Ingeniería Genética - Técnicas de Estudio de la Expresión Génica - TEMA 10 PDF

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Ingenieria-genetica-TEMA-10.pdf mariaperezm Ingeniería Genética 3º Grado en Bioquímica y Ciencias Biomédicas Facultad de Ciencias Biológicas Universitat de València Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica La expresión génica diferencial está en la base de la diferenciación celular, del desarrollo y del funcionamiento de los organismos en condiciones normales y de enfermedad. Es fundamental para su adaptación al cambio de las condiciones ambientales y para la comunicación celular. En gran parte (pero no exclusivamente) los cambios en la expresión génica tienen lugar modificando la tasa de transcripción, y esto da lugar a variaciones en el nivel y tipos de transcritos. Sin embargo, no existe siempre una relación directa entre la tasa de transcripción y los niveles de transcrito ya que cabe considerar que hay variaciones en la estabilidad de los mRNAs una vez ya son sintetizados. No obstante, podemos decir que la variación en la tasa de transcripción está relacionada con los niveles de transcrito, por lo que se han desarrollado un gran número de técnicas con el objetivo de cuantificar y caracterizar los transcritos producidos en determinados momentos y/o condiciones. 1. Obtención del material de partida Este apartado es un breve repaso del TEMA 2. 1.1. Aislamiento de RNA ‣ Para extraer ácidos nucleicos (tanto DNA como RNA) se lisan las células y se utiliza una extracción orgánica (con detergentes no iónicos o basados en guanidinio; fenol/cloroformo). Para purificar RNA, el fenol se tampona a un pH ácido. ‣ Posteriormente, se realiza una precipitación con cloruro de litio (LiCl). ‣ Dado que el RNA es una molécula que se degrada con facilidad, han de tenerse precauciones. - La disrupción de células y tejidos debe ser rápida y eficiente. - También podemos desnaturalizar complejos proteína-ácidos nucleicos. - Debemos separar selectivamente el RNA de proteínas y DNA. - Lo más importante es la inactivación de RNasas. BCB 1 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica ‣ Respecto a la protección contra RNasas: - Todo el material ha de estar libre de RNasas (por ejemplo por pre- tratamiento del material con calor (180ºC, varias horas); y además debemos lavar con DEPC-H2O, NaOH o H2O2. - Suplementar con inhibidores de RNasas. - Incluir un agente caotrópico (que inactiva y precipita proteínas). Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 1.2. Evaluación de la integridad del RNA´ ‣ Espectrometría para estimar la pureza en RNA: - A260/A280 ๏ El RNA puro exhibe una razón A260/A280 de 1.8 a 2.0. ๏ Si A260/A280 < 1.7 indica contaminación de proteínas en la muestra. - A260/A230 ๏ El RNA purificado adecuadamente exhibirá esta razón en un rango entre 1.8 a 2.0. ๏ Si A260/A280 < 1.7 indica contaminación de guanidinio o fenol en la muestra. ‣ Gel de RNA para analizar si se ha degradado la muestra durante la extracción. Ha de realizarse en condiciones desnaturalizantes (gel y tampón), y se emplea para comprobar la integridad de los RNAs ribosómicos para inferir la integridad de los RNAs mensajeros. ‣ Aproximadamente el 80% del RNA de la muestra corresponde a los rRNAs 28S y 18S. Podemos determinar la integridad de la muestra (de los mRNAs, que constituyen menos de un 5%) evaluándolos. - En una electroforesis, los rRNAs deben de aparecer como 2 bandas distintivas. - La razón 28S/18S debe ser aproximadamente 2:1. ‣ Normalmente, esta estimación se hace “a ojo” en el gel teñido con bromuro de etidio. Sin embargo, sobretodo enfocado a preparaciones genómicas, a veces vale la pena analizar de forma más “cuantitativa” si nuestras muestras están intactas o si ha habido degradación (por ejemplo si las vamos a utilizar en un microarray o para RNA-seq). Esto se hace en un aparato que realiza una electroforesis en capilar a partir de una pequeña cantidad de muestra, y analiza los 2 picos, de RNA 18S y 28S. Los resultados informan sobre si el RNA total es de una calidad aceptable o no: si hay fondo entre los 2 picos, entendemos que ha habido degradación y no deberíamos trabajar con esta muestra. El parámetro que se emplea para medir la integridad del RNA de la muestra a partir de los picos se llama RIN (RNA Integrity Number). Algunos protocolos requieren determinado valor de RIM de la muestra para poderse llevar a cabo. BCB 2 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica 1.3. Aislamiento de mRNAs - En algunos casos, se puede utilizar RNA total, sin ninguna purificación, mientras que en otros— cuando los transcritos son escasos—hay que recurrir al aislamiento de RNAs poliadenilados, es decir, RNAs mensajeros. - Obtenerlos es relativamente sencillo: basándonos en Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. que los mRNAs tienen una cola poli(A) en el extremo 3’, podemos utilizar sondas oligo(dT) para separarlos de otros RNAs. Por ejemplo, pasándolos por una columna con una matriz-oligo(dT) en condiciones que favorezcan la hibridación. El mRNA se quedaría retenido en la columna, mientras que los rRNAs y tRNAs no. A continuación lavo y eluyo con H2O o tampones con concentración salina baja, de forma que los mRNAs se separen de los oligos de la matriz para poder recuperarlos. 2. Métodos tradicionales para el análisis individual de la expresión génica En este apartado se recogen los métodos más habituales para analizar transcritos de genes individuales o de conjuntos pequeños de genes. 2.1. Dot/Slot-Blot - En esta técnica, estudiada en el TEMA 8, el RNA se une directamente al filtro. Se trata de una técnica de hibridación sobre soporte en la que las muestras desnaturalizadas (sin fraccionar) se aplican en un pocillo y a través de una succión en la parte inferior de la membrana quedan retenidas en la misma, en una “mancha” que tiene la forma del pocillo. ✔ Es más sencillo que el Northern Blot y puede utilizarse para analizar muchas muestras a la vez. ✘ No hace una separación por tamaños de los RNAs. ✘ Tampoco informa de su integridad. 2.2. Northern Blot - En el Northern Blot puedes ver la banda de interés, si está degradada o no, y si tiene el tamaño adecuado (≠ dot/slot blot). Gracias a ello, permite detectar y cuantificar la presencia de un transcrito y proporciona información sobre su tamaño y procesamiento. - En la imagen (A) vemos un gel en el que se han corrido muestras de RNA total y de mRNA aislado. Pueden identificarse las 2 bandas correspondientes a los rRNAs en el primer caso. En el Northern Blot (B) se puede apreciar que la sensibilidad de la detección cuando se parte de mRNA es mucho mayor, ya que la proporción de transcritos aumenta. BCB 3 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica CUANTIFICACIÓN RELATIVA: siempre hay que referir la intensidad de la banda de interés (representativa de la cantidad de transcrito) a la abundancia de otros RNAs. Es decir, normalizar. Esto da solo valores relativos, y requiere que los niveles del RNA de referencia no varíen mucho entre las muestras que estamos comparando (diferentes tejidos o condiciones). Normalización frente a RNAs ribosómicos. Se emplea el rRNA 18S como estándar interno para comparaciones Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. cuantitativas. Es lo más fácil, pero no lo más preciso: al final, estamos comparando con RNAs que representan el 90-95% del RNA total, por tanto muchos órdenes de magnitud por encima de la expresión de un mRNA. Normalización frente a otro mRNA. Es mucho más preciso utilizar un transcrito reporter, que es un gen Fibronectina housekeeping que se supone que no varía su expresión con el tratamiento aplicado o entre los tejidos que se GAPDH están analizando. Son buenos controles internos para comparaciones cuantitativas. Los genes housekeeping más habituales son la β-actina, la GAPDH o la ciclofilina. Se expresan mucho y son fáciles de detectar. A pesar de todo, ninguno parece ser realmente similar en todos los tejidos mostrados. - Por tanto, las ventajas del Northern Blot (sobretodo en comparación con el Dot/Slot Blot) son: - ✔ Se puede medir tanto el tamaño como la abundancia del mensajero. ✔ Se puede re-hibridar con sondas de muchos genes. Esto es muy útil para re-hibridar con genes de referencia para la cuantificación relativa. ✔ Es muy sensible (puede detectar hasta 5 pg de un transcrito). 2.3. RPA (RNAse protection assay) - Esta técnica, también radiactiva como el Northern Blot, da aún más sensibilidad, porque consiste en la cuantificación de transcritos específicos en disolución (≠ sobre soporte, lo típico). Se trata del ensayo de protección frente a ribonucleasas, que, en breves palabras, se basa en la hibridación con una sonda específica seguida de la degradación de todos los RNAs que no hayan hibridado. ‣ Partimos de RNA total o mRNA. ‣ Se usa una sonda de RNA complementaria a la secuencia de interés, de cadena sencilla, con una longitud definida y marcada radiactivamente. - Esta ribosonda se puede obtener a partir de un plásmido que contenga la secuencia complementaria bajo el promotor del fago T7 o T3, como vimos en el TEMA 4. Se sintetizan por transcripción in vitro con la RNA polimerasa del fago T7, por ejemplo. - Normalmente, se añaden un 10% de secuencias extra a la ribosonda a cada lado, que no van a hibridar con el mensajero. Para ello, se colocan las secuencias de estos fragmentos sin homología flanqueando a la secuencia para la ribosonda de dentro del plásmido. ✴uso BCB 4 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica - La ribosonda se pone en exceso molar en la mezcla con respecto al RNA (4X). ‣ La hibridación tiene lugar en disolución. Se favorece así frente a la hibridación en soporte. ‣ Después de la hibridación, se digiere el RNA con RNasas específicas de cadena sencilla. - Cualquier secuencia del RNA diana no hibridada se degrada. - Las secuencias hibridadas permanecen intactas. La cantidad de marca radiactiva que sea resistente a la actividad de RNasas será proporcional a la cantidad de mRNA de interés que hay en la muestra. ‣ A continuación, se inactiva la RNasa y las muestras se separan en una electroforesis en PAGE en condiciones desnaturalizantes. En el gel veremos bandas más o menos intensas en función del nivel de protección de la RNasa. ✴ Las secuencias extra que se añaden en los extremos de la ribosonda sirven para asegurar que la RNasa ha actuado. ¿Cómo? Porque el tamaño de la banda cambia antes y después de la digestión de simple cadena. Como son secuencias sin homología, no aparean con el RNA diana, de forma que cuando actúe la RNasa se degradan también. ✴ Si no hubiera actuado la RNasa, detectaríamos marcaje radiactivo igual, pero se debería a la sonda sin hibridar. Gracias a la adición de estas secuencias extra, sabemos que la sonda sin hibridar es un poco más larga que la sonda protegida (que tiene los extremos recortados). Por tanto, la banda marcará un tamaño diferente (más pequeño) si la digestión con RNasa ha sido efectiva. La cantidad de sonda observada en el gel es proporcional a la cantidad de RNA diana (mensajero de interés) en la muestra original. 2.4. Técnicas de análisis de la expresión génica basadas en la PCR - Las técnicas basadas en la PCR son preferidas para sustituir el uso de la radiactividad, siendo, en este sentido, “más limpias y seguras”. Como sabemos, se basan en la amplificación de DNA, y como en este tema estamos hablando de transcritos de DNA, siempre se necesitará una retrotranscripción para obtener DNA a partir de un RNA (mRNA ⟶ single-strand cDNA). ‣ Retrotranscripción: método estándar ‣ A diferencia de los pasos vistos en el proceso de síntesis de cDNAs para la generación de genotecas (TEMA 5), si el objetivo es meramente detectar la presencia de un transcrito, no BCB 5 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica hacen falta los protocolos de síntesis de la segunda cadena, que son más complicados, y además solo se necesita 1 cebador para pasar de mRNA a cDNAss. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ‣ La retrotranscripción se acopla a una reacción de PCR con los productos de DNA formados, procedimiento conocido como RT-PCR. Se divide en 2 etapas: 1) Primera etapa: a partir de una muestra de RNAs totales o RNAs poliadenilados (mRNAs) realizamos la retrotranscripción y obtenemos cadenas sencillas de cDNAs. ๏ Empleamos como cebador para la transcriptasa reversa un oligo dT para Oligo dT amplificar selectivamente los RNAs Primera etapa Retrotrasncribimos poliadenilados. todos los RNAs RNasa H ๏ Tras la retrotranscripción, se obtienen cDNA primera cadena híbridos de doble cadena DNA-RNA. 1er ciclo Eliminamos el RNA tratando con Segunda etapa RNasa H y nos quedamos con la 2ndo ciclo PCR con primera cadena de cDNA, que ya es oligos específicos suficiente para iniciar la reacción de PCR. 2) Segunda etapa: consiste en los ciclos de la PCR que ya conocemos bien. En esta etapa buscamos amplificar específicamente un mRNA, no todos, así que ya no podemos utilizar un oligo dT como cebador, sino oligos específicos. ๏ Como disponemos de la secuencia del gen de interés, para el primer ciclo diseñamos un oligo Fw que permita la síntesis de la hebra complementaria del cDNA. ๏ De la misma forma, para el segundo ciclo diseñamos un oligo Rv. ‣ RT-PCR semicuantitativa ‣ La base de la cuantificación de transcritos a partir de RT-PCR consiste en asumir que los niveles de mRNA son equivalentes a los niveles de cDNA que sintetiza la transcriptasa reversa. Así, la idea es que obtendremos un producto de PCR proporcional a la cantidad de “molde” (el transcrito). BCB 6 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica Durante la amplificación solo hay una fase en la que la cantidad del DNA de partida es proporcional al producto amplificado. ‣ Esta aproximación se restringe a la fase exponencial de la amplificación, antes de que se alcance el “plateau” de saturación. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. De aquí no podemos extraer ‣ Como es una PCR semicuantitativa (no cuantitativa conclusiones cuantitativas absoluta), lo que haremos será una estimación, más que una cuantificación, de los niveles de transcrito, en función a la cantidad de producto obtenido. ‣ ‣ Estimamos la cantidad de transcrito por la intensidad de la banda el Seed Flower Ovule Markers del producto de PCR en el gel, y la referimos a un transcrito que suponemos que no varía en las condiciones ensayadas (es decir, normalización con un gen de referencia housekeeping). ‣ ‣ Se trata de una estimación bastante subjetiva, ya que debemos evaluar nosotros mismos que no hemos alcanzado el “plateau” de saturación con el número de ciclos empleados. En muchas ocasiones, la amplificación es APX1 muy alta y no pueden sacarse conclusiones a partir de APX2 los resultados del gel, como es el caso de la expresión APX3 del gen APX1 en cada uno de los tejidos comparados. APX4 Sin embargo, en otros como el gen APX3 hay menos APX5 cantidad de producto y los resultados parecen más APX6 fiables: en este caso estimaríamos que hay más APX7 cantidad de transcrito en raíces que en hojas, por Actin ejemplo. Utilizar un número reducido de ciclos aumenta la posibilidad de encontrar una proporcionalidad entre la cantidad de producto amplificado y la cantidad de molde inicial. ‣ La ventaja de este método es su facilidad: simplemente debemos obtener cDNA a partir de los transcritos, amplificarlo por PCR, y correr un gel. Si vemos que hay una cantidad de producto excesiva, que no nos deja extraer conclusiones, podemos repetir la PCR pero con un número menor de ciclos. Sin embargo, sólo nos permite estimar si tenemos mucho o poco transcrito. ‣ PCR a tiempo real / PCR cuantitativa (RT-qPCR) ‣ Cuando queremos una cuantificación absoluta (numérica), recurrimos a la PCR a tiempo real. Aunque la podemos llamar RT-PCR (de Real Time PCR), la abreviaremos como RT-qPCR (de quantitative PCR) para no confundirla con la anterior. Los aparatos de qPCR son evidentemente más complejos y más caros que los de PCR “convencional”. ‣ La qPCR se basa en una cuantificación del producto que se va acumulando en cada uno de los ciclos por la detección de la intensidad de fluorescencia, proporcional a la cantidad de DNA que se está amplificando (y por tanto al mRNA de la muestra original). BCB 7 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica - Sondas fluorescentes - La idea general para que el aparato detecte la aparición de producto de la reacción de PCR es el uso de un fluoróforo que se incorpora a las moléculas de DNA dúplex, es decir, aquellas que se han amplificado con los oligos específicos. En cada ciclo cuantificamos el producto de la PCR por la fluorescencia emitida por la muestra. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. - La sonda fluorescente utilizada con más frecuencia es SYBR GreenTM, una molécula plana que se intercala entre las bases, como el bromuro de etidio. Se une por tanto al DNA de doble cadena, es decir, al que se amplifica. En este caso, la detección de la fluorescencia se realiza al final de la fase de elongación (al final de cada ciclo), ya que será el momento en el que tengamos toda la población de cDNAs diana en forma de doble cadena. El momento (fase del ciclo) en el que medimos la fluorescencia dependerá de la sonda utilizada. Si utilizamos un agente intercalante, Si utilizamos sondas FRET, que emiten fluorescencia que se une al dsDNA, la mediremos cuando se unen al DNA diana por proximidad, la detección al final de cada ciclo. deberá hacerse durante la etapa de annealing. - La curva de amplificación - - - +/— - DETECCIÓN SNPs - Curvas de disociación - - - Ct - No sensibilidad Absoluta - CUANTIFICACIÓN Relativa - BCB 8 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica - La curva ideal de amplificación sería como la que vemos en la página anterior. Recordemos que el número de moléculas va creciendo de forma exponencial (2n), y lo inferimos a partir de los valores de fluorescencia (ΔRn). Aunque en los primeros ciclos parece que no aumente, sí lo hace: en cada ciclo hay el doble de fluorescencia que en el anterior, pero en los primeros ciclos la fluorescencia emitida es tan poca que no se detectan niveles fiables de la misma porque no tenemos la sensibilidad suficiente para ello. - Llega un momento en el que comienza a detectarse un aumento en la fluorescencia, ya que el aparato considera que la medida de fluorescencia es suficientemente alta para ser significativa. Llegamos por tanto a una etapa en la que la gráfica representa cómo el aumento en la cantidad de DNA es exponencial hasta que se acaban los reactivos y se llega a la fase Ct “plateau”. El primer ciclo en el que la medida de fluorescencia es viable y proporcional a la cantidad de DNA de partida se define como ciclo umbral (threshold cycle), Ct. RECUERDA: Hay proporcionalidad durante la fase exponencial. En la fase “plateau” se pierde la proporcionalidad. Además, cuanto antes cuantifique, más seguro puedo estar de que la cuantificación es proporcional. El problema es que cuando tengo muy poco producto no puedo detectarlo (o cuantificarlo) con precisión. - Si partimos de muy pocas moléculas, tendrán que sucederse muchos ciclos para alcanzar aquel en el que la medida de fluorescencia sea significativa (el Ct). Por eso, una Ct alta es indicativa de que la cantidad de transcrito de la muestra es baja; mientras que una Ct baja es indicativa de que la cantidad de transcrito de la muestra es alta. El valor de Ct es inversamente proporcional a la cantidad inicial de transcrito presente en la muestra. - - Terminología en RT-qPCR ๏ Rn (señal reportadora normalizada): fluorescencia del marcador / fluorescencia de la referencia pasiva. La referencia pasiva se trata de introducir un fluoróforo (como ROX) que normalice las variaciones de la fluorescencia que no se deben al experimento en sí, sino que se deben a las condiciones particulares de cada pipeteo/volumen de la muestra. ROX es un fluoróforo que no interacciona con el DNA, siempre está presente a lo largo del proceso de PCR, siempre emite lo mismo y que no aporta información. ๏ ΔRn: valor de fluorescencia normalizado, calculado como Rn – línea base (intervalo de ciclos para la fluorescencia de fondo, entre 3-15 ciclos). Desde el BCB 9 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica punto de vista de la cuantificación, este parámetro no es importante. ๏ Ct: ciclo de PCR en el cual se detecta por vez primera un aumento de la fluorescencia del marcador por encima de la línea basal (10 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. desviaciones estándar por encima de la media de la línea base de emisión). Este es el único valor que utilizaremos con fines cuantitativos. - Eficiencia - Si vamos a comparar la amplificación de muestras con mucho y poco material de partida, nos interesa que la eficiencia en la amplificación sea buena; es decir, que haya una proporcionalidad entre la cantidad del DNA de partida y el valor de Ct en un rango amplio de concentraciones. - Para calcularla, hacemos una recta de calibrado a partir de una serie de diluciones seriadas (normalmente en un factor de 10) de una muestra de DNA y registramos el Ct correspondiente a cada dilución. Se obtendrá un resultado como el de la figura derecha. - Si representamos el logaritmo (en base 10) de la dilución frente a los valores de Ct, la pendiente nos indica la eficiencia de la amplificación. - - Una eficiencia del 100% implicaría que la pendiente fuera —3,32. Esto es lo mismo que decir que el incremento de una unidad de abcisas (pasar de 1 a 10 en el número de copias) debe de traducirse en un cambio en el Ct de —3,32 (23,32=10). Es decir, que en 3,32 ciclos habré amplificado 10 veces mi DNA de partida. - - Un valor más negativo implica una eficiencia menor. Es decir, un incremento de concentración no se traduce en una disminución proporcional de la Ct. - La eficiencia se define con la fórmula de la derecha. Si la pendiente (slope) es —3,32 la eficiencia es 1. Esto quiere decir que cada vez que disminuya 3,32 unidades de Ct, hay 10 veces más BCB 10 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica DNA de partida. Por ejemplo: si mi Ct es –6,64 (2x3,32), 26,65=100 veces más. Es decir, 2–Ct nos está informando sobre las copias de DNA iniciales en la muestra. - ¿Os preguntáis de dónde viene la fórmula 2–Ct? Vamos a verla también más adelante, así que voy a poneros una demostración matemática que se me ocurrió para entenderlo, por si tenéis curiosidad. Esto Paco ni lo menciona, son todo movidas mías. - Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 2–Ct = copias del DNA de partida asumiendo una eficiencia del 100%: Si un Ct de –3,32 corresponde a 1 unidad de abscisas, un x Ct = x corresponde a unidades de abscisas. −3,32 Las unidades de abscisas está en valor logarítmico, de forma que siguen la fórmula unidades de abscisas! = log10 (nº de copias). Por ejemplo, 1 = log10 10 lo cual indica que una unidad de abscisa corresponde a un aumento de 10 veces en la cantidad de DNA de partida. ¿Cuántas copias más (n) habrá de un DNA con un Ct = x? Si unidades de abscisas = log10 n, n = 10unidades de abscisas. x Por tanto, la solución sería n = 10 −3,32. x 3,32 −x 10−x = ( 10 ) 3,32 n = 10 −3,32 = = 2−x Vemos que llegamos a la fórmula 2–Ct, que no sabíamos de dónde venía, a partir del razonamiento con la recta de calibración. Usaremos la fórmula pronto, pero os adelanto que para una cuantificación relativa, de forma que hablaremos de “n veces más/menos copias”. - Cuantificación ๏ Cuantificación absoluta - Raramente se hacen. Construimos una recta como la de las figuras anteriores, pero partiendo de una concentración conocida de molde (por ejemplo, utilizando un DNA plasmídico, fácil de cuantificar). ๏ Cuantificación relativa - Es más fácil de realizar que la cuantificación absoluta porque no es necesaria una curva de calibración. - - Se comparan los niveles de expresión del gen diana con un gen de referencia o control (un gen housekeeping). Es lo que se llama la referencia activa. Es un método adecuado para investigar los cambios fisiológicos en los niveles de expresión génica. BCB 11 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica - Se miden cambios relativos entre diferentes condiciones (por ejemplo tejido sano y enfermo, o el tratamiento con un fármaco) por lo que las unidades son irrelevantes. En las CUANTIFICACIONES RELATIVAS vamos a tener en cuenta 2 parámetros: El control endógeno, que son los transcritos de un gen housekeeping cuya transcripción suponemos que no va a variar en las condiciones investigadas Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. (suponemos que tiene un nivel uniforme de expresión). Es decir, es la referencia activa para normalizar (eliminar variaciones en la eficiencia de la retrotranscripción y errores en el imput de RNA). Cada tipo de muestra requiere su propio control endógeno. El calibrador, que es la muestra que se emplea para referir todos los resultados. Es una condición o tipo de muestra (por ejemplo, tejido sano frente a tumoral). - Por tanto, tenemos que normalizar el Ct que medimos para nuestro transcrito de interés en función a 2 parámetros: el gen housekeeping de la misma muestra (control endógeno) y la expresión del transcrito en el calibrador, la muestra en condiciones “normales” (tejido sano o t=0 en el experimento). 1º Normalizamos respecto al control endógeno: C tgen diana − C tgen housekeeping = ΔC t 2º Normalizamos respecto al calibrador: ΔC tmuestra − ΔC tcalibrador = ΔΔC t 3º Aplicamos la fórmula: 2−ΔΔC t , cuyo valor expresa cuántas veces más se ha expresado el gen diana en la muestra problema. Veamos un EJEMPLO. Estás calculando la expresión del gen p53 entre una muestra control y una procedente de un tumor. Indica el nivel de expresión de p53 (en número de veces) en la muestra del tumor respecto al control. Sin calcular nada podemos ver que hay más transcrito de p53 en el tumor ya que con 12 ciclos le basta para detectarse, mientras que el control necesita 15 (esto teniendo en cuenta que la referencia pasiva es similar en ambos casos) Normalizamos primero los Ct de las 2 muestras (control y tumor) respecto a la referencia pasiva (gen housekeeping GADPH): Ct − Ct = ΔC t p53 GAPDH ΔC t = 15 − 16,5 = − 1,5 muestra control ΔC tmuestra tumor = 12 − 15,9 = − 3,9 (muestra problema) Normalizamos después los ΔCt de la muestra del tumor respecto al calibrador (muestra control): ΔC tmuestra tumor − ΔC t = ΔΔC t calibrador ΔΔC t = − 3,9 − (−1,5) = − 2,4 Aplicamos la fórmula 2−ΔΔC t : 22,4 = 5,3. Esto significa que en el tumor hay 5,3 veces más DNA de partida respecto al tejido sano (>0), con lo que podemos interpretar que hay una inducción de la expresión del gen p53 en el tumor. BCB 12 de 31 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149635 Las descargas sin publicidad se realizan con las coins  Ingeniería genética TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica Si 2−ΔΔC t es un valor positivo (>0), interpretamos que hay una inducción del gen diana en la muestra problema. Si 2−ΔΔC t es un valor negativo (0) y verde infraexpresado (Δf