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Questions and Answers
¿Cuál es el valor aproximado de la razón 28S/18S en rRNAs que aparece en una electroforesis?
¿Cuál es el valor aproximado de la razón 28S/18S en rRNAs que aparece en una electroforesis?
¿Qué indica la presencia de fondo entre los dos picos de RNA 18S y 28S en una electroforesis?
¿Qué indica la presencia de fondo entre los dos picos de RNA 18S y 28S en una electroforesis?
¿Qué parámetro se usa para medir la integridad del RNA en una muestra?
¿Qué parámetro se usa para medir la integridad del RNA en una muestra?
Para llevar a cabo ciertos protocolos de investigación, ¿qué se requiere respecto al RIN de la muestra?
Para llevar a cabo ciertos protocolos de investigación, ¿qué se requiere respecto al RIN de la muestra?
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¿Cuál es el propósito principal de realizar análisis cuantitativos en muestras de RNA, como en microarrays o RNA-seq?
¿Cuál es el propósito principal de realizar análisis cuantitativos en muestras de RNA, como en microarrays o RNA-seq?
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En una electroforesis convencional, ¿qué se observa en el gel si se tiene una buena calidad del RNA?
En una electroforesis convencional, ¿qué se observa en el gel si se tiene una buena calidad del RNA?
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¿Qué técnica se puede utilizar para obtener un análisis más cuantitativo de la integridad del RNA?
¿Qué técnica se puede utilizar para obtener un análisis más cuantitativo de la integridad del RNA?
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¿Cuál es la razón A260/A280 que indica que el RNA está puro?
¿Cuál es la razón A260/A280 que indica que el RNA está puro?
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¿Qué método se utiliza para comprobar la degradación del RNA durante la extracción?
¿Qué método se utiliza para comprobar la degradación del RNA durante la extracción?
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¿Qué indica un valor A260/A230 menor de 1.7 en una muestra de RNA?
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¿Cuál de los siguientes es un aspecto importante a considerar al preparar muestras para evitar RNasas?
¿Cuál de los siguientes es un aspecto importante a considerar al preparar muestras para evitar RNasas?
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En una muestra de RNA, ¿qué porcentaje aproximadamente corresponde a los rRNAs 28S y 18S?
En una muestra de RNA, ¿qué porcentaje aproximadamente corresponde a los rRNAs 28S y 18S?
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¿Qué compuesto se incluye para inactivar y precipitar proteínas en la preparación de RNA?
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¿Cuál es el método más adecuado para la cuantificación de transcritos de RNA mensajero?
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En la hibridación de Northern blot, ¿qué tipo de RNA se analiza principalmente?
En la hibridación de Northern blot, ¿qué tipo de RNA se analiza principalmente?
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¿Qué medida se utiliza para verificar la integridad de los RNA ribosómicos durante una extracción?
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¿Cuál es el propósito principal de la técnica de Northern Blot?
¿Cuál es el propósito principal de la técnica de Northern Blot?
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¿Qué factor es más crítico para la integridad del RNA durante su extracción?
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¿Qué se busca caracterizar a través de la cuantificación de transcritos?
¿Qué se busca caracterizar a través de la cuantificación de transcritos?
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¿Cuál de las siguientes opciones describe mejor un proceso de hibridación en técnicas moleculares?
¿Cuál de las siguientes opciones describe mejor un proceso de hibridación en técnicas moleculares?
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En el proceso de extracción de RNA, ¿qué papel juega el cloruro de litio (LiCl)?
En el proceso de extracción de RNA, ¿qué papel juega el cloruro de litio (LiCl)?
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¿Cuál es una de las precauciones más importantes a seguir durante la extracción de RNA?
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En el contexto de la tasa de transcripción, la variación está relacionada principalmente con:
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¿Qué se determina principalmente mediante técnicas de Dot/Slot Blot?
¿Qué se determina principalmente mediante técnicas de Dot/Slot Blot?
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El uso de detergentes no iónicos en la extracción de RNA se relaciona con:
El uso de detergentes no iónicos en la extracción de RNA se relaciona con:
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Study Notes
Ingeniería Genética - TEMA 10: Técnicas de estudio de la expresión génica
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La expresión génica diferencial es fundamental para la diferenciación celular, el desarrollo y el funcionamiento de los organismos.
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Los cambios en la expresión génica, en gran medida, modifican la tasa de transcripción, afectando los niveles de transcritos.
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La estabilidad de los mRNAs también influye en los niveles de transcritos.
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Existen diversas técnicas para cuantificar y caracterizar los transcritos producidos en momentos y/o condiciones específicas.
Obtención del material de partida
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El aislamiento de RNA implica lisis celular y extracción orgánica con detergentes no iónicos o basados en guanidinio, utilizando fenol/cloroformo.
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El fenol se tampona a un pH ácido para purificar el RNA.
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La precipitación con cloruro de litio (LiCl) es posterior a la extracción.
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Es crucial la inactivación de ribonucleasas (RNasas) durante todo el proceso.
Evaluación de la integridad del RNA
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La razón A260/A280 para RNA puro oscila entre 1.8 y 2.0.
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Una razón inferior a 1.7 indica contaminación proteica.
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La razón A260/A230 para RNA purificado está entre 1.8 y 2.0.
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Un valor inferior a 1.7 indica contaminación por guanidinio o fenol.
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El gel de RNA se utiliza para evaluar la degradación de la muestra.
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En la electroforesis, los rRNAs (28S y 18S) deben aparecer como dos bandas distintivas.
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La relación 28S/18S debe ser aproximadamente 2:1.
Métodos tradicionales para el análisis individual de la expresión génica
Dot/Slot-Blot
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Es una técnica sencilla para analizar múltiples muestras simultáneamente.
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No separa los RNAs por tamaño.
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No proporciona información sobre la integridad del RNA.
Northern Blot
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Permite detectar y cuantificar transcritos, determinando su tamaño y procesamiento.
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Muestra bandas diferenciales para RNAs totales y mRNAs aislados, mejorando la sensibilidad de detección.
Normalización frente a RNAs ribosómicos
- El rRNA 18S es comúnmente utilizado como referencia interna para la cuantificación.
RPA (RNAse protection assay)
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Es una técnica sensible para cuantificar transcritos específicos en disolución.
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Se basa en la hibridación de una sonda específica seguida de la degradación de RNAs no hibridados.
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La cantidad de sonda que resiste a la RNasa es proporcional a la cantidad de mRNA de interés.
PCR a tiempo real (RT-qPCR)
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Es una técnica cuantitativa que mide la fluorescencia para determinar la cantidad de producto amplificado.
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El momento de medir la fluorescencia depende del tipo de sonda utilizada.
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Las sondas intercalantes, como SYBR Green™, se unen al dsDNA, midiendo la fluorescencia al final de cada ciclo.
Sondas fluorescentes
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La sonda fluorescente SYBR Green™ se intercala entre las bases del dsDNA.
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En la qPCR, la medición de la fluorescencia se realiza al final de cada ciclo para cuantificar el producto amplificado.
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OTRAS Sondas: existen otras sondas que permiten la detección de transcritos específicos.
Métodos genómicos para análisis de conjuntos de genes o genomas
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Microarrays: Emplea sondas para cada gen en un chip de vidrio para analizar la expresión de todos los genes al mismo tiempo.
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RNA-Seq: Un método más actual, secuenciando todo el transcriptoma de la célula.
Construcción de genotecas para RNA-seq
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Se generan bibliotecas de fragmentos de cDNA a partir de mRNAs.
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Se añaden adaptadores de secuenciación a los transcritos retrotranscritos.
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Se utilizan cebadores hexaméricos aleatorios para cubrir todos los fragmentos de RNA durante el proceso.
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Se utilizan protocolos que permiten obtener cDNAs etiquetados con adaptadores 5' y 3' para la secuenciación.
Cuantificación de transcritos
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Se utilizan las lecturas posicionadas en los exones para cuantificar los transcritos.
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Los datos obtenidos se normalizan con respecto a la longitud del gen y el número total de lecturas para representar una cuantificación relativa.
Single Cell RNA Sequencing (SCG)
- Se aplica el RNA-Seq para analizar la expresión génica en una única célula, mostrando diferencias en la expresión génica entre células similares.
Separación física de células individuales
- Métodos como la citometría de flujo (FACS) y los basados en microfluidos se utilizan para separar células individuales.
Obtención de la genoteca CEL-seq
- Se obtiene una librería de fragmentos de cDNA con extremos conocidos para su posterior secuenciación.
Técnica Run-on
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Permite medir la velocidad de síntesis de nuevos transcritos en la célula.
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Los núcleos son aislados y se utilizan ribonucleótidos marcados para registrar la transcripción contínua.
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El número de moléculas marcadas es proporcional a la velocidad de transcripción.
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Description
Este cuestionario se centra en los aspectos fundamentales del análisis de la calidad del RNA, incluyendo la interpretación de electroforesis y métricas de integridad como RIN. También se exploran técnicas y parámetros críticos que aseguran la pureza y viabilidad del RNA en muestras biológicas. Perfecto para estudiantes y profesionales en biología molecular y genética.
