Techniques Histologiques PDF

Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique  Introduction Toute activité histologique a en commun l'action d’observer et d'interpréter ce qui est vu. Dans toute démarche d'ordre histologique, 4 étapes se succèdent: le choix...

Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique  Introduction Toute activité histologique a en commun l'action d’observer et d'interpréter ce qui est vu. Dans toute démarche d'ordre histologique, 4 étapes se succèdent: le choix du matériel à étudier, la technique permettant de visualiser les structures que l'on veut étudier, la production d'images de ces structures, par des moyens optiques et l'interprétation de ces images. Principes généraux 1/ Prélèvement, 2/ Fixation, 3/ Déshydratation (Alcool et Toluène), 4/ Inclusion (paraffine, résine), 5/ Coupe (microtome), 6/ Colorations, 7/ Observation (microscope). 1/ Prélèvement Le matériel est prélevé de différentes façons :  Biopsie (directe comme pour la peau, le muscle ou avec endoscopie pour les organes des appareils respiratoire, digestif, urinaire).  Ponction à l’aiguille (comme pour le liquide pleural, péritonéal, articulaire, pour les ganglions, les seins, la moelle osseuse). Le matériel histologique peut aussi provenir :  D’une pièce opératoire  D’une autopsie  Ou de la dissection d’organe en expérimentation animale. Biopsie C’est un prélèvement, d'un échantillon de tissus de l'organisme, effectué afin de procéder à un examen, microscopique le plus souvent ou parfois, biochimique , immunologique , génétique ou bien bactériologique. Lorsqu’une biopsie est obtenue à l’aide d’une aiguille, l’échantillonnage dépend de la conception de l'aiguille et de l'énergie de son insertion dans le tissu. L'aiguille utilisée est un tube creux avec une pointe capable de perforer les tissus. Comme l'aiguille s’enfonce dans le tissu, ce dernier va s’accumuler dans le tube creux. Lorsque l'aiguille est retirée du tissu, l’échantillon reste dans le tube et l'aiguille peut être récupérée pour l’analyse. Biopsie cutanée  Conservation Afin de conserver l'échantillon dans un état le plus proche possible de l'état in vivo, deux moyens de conservation peuvent être utilisés : – La congélation , utilisée pour les prélèvements dont le diagnostic doit être connu rapidement ; – La fixation par un produit chimique comme le formol ou le bouin, qui a pour effet de polymériser les protéines présentes dans l'organe.  Les Frottis Les frottis qui peuvent être analyses au MO sont :  Frottis sanguin ou de moelle osseuse pour le diagnostic de nombreuses maladie (Anémies, Leucémie, etc.)  Les frottis vaginaux sont utilisés pour : - Dépistage de cancers - Infections OBSERVATION DE CELLULES VIVANTES Des cellules vivantes peuvent être observées entre lame et lamelle afin d’évaluer leurs fonctions (par exemple, mobilité des spermatozoïdes).  LES ETAPES DE LA TECHNIQUE HISTOLOGIQUE EN MICROSCOPIE OPTIQUE Le plus souvent, le matériel histologique (= cellules contenues dans un tissu) est fixé, inclus, coupé et coloré afin de pouvoir l’observer au microscope. Fixation  Immédiatement après le prélèvement  Par immersion du matériel dans un grand volume de liquide fixateur.  Les liquides fixateurs les plus utilisés sont le formol ou le liquide de Bouin (mélange de formol et d'acide picrique).  La durée de la fixation varie selon le volume des prélèvements: - quelques heures pour un petit fragment biopsique - plusieurs semaines pour un cerveau humain entier. Il n’y a pas de fixateur idéal  Il faut le choisir en fonction de ses avantages et inconvénients.  Parmi des centaines disponibles : Les fixateurs contenant du formol (1) – AFA (Acide acétique Formol Alcool)  très rapide (risques de surfixation),  permet les marquages immunohistologiques.  peu pénétrant. MAIS idéal pour les biopsies  Les fixateurs contenant du formol (2) – Bouin (Acide acétique Formol Acide picrique) rapide, pénétrant, légères rétractions tissulaires, inconvénient très belles colorations topographiques, MAIS ne permet que difficilement l’immunohistologie, coloré : tache ! Idéal pour voir des ganglions lymphatiques dans le tissu adipeux Quel que soit le fixateur, le prélèvement doit être échantillonné et la taille des échantillons adaptée à celle de la cassette d’inclusion. 3/ Déshydratation L’eau tissulaire est remplacée par de la paraffine. Mais ces milieux ne sont pas miscibles entre eux. On procède donc par étapes en remplaçant : A retenir l'alcool n'est pas miscible avec la l’eau par un alcool (70 °,95 °,100 °) paraffine l’alcool par un solvant organique ( Toluène), permet d'enlever toute trace d'alcool qui reste colé à l'echantillon Toluène par la paraffine Élimination de l’eau permettant ensuite l’inclusion dans la paraffine 4/ INCLUSION Le prélèvement est imprégné de paraffine fondue afin de le rigidifier pour pouvoir le couper ensuite. On coule la paraffine fondue contenant le prélèvement dans un moule constitué de 2 barres. A température ambiante, la paraffine se solidifie Amincissement On distingue plusieurs types de coupe selon la méthode de conservation et d'amincissement : 5/ Les coupes histologiques (MO) 2 à 5 µm d’épaisseur, quelques centimètres de largeur et longueur, nombreuses colorations possibles, montées entre lame et lamelle, grandissement de 10 à 1000 fois (environ). 5/LES COUPES Microtome Les coupes du bloc de paraffine réalisées avec un microtome permettant d’obtenir des tranches de section ( coupes histologiques) de 2 à 5 µm d’épaisseur. Les coupes sont recueillies sur des lames de verre. Réalisation de coupes fines ( 2 à 5 µ m) car les préparations sont traversées par les photons. ULTRAMICROTOME Un ultramicrotome est un appareil de très grande précision qui permet des coupes de 60 à 100 nm servant en microscopie électronique. TECHNIQUE HISTOLOGIQUE EN MICROSCOPIE OPTIQUE - La plupart des tissus sont transparents - Les colorations réalisées sur lames, accentuent les contrastes pour pouvoir reconnaître les différents éléments du tissu. Déparaffinage Étape assurant la réhydratation de la coupe afin de la colorer toluène , alcool 100 °, 95 °, 70 °, eau 6/ Les colorations Réalisées sur lames, accentuent les contrastes pour mieux reconnaître les différents éléments de la préparation. Les colorants sont en solution aqueuse. Les coupes doivent d'abord subir une réhydratation. Après déparaffinage des coupes (par la chaleur et des bains de toluène) en immergeant les lames dans des bains d'alcool de degré décroissant (100 °, 95°,70 °) puis dans l'eau distillée  Afin de distinguer les différents tissus, on peut avoir recours à différents colorants : – Colorants acides – Colorants basiques Les substances acides de la cellule sont colorées par un colorant basique, les substances basiques de la cellule par un colorant acide. Exemple : l'Hématéine-Éosine Permet une coloration violet du noyau et rose du cytoplasme L'éosine est un colorant acide L'hématéine est un colorant basique Colore les acides nucléiques en Colore en rouge plus ou moins bleu noir intense le cytoplasme La colorations Assure la fixation permanente du colorant sur des groupements acides ou basiques des constituants cellulaires (à un pH donné)  Les colorations de routine utilisent un (hématéine) ou deux colorants différents : l'Hématéine -Eosine (H.E.) associe: - l'hématéine qui colore les noyaux en violet. - l'éosine les cytoplasmes en rose. Étalement et collage des coupes sur la lame Les lames gravées et garnies de ruban de paraffine sont disposées sur une platine chauffante.  7/ LE MONTAGE ET OBSERVATION Les coupes colorées sont montées entre lame et lamelle avec une résine synthétique dont l’indice de réfraction est voisin de celui du verre On dispose alors d’une« préparation microscopique » (appelée « lame ») prête à être observée au microscope optique (MO).  Immunocytochimie Il s’agit d’une technique permettant, en microscopie photonique et électronique, la détection dans la cellule (culture de cellules ou coupes de tissus fixés), de protéines dites antigéniques (Ag), à l’aide d'anticorps (Ac) Remarque : Les complexes Ac - Ag ne sont pas visibles directement au microsc ope; on les rend décelables en accrochant un marqueur à l'Ac. Les marqueurs sont des molécules repérables au microscope, exemples : fluorochrome (M. à fluorescence), enzyme (MP, MET), isotope radioactif (MP, MET), or colloïdal (MET) , ferritine (MET). Structure d'un anticorps IgG Un Ac (IgG) comporte 4 chaînes polypeptidiques, (2 chaînes lourdes, 2 chaînes légères) et 2 sites de liaison à l’antigène, et de nombreux sites caractéristiques de l’espèce qui a produit l’Ac. La grande spécificité de reconnaissance des 2 molécules Ac- Ag permet de mettre en évidence une molécule particulière (l’Ag) parmi des milliers d'autres molécules dans la cellule.  pour détecter Méthode de l'antigène détection Immunoréaction simple et rapide Localisation précise La méthode de détection peut être directe ou Sensibilité -- indirecte. La méthode est dite directe si le marqueur est fixé directement sur l'Ac. utilisé pour détecter l’Ag. Elle consiste donc à faire agir sur les coupes de cellules fixées un Ac. spécifique de la molécule recherchée, lié à un marqueur.  Méthode indirecte: utilisation d'un ligand Sensibilité++ La méthode est dite indirecte quand l'Ac. primaire qui se lie à l’Ag n'est pas marqué, mais est détecté par un ETAPES autre Ac. (Ac. secondaire) auquel on Traceur a lié un marqueur. Cette méthode consiste donc à utiliser successivement 2 anticorps (incubation dans l’anticorps primaire Anticorps secondaire 2 puis dans l’anticorps secondaire). L'anticorps secondaire est un Ac anti - espèce : il est dirigé contre tous les Anticorps primaire 1 Ac. de l'espèce ayant servi à fournir l'Ac primaire. L'intérêt de cette Antigène méthode est de permettre l’amplification du marquage. En effet une seule molécule d'Ac primaire est Echantillon reconnue par de nombreuses molécules d'Ac secondaire marquées. Préparation des anticorps pour l’immunocytochimie Fluorescéine, Rhodamine, Particules d’or colloïdal 4. immunocytochimie par la méthode indirecte Exemples Photographie d’une immunofluorescence réalisée sur une cellule Hela, traitée par un anticorps anti -tubuline (filaments verts), et par le colorant nucléaire DAPI (bleu). Visualisation et évaluation de constituants cellulaires spécifiques à l’aide d’anticorps par les techniques d’immunofluorescence et d’immunohistochimie. Conclusion générale : Il existe un grand nombre de techniques de préparation des tissus et de méthodes d'examen. Toutes ces méthodes permettent de visualiser l'ensemble des cellules d'un tissu de la même manière. Il est possible de faire apparaître la morphologie des cellules par coloration, leurs caractéristiques fonctionnelles par traitement histochimique, immunologique ou moléculaire, et leur ultrastructure par microscopie électronique, tout cela à partir d'un seul échantillon. C'est pour cette raison que la plupart des laboratoires d'histologie conservent les blocs et les préparations de lames pendant de longues périodes.