diferentes perfiles antivirales vRNP. Partículas ribonucleo protéicas virales) MxA humano ratón influenza Inhibe algunos virus de RNA y DNA. Virus sensibles a MxB no están afectados MxB retrovirus Inhibe lentivirus. Virus sensibles a MxA no están afectados no afectada afectada Resumen 1) En el proceso de la endocitosis mediada por clatrina los trisquelions de clatrina se ensamblan en depresiones revestidas de clatrina. La carga de la vesícula es reconocida por proteínas adaptadoras, de las cuales se conocen 5 diferentes tipos. AP1-2 y GGA tienen dominios de unión a la carga, a la clatrina y a proteínas accesorias que ayudan en el proceso de la formación de las vesículas revestidas de clatrina. Las demás no se asocian a la clatrina 2) El ensamblaje de la cubierta no es suficiente para curvar la membrana. Existen enzimas que modifican fosfolípidos para conferir más volumen a la monocapa lipídica y flipasas que cambian fosfolípidos de hoja. El resultado es una asimetría que conduce a la curvatura de la membrana. También son necesarias las epsinas y las proteínas BAR que insertan hélices-α para introducir más curvatura en la membrana. 3) Las diferentes membranas se caracterizan por sus fosfoinositoles específicos. Las vesículas se forman en sitios ricos en fosfoinositoles (“hot spots”). 4) Las vesículas de clatrina se estrangulan con la ayuda de la dinamina, las proteínas BAR y el factor N-WASP-arp2/3 que polimeriza la actina. 5) Las proteínas Mx son GTPasas antivirales 6) LAS VESÍCULAS COPI Y COPII 6) LAS VESÍCULAS COPI Y COPII Los elementos estructurales de las tres cubiertas se parecen 1) Trisquelion 2) Varas formando una vértice 3) Arcos formando una triada Las cubiertas son estructuras flexibles Evolución de los adaptadores Similitudes estructurales de las proteínas de cubierta (clatrina y COPI) subcomplejo B subcomplejo F Algunas subunidades proteicas tienen homologías funcionales. Pasos en la formación de vesículas COPI: papel de los subcomplejos Subcomplejo B: αβ´ε Subcomplejo F: γβδζ se unen juntos a la membrana en forma de arcos p23/p24: recluta Arf-GDP e incrementa la eficacia de la formación de la vesícula. Se une directamente a COPI y viaja con ella. Acyl-CoA y proteínas BAR ¡DINAMINA NO! Prototipos de cubiertas Dell Angelica and Bonifacino (2019) Annu Rev Cell Dev Biol. 35:131-168. Las funciones de la cubierta: captar la carga y generar curvatura Subcomplejo F Subcomplejo B Las proteínas de cubierta tienen dos funciones: captar la carga y generar curvatura. Complejo COPII Sar1: anclaje a la membrana sec 23: unión a Sar1 sec 24: reclutamiento de la carga sec13/31: introducción de curvatura Formación de dos capas Complejo COPI (coatomero) Arf1: anclaje a la membrana β, γ, δ y ζ-COP (subcomplejo F): formación de una estructura que se parece a un arco contactando con Arf1. α y β'-COP (subcomplejo B): formación de un arco para el reclutamiento de la carga No forman dos capas sino una “triada” Micrografías electrónicas de vesículas cubiertas formadas en vitro. Formación de vesículas COPII Hidrólisis de GTP A) Sec12 recluta Sar1, activación e inserción de la hélice-α (curvatura) B) Reclutamiento de Sec23/24, reconocimiento de la carga por Sec24, unión de Sec13/31 (curvatura). Sec16 y TFG: factores que organizan la cubierta. C) Hidrolisis de Sar1-GTP y desprendimiento de la vesícula. No intervienen ni la dinamina ni las proteínas BAR. D) Pérdida de la cubierta Transporte de cargo de diferente tamaño desde el RE al ERGIC. Proteínas accesorias 60-80nm 150nm 350nm conexiones tubulares ¿Cómo se transporta el colágeno? Problema: diámetro vesícula COPII 80 nm. Los colágenos son más grandes. COPII: 80nm Demasiado pequeña Colágeno VII: longitud: 450 nm. Se secreta por la superficie celular basal. Colágeno I: longitud: 300 nm. Se secreta por todas los lados de la membrana plasmática. Colágeno XVII: longitud:300nm. Proteína transmembrana que se encuentra por la zona de los hemidesmosomas. Incorporación del procolágeno en vesículas COPII. Largo: 300-400 nm Proteínas accesorias: cTAGE5 y TANGO1 Sec12-GEF Sec16: organiza la cubierta cTAGE5 y TANGO 1 sirven de andamio para la formación de una vesícula suficientemente grande para albergar el procolágeno. (proteínas de embalaje). No viajan con la vesícula. Formación de una vesícula esférica vs una vesícula alargada. Modelos estructurales. Cubierta interna: islas de Sec23/24. Orientadas de manera aleatoria. Cubierta externa: Sec13/31: se ensambla sobre las islas formando triángulos, cuadrados o pentámeros. Cubierta interna: Sec23/24 se encuentra en forma arreglada y estable. Cubierta externa: Sec13/31 forma un entramado romboide. Membrana tubular cubierta Resumen 1) Las vesículas recubiertas de coatómero son vesículas que transportan proteínas desde el RE al Golgi (COPII) y desde el Golgi al RE (COPI) y entre las cisternas del Golgi (COPI). 2) Se ensamblan con la ayuda de pequeñas proteínas que unen al GTP (ARF y Sar1). 3) Las cubiertas tienen elementos estructurales en común y son flexibles. Algunas subunidades de coatómero reconocen la carga por su péptido señal. 4) El colágeno, que tiene un tamaño mayor que una vesícula de COPII, es transportado desde el RE al Golgi en mega-vesículas. TANGO1 y TAGE5 son proteínas transmembrana que lo empaquetan y sirven de andamio para la formación de megavesículas. Bibliografía básica Alberts et al. Biología molecular e la célula 6ª ed. Capítulo 12. Tráfico vesicular intracelular. Lodish et al. Molecular Cell Biology. 6th ed. Chapter 13.2. Molecular mechanisms of vesicular traffic. Capitulo 14.2. Bibliografía complementaria Dell´Angelica and Bonifacino (2019) Coatopathies: Genetic Disorders of Protein Coats. Annu Rev Cell Dev Biol. 35:131-168. Haller et al. (2015) MX GTPasas: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends in Microbiology 23:164-163. Hutchings and Zanetti (2019) Coat flexibility in the secretory pathway: a role in transport of bulky carriers. Current Opinion Cell Biol 59:104-111. McCaughey and Stephens (2019) ER-to-Golgi Transport: A Sizeable Problem. Trends in Cell Biology 29:940-953. Robinson MS. (2015) Forty Years of Clathrin-coated Vesicles. Traffic 16:1210-1238.