Tema 7

Ingeniería Genética - TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica

• La expresión génica diferencial es fundamental para la diferenciación celular, el desarrollo y el funcionamiento de los organismos.

• Los cambios en la expresión génica, en gran medida, modifican la tasa de transcripción, afectando los niveles de transcritos.

• La estabilidad de los mRNAs también influye en los niveles de transcritos.

• Existen diversas técnicas para cuantificar y caracterizar los transcritos producidos en momentos y/o condiciones específicas.

Obtención del material de partida

• El aislamiento de RNA implica lisis celular y extracción orgánica con detergentes no iónicos o basados en guanidinio, utilizando fenol/cloroformo.

• El fenol se tampona a un pH ácido para purificar el RNA.

• La precipitación con cloruro de litio (LiCl) es posterior a la extracción.

• Es crucial la inactivación de ribonucleasas (RNasas) durante todo el proceso.

Evaluación de la integridad del RNA

• La razón A260/A280 para RNA puro oscila entre 1.8 y 2.0.

• Una razón inferior a 1.7 indica contaminación proteica.

• La razón A260/A230 para RNA purificado está entre 1.8 y 2.0.

• Un valor inferior a 1.7 indica contaminación por guanidinio o fenol.

• El gel de RNA se utiliza para evaluar la degradación de la muestra.

• En la electroforesis, los rRNAs (28S y 18S) deben aparecer como dos bandas distintivas.

• La relación 28S/18S debe ser aproximadamente 2:1.

Métodos tradicionales para el análisis individual de la expresión génica

Dot/Slot-Blot

• Es una técnica sencilla para analizar múltiples muestras simultáneamente.

• No separa los RNAs por tamaño.

• No proporciona información sobre la integridad del RNA.

Northern Blot

• Permite detectar y cuantificar transcritos, determinando su tamaño y procesamiento.

• Muestra bandas diferenciales para RNAs totales y mRNAs aislados, mejorando la sensibilidad de detección.

Normalización frente a RNAs ribosómicos

• El rRNA 18S es comúnmente utilizado como referencia interna para la cuantificación.

RPA (RNAse protection assay)

• Es una técnica sensible para cuantificar transcritos específicos en disolución.

• Se basa en la hibridación de una sonda específica seguida de la degradación de RNAs no hibridados.

• La cantidad de sonda que resiste a la RNasa es proporcional a la cantidad de mRNA de interés.

PCR a tiempo real (RT-qPCR)

• Es una técnica cuantitativa que mide la fluorescencia para determinar la cantidad de producto amplificado.

• El momento de medir la fluorescencia depende del tipo de sonda utilizada.

• Las sondas intercalantes, como SYBR Green™, se unen al dsDNA, midiendo la fluorescencia al final de cada ciclo.

Sondas fluorescentes

• La sonda fluorescente SYBR Green™ se intercala entre las bases del dsDNA.

• En la qPCR, la medición de la fluorescencia se realiza al final de cada ciclo para cuantificar el producto amplificado.

• OTRAS Sondas: existen otras sondas que permiten la detección de transcritos específicos.

Métodos genómicos para análisis de conjuntos de genes o genomas

• Microarrays: Emplea sondas para cada gen en un chip de vidrio para analizar la expresión de todos los genes al mismo tiempo.

• RNA-Seq: Un método más actual, secuenciando todo el transcriptoma de la célula.

Construcción de genotecas para RNA-seq

• Se generan bibliotecas de fragmentos de cDNA a partir de mRNAs.

• Se añaden adaptadores de secuenciación a los transcritos retrotranscritos.

• Se utilizan cebadores hexaméricos aleatorios para cubrir todos los fragmentos de RNA durante el proceso.

• Se utilizan protocolos que permiten obtener cDNAs etiquetados con adaptadores 5' y 3' para la secuenciación.

Cuantificación de transcritos

• Se utilizan las lecturas posicionadas en los exones para cuantificar los transcritos.

• Los datos obtenidos se normalizan con respecto a la longitud del gen y el número total de lecturas para representar una cuantificación relativa.

Single Cell RNA Sequencing (SCG)

• Se aplica el RNA-Seq para analizar la expresión génica en una única célula, mostrando diferencias en la expresión génica entre células similares.

Separación física de células individuales

• Métodos como la citometría de flujo (FACS) y los basados en microfluidos se utilizan para separar células individuales.

Obtención de la genoteca CEL-seq

• Se obtiene una librería de fragmentos de cDNA con extremos conocidos para su posterior secuenciación.

Técnica Run-on

• Permite medir la velocidad de síntesis de nuevos transcritos en la célula.

• Los núcleos son aislados y se utilizan ribonucleótidos marcados para registrar la transcripción contínua.

• El número de moléculas marcadas es proporcional a la velocidad de transcripción.