Ingeniería genética-TEMA-16 PDF

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Ingenieria-genetica-TEMA-16.pdf mariaperezm Ingeniería Genética 3º Grado en Bioquímica y Ciencias Biomédicas Facultad de Ciencias Biológicas Universitat de València Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos 1. Organismos modificados genéticamente Antes de comenzar, debemos saber que existen 2 formas de modificar de la secuencia de DNA en un organismo: a nivel somático y a nivel genético. A nivel somático: se trata de la modificación de células in vivo. ➙ Se realiza mediante electroporación, biobalística o infección (por lentivirus, retrovirus o AAVs). ➙ No se transmite a la descendencia. A nivel genético: en este caso podemos verdaderamente hablar de organismos transgénicos o “modificados genéticamente” (OMGs). ➙ Se realiza mediante la introducción de construcciones génicas en embriones tempranos (estado de zigoto o blastocisto). ➙ Se produce una integración del DNA en el genoma, lo cual lo modificará. Al DNA introducido se le llama transgén. ➙ Esta modificación permanece durante el desarrollo del organismo, incluyendo las células de la línea germinal. Debido a esto, la modificación se transmite a la descendencia. Este tipo de modificaciones serán las que veremos a lo largo del tema. 1.1. Aproximación genética ‣ La genética clásica, también llamada genética directa, se aproximaba al estudio Fenotipo de mutantes desde el fenotipo (aspecto) al genotipo (gen). Así, tenía que esperar a la aparición de mutantes espontáneos para poder seleccionarlos Genotipo como sujeto de estudio y descubrir (“pescar”) el gen implicado. ‣ Por ejemplo, a la derecha vemos mutantes espontáneos de GDF8 o miostatina (una TGFβ, que inhibe el crecimiento y la diferenciación musculares), que se caracterizan por tener un crecimiento hipertrófico de su musculatura. ‣ La genética inversa se fundamenta en el uso de tecnologías para mutar Genotipo específicamente un gen y así ir del genotipo al fenotipo. Estas mutaciones son dirigidas, y no solo se basan en eliminar el gen, sino que también pueden Fenotipo consistir en una ganancia de función. Así, podemos: BCB 1 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos - Suprimir una función y generar mutantes nulos o knock-outs (loss-of-function) específicos del gen que deseemos. - Añadir una función (gain-of-function), introduciendo la secuencia que queremos que expresen en su genoma. Dependiendo de la estrategia que se utilice para ello llamaremos a estos organismos transgénicos o knock-ins. Gdf8+/+ Gdf8—/— (knock-out) Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ‣ De esta forma, en el caso comentado anteriormente, generaríamos en primer lugar mutantes Gdf8—/— (knock-out) y así reproduciríamos el fenotipo de la hipertrofia muscular. ‣ ‣ Como podemos ver, esta aproximación tiene un gran potencial, ya que no necesitamos que las mutaciones aparezcan espontáneamente para poder relacionarlas con un fenotipo, sino que vamos directamente al estudio de la función génica. 1.2. Consideraciones sobre la manipulación de Mus musculus - El ratón doméstico (Mus musculus) es el organismo mamífero del que más cepas modificadas genéticamente la comunidad científica dispone en la actualidad. El primer experimento de modificación genética que se llevó a cabo en ratón fue en 1982, por el equipo de RM Evans. El artículo se titula “Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes” y describe la creación de un ratón transgénico que sobreexpresaba el cDNA que codifica para la hormona de crecimiento. En la portada de la derecha se observan 2 ratones de la misma camada: el de la izquierda, de mayor tamaño, es el transgénico. - Volved al título del artículo, que ahora probablemente no entendáis, una vez hayáis acabado el tema… - Trabajar con ratones supone una serie de ventajas e inconvenientes. - ✔ Tienen un ciclo de 9 semanas, relativamente rápido. Además, su ciclo es muy próximo al de humanos, lo cual los convierte en un fantástico organismo modelo. ✔ Son animales pequeños, lo cual reduce el coste de su mantenimiento en el animalario. ✘ Nos enfrentamos a un desarrollo intrauterino (típico de mamíferos). Por tanto, hay una compleja relación entre los tejidos embrionarios y extraembrionarios. El reto es modificar el embrión dada esta situación. 1.3. Estrategias de modificación genética de mamíferos - En este tema vamos a ver dos tipos de modificaciones (sobre ratones), cada una de ellas con su tecnología específica. BCB 2 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ‣ Desde 1980 podemos hacer transgénicos, con inserción al azar. Para ello la técnica que se emplea es la inyección de pronúcleos (punto 2). ‣ Desde 1988 podemos hacer ratones con mutaciones dirigidas (knock-outs o knock-ins) mediante técnicas de recombinación homóloga (punto 3). Hubo que esperar al cultivo de células madre embrionarias (ESCs) para llevar a cabo esta estrategia. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. MODIFICACIÓN GENÉTICA DE MAMÍFEROS 1980 1988 TRANSGÉNICOS KNOCK-OUTS / KNOCK-INS Inyección de pronúcleos Recombinación homóloga 2. Inyección de pronúcleos La primera tecnología de transferencia genética que se estableció fue la inserción de DNA exógeno en los cromosomas de ratón para producir mutantes de ‘ganancia de función’. Así, se consiguió generar los primeros mamíferos transgénicos, es decir, con sobre-expresión o expresión nueva de un gen (un transgén). Esta tecnología consiste básicamente en inyectar DNA lineal dentro de uno de los pronúcleos de un oocito fecundado. El proceso puede resumirse de la siguiente manera: oocitos fertilizados son extraídos del oviducto de una ratona y el gen de interés, usualmente contenido en un plásmido linealizado, es inyectado en el pronúcleo masculino mediante un micromanipulador. El DNA se integra al azar en el genoma y será heredado por todas las células del ratón. Los ovocitos/cigotos inyectados son inoculados en el oviducto de una madre nodriza en donde continúa su desarrollo, produciéndose así un ratón transgénico. Esto se trata de un resumen. A continuación vamos a ver el procedimiento en detalle paso a paso. BCB 3 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos GENERACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS POR INYECCIÓN DE PRONÚCLEOS ▪︎ Generación de la construcción génica. – cDNA del gen de interés (incluyendo genes reporteros) – Secuencias reguladoras de interés: con expresión constitutiva, tejido-específica o condicional. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ▪︎ Obtención de oocitos de una ratona superovulada. ▪︎ Microinyección de la construcción génica en uno de los pronúcleos de un oocito fecundado. ▪︎ Transferencia al oviducto de una ratona pseudo-gestante. Los últimos 3 pasos son la fase metodológica necesaria para introducir el transgen en el ratón de forma efectiva y que la descendencia sea viable. Comenzaremos por estos para entender cómo es la construcción de un ratón transgénico, y posteriormente hablaremos de las características que han de tener las secuencias de DNA que vamos a introducir. 2.1. Obtención de los oocitos de una ratona superovulada ‣ Ovulación (repaso para poner en contexto) - La fase proliferativa mitótica está restringida a las oogonias en la etapa prenatal. Es decir, que las hembras nacen con un número limitado de oogonias. Cuando las oogonias dejan de dividirse, entran en la fase meiótica, deteniéndose en el diploteno de la profase I de la meiosis, y convirtiéndose en oocitos primarios. - En este estado llegan a la pubertad, etapa en la que se empieza a producir la ovulación periódica por estímulos hormonales. La liberación de pulsos de hormonas (FSH y LH) MADUREZ SEXUAL induce la maduración de los oocitos. OVULACIÓN PERIÓDICA ๏ Ésta consiste en la organización del oocito y su zona pelúcida (la cubierta externa del oocito, formada por glicoproteínas) y una capa de células de la granulosa FECUNDACIÓN limitada por una membrana basal para constituir unidades estructurales llamadas folículos. ๏ Se completa la meiosis I con la producción de un corpúsculo polar. ๏ Se inicia, además, la segunda división meiótica quedando bloqueada en la metafase II, lo que produce un oocito secundario que es liberado del folículo. - Con la fecundación se completa la meiosis I. Por tanto, el “verdadero oocito” es aquel que ha sido fecundado, y necesitaremos extraer oocitos ya fecundados de una ratona. BCB 4 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ‣ Procedimiento para la obtención de oocitos fecundados - Características de la ovulación y el apareamiento de ratonas - Las hembras ovulan una vez cada 4-5 días. La fase y el momento del ciclo estral se puede monitorizar por la morfología externa de la genitalia, para ver si la hembra está más o menos receptiva (pero no es necesario). - Los ratones de laboratorio se mantienen en el animalario bajo unas condiciones muy reguladas. Una de ellas es la alternancia de ciclos de luz y oscuridad. En el periodo oscuro, “se vuelven locos”: la noche es su momento de mayor actividad y, entre otras cosas, se produce el apareamiento entre machos y hembras. Por tanto, como consenso consideramos que la cópula se produce a mitad del ciclo de oscuridad (simplificación). - Comprobación de la fertilización - Se puede monitorizar si se ha producido la cópula también por examen de los genitales a la mañana siguiente. En un ratón, se produce un tapón vaginal fácilmente identificable. En una rata, sin embargo, se requiere un frotis vaginal. - Superovulación - En los 3 días previos al apareamiento, se induce la superovulación de la ratona mediante la inyección de gonadotropinas: PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin), que sustituye a la FSH; y gonadotropina coriónica humana, parecida en efectos a la LH. - Así, se consigue que la ratona tenga hasta 50-60 oocitos fecundados (embriones) en sus oviductos. - Obtención de los oocitos fecundados - Si ha habido tapón vaginal, las 12 del mediodía del día de la fertilización (la mitad del período de luz) se consideran el estadio de gestación E 0.5 d. p. c. (después de la cópula). En este momento se obtienen los oocitos fecundados. Para ello, se realiza una extracción de trompas e irrigación con suero salino para la obtención de embriones. - Gracias a que se ha superovulado a las viables hembras, se obtienen oocitos suficientes. Tras limpiarlos, se seleccionan los que muertos han sobrevivido. En la imagen derecha se marcan con flechas los viables. 2.2. Microinyección de los pronúcleos - La fecundación se define como la serie de procesos celulares y moleculares por los cuales los gametos masculino y femenino se unen para comenzar la creación de un nuevo individuo con un genoma derivado de ambos progenitores. Por tanto, en el cigoto primero tendremos 2 núcleos: el del espermatozoide y el del óvulo. BCB 5 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos - El oocito secundario, parado en metafase II, sale del bloqueo cuando es fecundado por un espermatozoide. De esta forma, finaliza su 2ª división meiótica y se forma un corpúsculo polar. En este momento, en el citoplasma del cigoto hay 2 pronúcleos: el núcleo del espermatozoide (♂) y el núcleo del oocito (♀) acabando la 2ª división meiótica, es decir, en telofase. Este pronúcleo femenino está en la periferia del oocito, donde se está formando el corpúsculo polar. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Pronúcleo femenino: se forma tras concluir la meiosis detenida en metafase II (se libera el segundo corpúsculo polar). Pronúcleo masculino: se produce la desintegración de la membrana nuclear, la sustitución de protaminas por histonas del oocito y la reformación de la membrana nuclear. El centrosoma del espermatozoide produce un áster de microtúbulos que alcanzan al pronúcleo femenino permitiendo el acercamiento. - La microinyección se lleva a cabo en la fase de 2 pronúcleos (C), antes de que se fusionen. - La inyección se realiza en 1 de los pronúcleos del oocito fecundado, normalmente el pronúcleo masculino (♂) simplemente porque es más grande y facilita el proceso, importante ya que la microinyección se trata de una técnica manual. ‣ Instrumentos necesarios para la microinyección - Para hacer microinyecciones en células, necesitamos un sistema microscópico que nos permita visualizar células vivas, sin teñir. El que nos permite esto es el microscopio invertido con óptica de contraste interdiferencial (Nomarski), que da una sensación de relieve para poder manipular las células. - Además del microscopio, el sistema está dotado de micropipetas/agujas para sujetar los oocitos e inyectar el DNA, que el experimentador maneja mediante joysticks. BCB 6 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ‣ Manipulación de los oocitos - Los oocitos se colocan en una placa Petri mediante un capilar de transferencia (que succiona y los mantiene inmóviles, “en fila”) sobre gotas de aceite mineral para que no se muevan en la placa. Sobre esto se añade el medio de cultivo. - Una vez aquí, se procede a la microinyección individual de los Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. oocitos, para lo cual se necesitan 2 pipetas: - Una micropipeta de succión, que es un capilar de vidrio con punta biselada y roma para que no rasgue el oocito. Lo sujeta mediante presión negativa (succión) para que no se mueva durante la microinyección. - Una micropipeta de inyección, mucho más estrecha, con el DNA que queremos inyectar. Con un sistema de presión pulsada, se suelta el DNA y se introduce en el pronúcleo masculino. ‣ Resultados de la microinyección - Tasa de supervivencia de cigotos: 10-30%. - Tasa de integración genómica del transgén: 5-40%. - Se trata de una integración al azar, y en ratón frecuentemente se integran varias copias en tándem en una única posición. hc: holding capillary pb: polar body zp: zona pellucida fp: female pronucleus mp: male pronucleus 2.3. Transferencia al oviducto de una ratona pseudo-gestante - En este último paso llevamos a término la construcción del ratón transgénico. Para ello, el cigoto tiene que desarrollarse intrauterinamente, así que debemos trasladarlo al oviducto de una ratona nodriza. Se utilizan ratonas pseudo-gestantes, es decir, que “piensan que están embarazadas” y por tanto son receptivas a la gestación. BCB 7 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ‣ Obtención de una ratona pseudo-gestante - Los cigotos supervivientes se transfieren al oviducto de una hembra pseudo-gestante. Estas hembras “pseudo-preñadas” se obtienen mediante el apareamiento con un macho infértil, sobre el que previamente se ha practicado una vasectomía. Este apareamiento condiciona su endometrio para la recepción del cigoto. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. cópula × ♀ ♂ infértil ↓ ♀ nodriza - Los machos se vasectomizan por sección del vaso deferente, siguiendo el procedimiento quirúrgico que vemos a la derecha (curiosidad). ‣ Transferencia al oviducto - Los cigotos modificados se introducen en el oviducto de las hembras pseudo-preñadas. - - Primero, los dejamos en el incubador unas 12-24 h para ver si son viables tras la microinyección. Los que están en el estadio de 2 células pueden seleccionarse para introducirse en el infundíbulo del oviducto. Ovario - Para introducirlos, se realiza una incisión a nivel del abdomen, se extrae el oviducto (que es como un embudo), y con una micropipeta como las que hemos visto antes, se introducen los embriones, se cierra, y se deja que la ratona los lleve a término (curiosidad también). ‣ Resultados de la transferencia (o del proceso global) - Cuando se hace un experimento de este tipo, trabajamos con probabilidades, y debemos saber que vamos perdiendo oocitos en cada fase. - Un 10-30% de la descendencia es transgénica. - Los ratones a término (que han nacido) y portan el transgen (transgénicos) se llaman ratones fundadores o founders. - Transmiten el transgén a su descendencia, porque lo tienen en todas sus células, tanto somáticas como germinales, creando así una línea fundadora (founder line). BCB 8 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos - Cada línea fundadora se caracteriza por un evento específico de integración. Es evidente, ya que con cada microinyección, aunque se haya introducido la misma construcción de DNA, la inserción en el genoma va a ser diferente ya que está sujeta al azar. 2.4. Limitaciones | análisis de líneas fundadoras - El problema de la transgénesis no será la propagación del transgen a la descendencia, sino la inserción aleatoria del transgen en el genoma. Esto se refleja en 2 limitaciones fundamentales: - ✘ La caracterización de varias líneas, ya que hermanos de camada, procedentes de diferentes óvulos microinyectados, pueden incorporar el transgen en sitios distintos del genoma. ✘ El efecto de posición, ya que al no controlar dónde se inserta el transgen no sabemos si su expresión va a verse alterada por su contexto genético (promotores, silenciadores…) y epigenético (heterocromatina, metilaciones.)… Los efectos de posición pueden provocar expresión aumentada, ectópica (en un tejido que no es) o silenciamiento. Para estudiar si el transgen se está expresando de la forma que se esperaría, se caracteriza en las líneas fundadoras mediante diferentes aproximaciones. No olvidemos que nuestro transgen porta un promotor sintético conocido, así que nosotros sabemos dónde y cuándo debería expresarse a no ser que caiga en una zona del genoma que modifique su patrón de expresión. - Pondremos un ejemplo para ver cómo estudiamos cuál de las líneas fundadoras tiene una expresión normal o deseada. Se trata de la introducción del cDNA de la proteína Tau bajo el promotor mThy1, que tiene una expresión neuronal. - Para comprobar el evento de transgénesis, hacemos un genotipado (b), que consiste en determinar por PCR con cebadores específicos para nuestra construcción si éste se encuentra presente en el DNA genómico del ratón, que podemos extraer de un trozo de cola u oreja. Así, podemos también comprobar la transmisión del transgen en cada línea. - En un genotipado confirmamos la presencia del transgen, pero no obtenemos nada de información acerca de su expresión. Mediante un Western Blot (c) podemos analizar la presencia de la proteína Tau en cerebro, así como cuantificar sus niveles, que no serán iguales en todas las líneas transgénicas (1-4) y estarán asociados a fenotipos distintos. Esta situación estaría poniendo de manifiesto la existencia de un efecto de posición en el lugar en el que se encuentra el transgen insertado en cada línea. - - Además, podemos estudiar el patrón de expresión por inmunofluorescencia en tejido (d). Así lidiamos con los efectos posición y podemos seleccionar la línea que nos interesa. BCB 9 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos - Recordemos que nuestra construcción génica ya EFECTOS POSICIÓN + ? contiene un promotor de expresión específico para el Expresión normal/deseada cDNA de interés, pero aún así el efecto posición puede alterar la expresión deseada. - Por ejemplo, puede ocurrir que el transgen quede bajo el control de elementos en cis enhancers o Los EP pueden Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. silencers. También puede ser que se incorpore a una provocar expresión aumentada, ectópica o silenciamiento región de la cromatina que se va a heterocromatinizar CH3 CH3 CH 3 CH3 CH3 CH3 CH3 o a sufrir cambios de metilación (silenciación). La única forma de controlar el efecto posición es caracterizar las líneas transgénicas generadas y quedarnos con aquella que nos interese para su estudio funcional. 2.5. Diseño de la construcción - Como ya hemos visto cómo se genera un ratón transgénico a nivel práctico, ahora vamos a centrarnos en la construcción y el diseño de los transgenes que introducimos. Es decir, vamos a responder a la pregunta: ¿qué tiene que tener una construcción génica para la transgénesis en mamíferos? ‣ Componentes de la construcción - Gen (cDNA): debe contener, además de la secuencia que queremos expresar, los elementos reguladores necesarios para ello. ๏ Un cDNA codificador de la proteína de interés o de un gen reportero. Se emplean cDNAs porque los genes eucariotas completos, con sus intrones, son demasiado largos para construir efectivamente un transgén. ↳ Si el DNA expresado pertenece a un gen funcional, podremos realizar estudios sobre el efecto fenotípico de la expresión del transgén, generando mutaciones de ganancia de función (GOF, gain-of-function). ↳ Si el DNA expresado pertenece a un gen reportero, podremos llevar a cabo estudios de regulación génica específica de tejido y estadio. Por ejemplo, para la identificación de secuencias en cis que regulan los patrones de expresión específicos en el animal. ๏ Una secuencia Kozak [GCCGCC (G/A) NN] para el reconocimiento del mRNA por ribosomas. ๏ Un codón de inicio de la traducción (ATG). ๏ Un codón de stop de la traducción (UGA, UAG, UAA). ๏ Señales de stop de la transcripción incluyendo la secuencia de poliadenilación (AAUAAA), necesaria para la maduración del RNA mensajero. ๏ De forma opcional puede introducirse un intrón artificial (por ejemplo, el del SV40, o el de la β-globina de conejo). El splicing del mismo mejora la estabilidad del mRNA porque ayuda a la maduración correcta del transcrito. BCB 10 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ๏ Secuencia IRES (Internal Ribosomal Entry Site): descrita inicialmente en picornavirus, es una secuencia de aproximadamente 500 pb que permite la construcción de transgenes bicistrónicos conteniendo varias regiones codificadoras para proteínas (generalmente 2). La traducción de la segunda proteína usa el ATG del IRES. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. - Promotor sintético - Las secuencias reguladoras nativas de mamíferos son gigantes (A), y no es viable colocarlas “tal cual” en la construcción delante del cDNA de interés. Por eso, los promotores que se emplean son sintéticos, más pequeños (B), y se construyen a partir de un promotor mínimo, que basta para que se una la RNA Pol II; añadiéndole elementos en cis que afinan la regulación de la expresión del transgen. En resumen, un promotor sintético contiene: ๏ Un “promotor mínimo”, que simplemente contiene la secuencia de unión de la RNA polimerasa. ๏ Más elementos reguladores en cis responsables de controlar la maquinaria de la transcripción. ๏ Más elementos reguladores en cis responsables de modular el nivel y especificidad de la transcripción. - Gracias a estos elementos reguladores en cis podremos controlar el nivel de expresión que buscamos: por ejemplo para que sea constitutiva, tejido-específica, etc. ‣ Vectores - Para fabricar y obtener copias del DNA que queremos inyectar, haremos uso de los sistemas que hemos visto a lo largo de la asignatura. - - Los vectores procariotas pueden ser usados para la clonación y NotI la amplificación del DNA a inyectar. Existen diversos tipos de estos vectores con un multi-cloning site con secuencias de restricción que estén poco representadas en el genoma BssHII eucariota. Por ejemplo, para la enzima NotI o BssHII. Un ejemplo de plásmido que contiene estos sitios es el pBluescript. - Sin embargo, el inserto de cDNA clonado en el vector debe inyectarse sin el DNA plasmídico: ¡hay que sacarlo de ahí! Encontrarse dentro del vector no afecta a la integración pero sí a la expresión. Para ello, lo que se hace es diseñar el constructo rodeado de sitios de restricción conocidos para así realizar una digestión con las enzimas pertinentes, diferenciar las bandas en un gel de agarosa, seleccionarlas y extraerlas, y purificar el cDNA. - Para la introducción de secuencias muy largas se pueden utilizar BACs (bacterial artificial chromosomes; circulares) y YACs (yeast artificial chromosomes; lineales). BCB 11 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ✓ No hace falta linealizar los BACs. ✓ El vector en este caso no afecta a la expresión y no tenemos que separar la construcción de cDNA. Isabel no sabe por qué, es lo que se ha visto. ‣ Genes reporteros - En el caso de utilizar el cDNA de un gen reportero como transgen, podemos estudiar su Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. expresión. - Ejemplos de genes reporteros en mamíferos lacZ El transgen lacZ, procedente de E. coli, codifica para la β-galactosidasa. Si esta enzima se encuentra presente en un tejido, puede producirse una reacción histoenzimática sencilla con el sustrato X- gal, que da un precipitado de color azul. Fosfatasa alcalina placentaria (AP) La fosfatasa alcalina cataliza una reacción enzimática sencilla con los sustratos NBT/BCIP, que produce un precipitado de color violeta oscuro (formazán). En la imagen, la PA se expresa bajo el control de un promotor específico de células de la cresta neural. - Como vemos, estos dos reporteros son útiles para reacciones histoenzimáticas, por lo que únicamente se pueden revelar sobre tejidos fijados, es decir, muertos. La introducción de las proteínas fluorescentes fue toda una revolución para el estudio de la expresión génica in vivo. Proteínas fluorescentes Las proteínas fluorescentes permiten una visualización directa y sobre animales o tejidos vivos. La GFP fue descubierta y aislada por Osamu Shimomura de la medusa Aequorea Victoria. Martin Chalfie vio su potencial y clonó el gen en C. elegans. Posteriormente, se comprobó que funcionaba en homeotermos. Roger Tsien encontró otra proteína fluorescente, en este en el coral Discosoma, que llamó DsRed. Esto les valió el Nobel. A partir de éstas se han producido derivadas por mutagénesis de los residuos responsables, que emiten en distintas longitudes de onda, obteniéndose así una amplia gama de colores: GFP, YFP, CFP, DsRed, tdTomato, dCherry… Esto nos permite generar transgénicos con combinaciones y marcar células de forma diferencial. BCB 12 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos - Aplicaciones de los organismos transgénicos con reporteros ๏ Estudios de secuencias reguladoras ๏ Podemos emplear los transgenes para la identificación de dominios de expresión y reguladores lejanos. ๏ ๏ Por ejemplo, insulina sólo se expresa en células β-pancreáticas, y esto es así porque el gen que la codifica tiene una secuencia reguladora que se encarga de su expresión específica en este tejido. Por tanto, si nos interesa dirigir la expresión de un transgen para que sólo se produzca en células β-pancreáticas, tendremos que identificar las características de su promotor. No obstante, las secuencias reguladoras de mamíferos son muy largas, tanto que es inviable introducirlas en una construcción. Por tanto, lo que buscamos con el método que vamos a explicar es identificar las regiones de secuencias reguladoras que determinarían específicamente la expresión del gen de la insulina en células β-pancreáticas. Para ello, lo único que podemos hacer es un estudio in vivo, para comprobar la expresión en el tejido que buscamos, y empleamos ratones transgénicos. ๏ Partimos de la premisa de que los genes están acompañados por secuencias no codificantes que contienen regiones reguladoras que controlan su patrón espacial y temporal de expresión. Por ejemplo, en la figura (A), la proteína X se expresa en las células B, E y F. Dado que no podemos introducir directamente el transgen acompañado de la secuencia reguladora completa que encontramos en mamíferos, seguimos la siguiente estrategia: ๏ Se fragmentan las secuencias reguladoras en trozos y, con cada una de ellas (con cada trocito) se hace una construcción con un gen reportero (B). Así, podemos generar diferentes ratones transgénicos que tengan el gen reportero bajo el control de un trozo de la secuencia reguladora original. ๏ ๏ ๏ ๏ ๏ ๏ ๏ ๏ Proporciona «secuencias reguladoras» para expresión específica BCB 13 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ๏ Dado que podemos seguir el patrón de expresión de un gen reportero, podemos identificar cómo, dónde y cuándo controla la expresión cada fragmento de secuencia reguladora que acompaña a los transgenes. Así, se pueden extraer conclusiones acerca del papel de las secuencias reguladoras que conforman el promotor original. Por ejemplo, basándonos en los resultados de la figura anterior, deduciríamos que la secuencia reguladora 3 activa el gen en la célula B, la secuencia reguladora 2 activa el gen en las células D, E y F y la secuencia reguladora 1 inactiva el gen en la célula D. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ๏ ๏ Como podemos imaginar, es un trabajo muy laborioso (aunque en la figura de la página anterior se ha simplificado al máximo). Hay que construir múltiples transgénicos para investigar cómo regulan los promotores upstream la expresión de un gen en diferentes momentos del desarrollo o tejidos. EJEMPLO: IDENTIFICACIÓN DEL PROMOTOR DEL GEN Myf5 Avanzada “A potent enhancer region regulating Myf5 expression in limb muscles and somites has been identified previously at –58/–48 kb upstream of the transcriptional start site. Here, we focus on the physical and functional dissection of this control region.” Para identificar la secuencia reguladora que promueve una expresión normal del gen Myf5 (un factor miogénico clave en la diferenciación muscular), se realizaron diversas construcciones con lacZ como reportero y fragmentos de su promotor original. Nos fijaremos en los transgenes Myf5-I y Myf5-II. Se estudiaron embriones de ratones transgénicos en diferentes estadíos embrionarios conteniendo Myf5-I y Myf5-II en presencia de X-gal. La aparición de un precipitado azul oscuro indica las localizaciones en las que las secuencias reguladoras de Myf5 están activando la expresión del transgen lacZ. Se aprecia un patrón de expresión diferente en función del trocito de la región reguladora utilizado. Se considera que Myf5-I reproduce el patrón de expresión original y se denomina “promotor de Myf5” a la secuencia reguladora que estaba en este transgen. OJO: el promotor de Myc5 no es la secuencia reguladora de Myc5, sino el trocito de la misma que es suficiente para reproducir el patrón de expresión endógeno. ๏ Cuando hablamos de “promotor de la insulina” (por ejemplo) en un contexto de transgénesis, nos referimos al fragmento de su secuencia reguladora original que es responsable de que el transgen se exprese como se expresa la insulina. BCB 14 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ๏ Por tanto, los estudios de secuencias reguladoras en organismos transgénicos con reporteros proporcionan, además de conocimiento básico sobre los patrones de expresión secuencias para la expresión dirigida de transgenes. ๏ No debemos olvidarnos de los efectos posición, que nos acompañan siempre en eventos de mutagénesis insercional al azar, y que pueden modificar la expresión del transgen independientemente del promotor que le hayamos puesto. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ๏ Marcado de poblaciones específicas de células ↳ Para su seguimiento/análisis en vivo en el organismo transgénico. ↳ Para trasplantes, por el marcado de poblaciones para su seguimiento en un organismo huésped. ๏ A continuación veremos algunos ejemplos de marcaje con transgenes fluorescentes (Avanzada). ANDi fue el primer primate modificado EXPRESIÓN DE GFP EN PIEL genéticamente (en Oregon Health Sciences DE RATÓN University). Nacido el 2 de octubre de 2000. Su nombre, ANDi, proviene de de “inserted DNA” leído al revés. THE BRAINBOW TRANSGENIC MOUSE (combinación transgénica) En 2007 se desarrolló la línea transgénica Brainbow, en la que cada neurona en el cerebro emite fluorescencia en un color distinto. BCB 15 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ‣ Promotores - Promotores de genes housekeeping: determinan expresiones ubicuas. Los utilizamos si queremos que el transgen se exprese en todas las células, ya que son constitutivamente activos. Entre ellos, destacamos: ๏ Promotor de la β-actina, que en realidad es una fusión del promotor de la β-actina de Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. pollo y el enhancer del citomegalovirus (CMV). ๏ Promotor del locus Rosa26, que codifica para un RNA nuclear y se expresa en el desarrollo embrionario y durante la etapa adulta. Es uno de los locus más utilizados para expresión constitutiva, pero como veremos más tarde tiene más importancia como locus donde introducir genes que como promotor sintético. ๏ Promotor de metalotioneína de ratón ๏ Promotor del gen Hmgcr (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase) ๏ Promotor de la histona H4 - Promotores específicos: Surgen de los análisis de expresión de transgenes reporteros que hemos visto en las páginas 13-14. Serían por ejemplo el “promotor de la insulina”, el “promotor Myc5”, etc. Actualmente están aumentando en número. - Promotores inducibles | Sistema inducible por tetraciclina - Los promotores inducibles nos permiten, además de dirigir la expresión a un tipo celular concreto, decidir cuándo queremos que ocurra. En este apartado nos centraremos en los promotores inducibles por el antibiótico tetraciclina, ampliamente utilizados para controlar la expresión puntual de transgenes en mamíferos. - - Este sistema deriva del del operón de resistencia a tetraciclina (tet) de E. coli, que no se encuentra en genomas eucariotas. - ๏ Componentes del operón tet y funcionamiento ↳ TetA: es el gen que codifica para un exportador de tetraciclina, lo cual hace a las bacterias resistentes al antibiótico. ↳ TetR: es un represor de la transcripción del gen TetA. ↳ TetO: es el operador Tet, es decir, la zona de control del gen TetA. ↳ TRE: es una secuencia de 19 pb localizada en el operador. ๏ TetR se une a la secuencia TRE del operador (TetO) cuando no hay tetraciclina. Cuando hay antibiótico, el represor se separa del operador y se transcribe TetA. En definitiva: la activación del operón tet responde a la presencia de tetraciclina. ๏ Adaptación del sistema inducible por tetraciclina a mamíferos ❶ En lugar de utilizar tetraciclina, se utiliza un análogo, la doxiciclina. BCB 16 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Elimina la publicidad de este documento con 1 coin  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ❷ Generación de un ratón transgénico inducible por doxiciclina ❷ Necesitamos 2 cepas de ratones transgénicos: una de ellas porta el activador (TetR*no tal cual) y otra el «respondedor» (TetO). ❷ ▪︎ 1ª cepa. Transgén activador tTA ▪︎ Esta cepa porta un transgen que codifica para el regulador del sistema inducible por tetraciclina. Este regulador no es el represor TetR, sino un activador tTA. ▪︎ La proteína tTA se obtiene por fusión entre el regulador bacteriano que se une a tetraciclina (TetR) y un dominio de transactivación VP16 del virus del herpes simple. Así, pasa a ser un activador en la transcripción en lugar de un represor. Es decir, que cuando está unida al DNA activa la transcripción. ▪︎ ▪︎ Funcionará de forma que, en ausencia de doxiciclina, tTA permanecerá unida a TetO (cuando este esté presente), activando la expresión del gen que esté bajo su control. En presencia de doxiciclina, se separará de TetO y no podrá promover su expresión (funciona al revés que el sistema natural). ▪︎ La expresión de tTA se controla utilizando un promotor general o un promotor específico de tejido. Proteína tTA (DNA codificante) ▪︎ 2ª cepa. Transgén «respondedor» ▪︎ Esta cepa contiene un transgen con el gen de interés bajo el control de la secuencia de respuesta del TetO combinada con un promotor mínimo (como el del CMV). TRE: secuencia de respuesta + promotor mínimo (DNA regulador) ❷ El sistema inducible por tetraciclina (doxiciclina) se constituirá cuando se crucen ratones de las dos cepas y la descendencia contenga el transgen con × el regulador tTA y el transgen con la secuencia de respuesta controlando al gen de interés. tTA TRE+ GOI ↓ ❷ El cruce se representa en la figura de la derecha, aunque de forma muy simplificada y asumiendo que los GOI inducible parentales son transgénicos homocigotos (lo cual no por doxiciclina suele ser así). Solamente es para ilustrar la idea general. BCB 17 de 38 a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6149633 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Ingeniería genética TEMA 16: Modificación genética de mamíferos ❷ OJO, porque la cepa 1 expresará el regulador tTA pero éste no estará unido al DNA ni activando nada, porque no encontrará en el genoma secuencias TetO, que son exclusivas de E. coli. Por eso, la cepa 2 es la que contiene el transgen con la secuencia del operador para que, al cruzarse, tTA pueda unirse. Seguro que os habéis dado cuenta de que siempre hablamos de generar 2 cepas transgénicas para luego cruzarlas cuando necesitamos que los ratones Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. sean dobles mutantes en algo. Podríamos preguntarnos… ¿y por qué no introducimos las 2 mutaciones directamente en un ratón? La respuesta tiene que ver con el porcentaje de éxito de cada una de las operaciones que se realizan hasta obtener un transgénico, que como hemos visto va disminuyendo. Si generar un transgénico por la metodología de inyección de pronúcleos que hemos visto ya es difícil: pocos zigotos sobreviven, pocos incorporan el transgen en el genoma y solamente un 10-30% de la descendencia es transgénica; imaginaos generar un doble transgénico. Por tan