Tema 1 Enzimología básica utilizada en la manipulación del DNA PDF

Tema 1. Enzimología básica utilizada en la manipulación del DNA Nucleasas con corte específico de secuencia Endonucleasas de restricción Sistemas de modificación restricción Características de corte Tip...

Tema 1. Enzimología básica utilizada en la manipulación del DNA Nucleasas con corte específico de secuencia Endonucleasas de restricción Sistemas de modificación restricción Características de corte Tipos: Endonucleasas tipo IIP Características Secuencias de reconocimiento Tipos de extremos generados por el corte Enzimas compatibles Isoesquizómeros y actividad estrella Mapas de restricción Endonucleasas tipo IIS Características y utilidades Nucleasas con corte inespecífico de secuencia DNasa I Exonucleasa III y Exonucleasa del fago lambda RNasas inespecíficas: RNasa A RNasa H Nucleasas (DNA y RNA). Endonuclasas S1: mapeo de sitios de inicio de transcripción  Tema 1. Enzimología básica utilizada en la manipulación del DNA Polimerasas DNA polimerasas DNA polimerasas DNA dependientes La pol I y el fragmento Klenow de Escherichia coli Polimerasas de fagos Polimerasas termoestables DNA polimerasas RNA dependientes DNA polimerasas DNA y RNA dependientes Terminal Deoxinucleotidil Transferase (TdT) Polinucleótido fosforilasa RNA polimerasas Otras enzimas DNA ligasa Fosfatasa alcalina Polinucleótido quinasa  Tema 1. Enzimología básica utilizada en la manipulación del DNA La información se puede encontrar en el Tema 2 de Técnicas en Ingeniería Genética, pp. 39-61  Tema 3. Enzimología básica utilizada en la manipulación del DNA Fragmento de DNA genómico, cDNA, producto de PCR DNA recombinante ¿Qué enzimas estarán, sí o sí, en nuestra caja de reactivos de Biología Molecular?  Enzimas de restricción En 1953 se descubre el fenómeno de la restricción: Ciertos fagos no son capaces de infectar determinadas cepas de bacterias. En los años 70 se descubren los enzimas responsables de ese fenómeno: se denominan endonucleasas de restricción. Por ejemplo, Cromosoma propio Bacteriófago λ Metilaciones reconocidas: N4 o C5 en citosina N6 en adenina  Enzimas de restricción En 1970 se purifica la primera enzima de restricción útil para clonación; HindII de Haemophilus influenza. Nathans Smith Arber Premio Nobel en 1978, por su investigación sobre los enzimas de restricción.  Enzimas de restricción: importancia en clonación ¿Por qué son tan importantes las endonucleasas de restricción para la manipulación del DNA?  Enzimas de restricción Reconocimiento de secuencia y rotura de enlaces fosfodiéster tipo α (5’-P, 3’-OH). Cortan las DOS cadenas de un DNA duplex α β Enzimas de restricción. Tipos  Enzimas de restricción tipo II Las más utilizados son las del tipo IIP Además: Tipo IIS  Enzimas de restricción. Nomenclatura Tres letras en cursiva: designan género y especie Eco (Escherichia coli) Una letra designa la cepa: R (cepa R) El número de orden del enzima de restricción aislado de la cepa (nº romanos) Nucleasa EcoRI Metilasa M-EcoR I (ya que en este caso hay que distinguir entre actividades de restricción y metilación)  Enzimas de restricción Tipo IIP Son las más utilizadas en Ingeniería Genética La mayor parte son homodímeros o homotetrámeros Cortan dentro de la secuencia reconocida No requieren ATP ni GTP Requieren Mg2+ como cofactor Reconocen secuencias palindrómicas de entre 4 y 8 pb Algunos reconocen palíndromes discontinuos interrumpidos por un segmento de longitud definida, pero de secuencia no definida. Cortan en posiciones simétricas Enzimas de restricción. Tipos de corte Romos Cohesivos 5’ o 3’ Protuberantes Enzimas de restricción. Tipos de corte Enzimas de restricción. Tipos de corte Enzimas de restricción. Tipos de corte 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ Enzimas de restricción. Tipos de corte 5’ 3’ OH P 3’ 5’ 3’ P 5’ 5’ OH 3’  Enzimas de restricción. Tipos de corte Los extremos cohesivos permiten la asociación de dos fragmentos por la complementaridad de bases entre los extremos protuberantes.  Enzimas de restricción: extremos compatibles cohesivos Cuando dos enzimas reconocen secuencias diferentes, pero producen los mismos extremos protuberantes se denominan “compatibles”. Difieren en los nucleótidos de los extremos del sitio de reconocimiento. Una vez ligados pueden regenerar o no alguno de los sitios e incluso dar lugar a un nuevo sitio reconocido por un enzima diferente Extremos compatibles A CTAGT TGATC A T CTAGA AGATC T T CTAGT AGATC A Al ligar los dos extremos se obtiene una secuencia que no es reconocida por ninguna de las dos enzimas  Enzimas de restricción: extremos compatibles Un caso a tener en cuenta es la unión de sitios Sau3AI en sitios BamHI  Enzimas de restricción: definiciones Isoesquizómeros: enzimas que reconocen la misma secuencia. No siempre cortan igual. “Actividad estrella”: Para el corte basta la presencia del núcleo central de la secuencia que se reconoce normalmente. Tiene lugar en condiciones “subóptimas”. EcoRI G/AATTC Actividad estrella: N/AATTN  Enzimas de restricción: conceptos Unidad de actividad enzimática: definida como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de DNA de fago λ en una hora, en 50 µl de reacción y a una temperatura determinada. Probabilidad de corte: aunque no es estrictamente exacto (habría que tener en cuenta las relaciones AT/GC de la secuencia de reconocimiento y del genoma del organismo) podemos aproximarla a (Ɖ)n siendo n la longitud de la secuencia de reconocimiento Probabilidad si es un sitio de reconocimiento de 4 pb 1/44 = (1/256) Probabilidad si es un sitio de reconocimiento de 6 pb 1/46 = (1/4096) Probabilidad si es un sitio de reconocimiento de 8 pb 1/48 = (1/65536) La distancia media entre sitios reconocidos por una ER es = 4n, siendo n el nº de bases en el sitio (informa del tamaño de los fragmentos que obtendremos) Enzimas de restricción: conceptos  Enzimas de restricción: frecuencia de corte Prescindiendo de la naturaleza y porcentaje AT del DNA del organismo: Probabilidad si es un sitio de reconocimiento de 4 pb: 1 cada 256 pb Probabilidad si es un sitio de reconocimiento de 6 pb: 1 cada 4.096 pb Probabilidad si es un sitio de reconocimiento de 8 pb: 1 cada 65.536 pb Plásmidos: tamaño entre 3 y 10 kb Es poco probable que tengan sitios de corte para enzimas que reconocen secuencias de 8 pb Es posible que contengan 1 o ningún punto de corte para enzimas que reconocen 6 pb. Es prácticamente imposible que haya sitios de restricción únicos para enzimas que reconocen 4 pb Enzimas de restricción: mapa de restricción  Enzimas de restricción: mapas de restricción Mapa de restricción: orden lineal de los sitios de restricción sobre un segmento específico de DNA. Enzimas de restricción: mapas de restricción Primer paso Enzimas de restricción: mapas de restricción Segundo paso  Enzimas de restricción tipo IIS Las más utilizados son las del tipo IIP Además: Tipo IIS  Enzimas de restricción. Tipo IIS Secuencia de reconocimiento: no palindrómica, sin ambigüedad. Sitio de corte: corta a una distancia fija fuera de la secuencia reconocida, suele generar extremos protuberantes. Ejemplo: BsmBI: CGTCTCN GCAGAGNNNNN Ejemplos: Fok I, Alw26 I, Bbv I, Bsr I, Ear I, Hph I, Mbo II, SfaN I, Tth111 I, BsaI, BsmBI  Enzimas de restricción. Tipo IIS Interacciona con los sitios de reconocimiento antes de cortar el DNA Son homodímeros, cada uno compuesto por dos dominios diferenciados que corresponden con regiones diferentes dentro de la estructura primaria de la proteína Un dominio es responsable del corte y otro del reconocimiento. El dominio de corte se ha usado para la construcción de nucleasas quiméricas, fusionándolo a dominios de unión al DNA de diferente naturaleza Ejemplo: Fok I proporciona el dominio de corte y se combina con un dominio de dedos de zinc que proporcionan el reconocimiento de secuencia  Enzimas de restricción. Tipo IIS Estructura cristalina de uno de los monómeros de FokI unida al DNA. Se muestran las posiciones de corte situadas a 9 y 13 nucleótidos downstream del sitio de reconocimiento El dominio N-terminal (reconocimiento) está en azul. El dominio C-terminal (catalítico) en rojo. El conector que conecta los dominios en verde.  Enzimas de restricción. Tipo IIS Además, en el gen que codifica la FokI-ND enzima hay un sitio de restricción DNA binding domain único (BssHII) que nos escinde el gen en dos partes. Cada fragmento codifica uno de los dominios. Nucleas quimérica Podemos purificar el fragmento y pegarlo a un fragmento que codifique un dominio de unión al DNA para obtener nucleasas BssHII quiméricas DNasas inespecíficas (endonucleasas y exonucleasas) Las endonucleasas se supone que cortan aleatoriamente, sin que haya reconocimiento de secuencia. La más utilizada es la DNasaI. De origen humano. Sitios hipersensibles a la DNasaI Sitios hipersensibles a la DNasaI Footprint con DNasaI  Ensayos de protección a la DNasa I -Las muestras en las carreras 2-4 tienen cantidades crecientes de la proteína que se une al DNA (lambda protein cII) - La carrera 1 no tiene proteína. Huella (Footprint)  Exonucleasa del fago lambda /Exonucleasa III Exonucleasa III Exonucleasa del fago lambda Elimina nucleótidos desde el extremo 3’ Elimina nucleótidos desde el extremo 5’ Digiere a partir de extremos 5’ fosforilados de doble cadena Requieren que el extremo a partir del que va a digerir esté apareado  RNasas inespecíficas RNasa A: Eliminación RNA en preparaciones DNA RNasa H: Eliminación mRNA tras la síntesis de la primera cadena en la obtención de cDNAs de doble cadena Endoucleasas (digieren DNA y RNA): Nucleasa S1  Nucleasa S1 Es una endonucleasa que corta en regiones de cadena sencilla de DNAs y RNAs Se utiliza, por ejemplo, para mapear orígenes de transcripción (Transcription Start Sites) TSS No se utiliza para hacer fragmentos romos en experimentos de clonación Nucleasa S1:determinación TSS Nucleasa S1:determinación TSS ATG coding TAA Nucleasa S1:determinación TSS ATG coding TAA  Nucleasa S1:determinación TSS En algunos genes se detectan varios TSS Inicio de la sonda La posición del primer sitio nos la indica el tamaño del fragmento que resulta de la digestión Polimerasas Polimerasas DNA-polimerasas  DNA-polimerasas dirigidas por DNA - E. coli DNA polimerasa I (y fragmento Klenow) - T4/T7 DNA polimerasa - DNA polimerasas termoestables (Taq, Pfu, Vent…) - Terminal transferasa dirigidas por RNA -Transcriptasa inversa de retrovirus  DNA-polimerasas Fragmento Klenow (derivado de la DNA pol I) Carece de actividad exo 5’>3’ DNA-polimerasas  DNA-polimerasas El fragmento Klenow (y la DNA pol I , aunque menos) también se puede utilizar para convertir fragmento 5’ protuberantes en romos DNA-polimerasas de fagos: T7 y T4  DNA-polimerasas de fagos: T7 y T4 T4 polimerasa Es capaz, con su actividad polimerasa de rellenar extremos 5’ protuberantes Tiene una actividad exo 3’>5’ muy potente (comparada con la pol I) En presencia de dNTPs convierte extremos 3’ protuberantes en romos DNA-polimerasas termoestables DNA-polimerasas termoestables  DNA-polimerasas termoestables Actividad exo 5’>3’ requerida para PCR a tiempo real con sondas Taqman  Transcriptasa inversa (o reversa) Codificadas por retrovirus: AMV (Avian myeloblastosis virus) MMLV (Moloney murine leukemia virus)  Terminal transferasa (TdT) La desoxinucleotidil terminal transferasa (TdT) pertenece a la familia X de DNA polimerasas. En la célula cataliza la adición de nucleótidos aleatorios sin necesitar molde en extremos 3’ protuberantes durante la recombinación V (D) J.  Terminal transferasa (TdT) Añade colas de nucleótidos al extremo 3’ OH de un DNA duplex (o heteroduplex DNA:RNA), siempre que sea romo o 3’ protuberante. Es decir, polimeriza sin copiar un molde. Si se utilizan los cuatro dNTPs se producen múltiples incorporaciones y los productos resultantes son de naturaleza polidispersa. Si añadimos solo uno de los cuatro obtendremos una cola homopolimérica  Terminal transferasa (TdT) Se está empezando a utilizar para la síntesis de oligonucleótidos con una secuencia definida (por ejemplo, para ser utilizados como cebadores en reacciones de PCR). Para ello, los nucleótidos se tienen que ir incorporando de uno en uno. Esto se puede lograr utilizando análogos de nucleósidos trifosfato que incluyen un grupo bloqueador 3’-OH que se puede eliminar químicamente. Así, el alargamiento finaliza después de la incorporación de un solo nucleótido. Después de la eliminación del exceso de nucleótido y de la TdT, el grupo terminador se puede desproteger para recuperar el 3'-hidroxilo y empezar un nuevo ciclo.  RNA polimerasas Se utilizan, fundamentalmente, para la transcripción in vitro. Se utilizan las RNA polimerasas de fagos como T7, T3 y SP6. Reconocen promotores muy sencillos que se pueden introducir fácilmente en un vector de clonación o en un producto de PCR  RNA polimerasas para transcripción in vitro Muchos plásmidos incluyen en su Multicloning Site (MCS) promotores reconocidos por estas polimerasas  Polinucleótido fosforilasa (PNPasa) La PNPasa cataliza la degradación fosforolítica procesiva 3’-5’ del RNA, liberando nucleósidos difosfato en presencia de altas concentraciones de fosfato inorgánico. Para poder unirse a un sustrato de RNA, la molécula de RNA debe tener un extremo monocatenario en 3' de entre 7 a 10 nucleótidos Sin embargo, a bajas concentraciones de fosfato inorgánico, la PNPasa cataliza la polimerización de ssRNA a partir de dNDP de una manera independiente de la cadena molde La PNPasa afecta la estabilidad de transcritos estables (mRNA, tRNA y rRNA). Además, PNPasa parece ser particularmente relevante para el control de la estabilidad de los RNAs no codificantes. Ligasas  DNA ligasas DNA LIGASA La ligasa del bacteriofágo T4 (la más habitual) requiere ATP y Mg2+. La ligasa de E. coli requiere NAD+. En todos los casos se requiere que fragmento que aporta el extremo 5’ a la unión tenga dicho extremo fosforilado ¿Es la DNA ligasa capaz de unir los extremos generados por enzimas de restricción sin ningún tratamiento adicional?  DNA ligasas DNA LIGASA  DNA ligasas DNA LIGASA  RNA ligasas Se utilizan, por ejemplo, en las técnicas de RNA-seq para añadir adaptadores en moléculas o fragmentos de RNA para su posterior secuenciación Diferentes protocolos para RNA-seq de célula única Modificadores de ácidos nucleicos  Fosfatasa alcalina FOSFATASA ALCALINA  Fosfatasa alcalina/DNA ligasa Si el extremo 5’ no está fosforilado, no hay unión. Veremos que esto se utiliza para evitar la re-circularización de plásmidos en la clonación de fragmentos (Tema 6 Estrategias de clonación) Polinucleotido quinasa Polinucleotido quinasa DNA-polimerasas