Innovative Techniques in Assisted Reproductive Technology (AMP) - A Presentation

UE optionnelle Physiopathologie de la reproduction Recherche et développement des techniques d’Assistance Médicale à la Procréation (AMP) Dr. L. CHAPUT AMP-CECOS (Pr. F. Brugnon) CHU Clermont-Ferrand [email protected] 1 PLAN 1. AMP 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Rappel...

UE optionnelle Physiopathologie de la reproduction Recherche et développement des techniques d’Assistance Médicale à la Procréation (AMP) Dr. L. CHAPUT AMP-CECOS (Pr. F. Brugnon) CHU Clermont-Ferrand [email protected] 1 PLAN 1. AMP 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Rappel de la folliculogenèse Stimulation ovarienne Les techniques d’AMP Insémination intra-utérine : technique FIV / ICSI : ponction ovarienne Les différentes étapes de l’AMP Fécondation in vitro classique ICSI : préparation des ovocytes ICSI : micro injection des ovocytes Culture embryonnaire Lecture des embryons Transfert de l’embryon Time-lapse et Améliorer la sélection et la culture de l’embryon 2. La congélation 1. Congélation lente 2. Vitrification 3. Automate de vitrification 4. Congélation des ovocytes 3. Améliorer le taux d’implantation de l’embryon 1. Laser embryonnaire 2. DPI-A Rappel : folliculogénèse Stimulation ovarienne 1. Stimulation de l’ovulation Blocage Agoniste / Antagoniste de la GnRH Décapeptyl  /Cétrotide  Stimulation Déclenchement ovulation HcG FSH + LH Gonadotrophine Chorionique / Gonal F , Ovitrelle  Puregon ,Menopur  4 Les techniques d’AMP - Stimulation ovarienne - Préparation du sperme (TMS) Toutes les techniques Préparation du sperme par migration (sélection spermatozoïdes mobiles) et induire la capacitation → spermatozoïdes fécondants. 1. Ponction des ovocytes 2. Fécondation 3. Culture 4. Transfert d’embryon 5. Vitrification embryonnaire Fécondation in vitro - Classique - Avec micro injection (ICSI) Insémination intra-utérine : technique C’est la technique d’AMP la plus simple et la plus ancienne. 1) Stimulation préalable afin d’obtenir le développement d’un ou deux follicules 2) Suivi du développement folliculaire par échographie et dosages hormonaux 3) Lorsque le ou les follicules sont matures, l’insémination est programmée 4) Utilisation d’un fin cathéter avec dépôt des spermatozoïdes à l’intérieur de l’utérus : les spermatozoïdes mobiles remontent naturellement vers les trompes à la rencontre de l’ovocyte. FIV ou ICSI : ponction ovocytaire Sous anesthésie locale (parfois générale) la ponction est écho guidée Aspiration du liquide folliculaire dans lequel sont les ovocytes Puis au laboratoire screening du nombre des ovocytes entourés du cumulus oophorus sous microscope Conditions strictes de travail : ▪ Milieux de culture ▪ Température (37°C) ▪ pH ▪ Sortie incubateur durée la + courte possible 7 FIV ou ICSI : ponction ovocytaire 8 Les différentes étapes de l’AMP J0 Recueil de sperme IIU Ponction Ovocytaire Décoronisation des ovocytes ICSI Culture embryonnaire Lecture zygote Lecture embryonnaire Transfert Mise en fécondation ou FIV (Fécondation in vitro) J5 J2/J3 J1 ou Transfert ou Vitrification + Transfert Transfert à J2 ou J5 Fécondation in vitro classique Après préparation des spermatozoïdes (migration), des milliers de spermatozoïdes mobiles sont mis en contact avec les ovocytes ponctionnés Les spermatozoïdes sont simplement déposés au contact de chaque ovocyte dans une boîte de culture contenant un milieu liquide nutritif et placée dans un incubateur à 37°C. 10 ICSI : préparation des ovocytes Décoronisation des ovocytes Hyaluronidase Pipettages répétés Corona radiata Cumulus oophorus Acide hyaluronique Seuls les ovocytes matures seront injectés ovocyte mature = ayant expulsé son premier globule polaire → Il existe des techniques de maturation in vitro des ovocytes immatures 11 ICSI : micro injection des ovocytes Puis injection de chaque ovocyte ponctionné et mature à l’aide de 2 pipettes 12 Culture embryonnaire Culture à 37°C à l’abri de la lumière dans des boîtes de culture contenant du milieu nutritif. Durée de culture : 5 à 6 jours Lecture embryonnaire 13 Culture embryonnaire J1 zygote : 16-18h post fécondation J1 : 2 cellules J2 : 4 cellules J2 : 4 cellules avec fragmentation  J3 : 8 cellules et + J5 : blastocyste J5 : blastocyste atrétique  14 Transfert de l’embryon Au sein du centre d’AMP du CHU de Clermont-Ferrand • 1ère tentative : 1 embryon +++ (Single Embryo Transfer : SET) – Au 5ème jour de culture (blastocyste) – Meilleure sélection de l’embryon – Condition proche de la physiologie (J5 embryon dans cavité utérine et J2 dans les trompes) • A partir de la 2ème tentative – Fonction du nombre d’embryons à J2 TOP qualité (4 cellules et <30% de fragmentation) • • culture J5 transfert J2/J3 Time-lapse Avantages de la technique: - Embryons restent en conditions optimales de culture - Observation de la cinétique - Observation des éléments anormaux de développement (anomalies fécondation, multinucléation) Transfert d’un seul embryon (SET)++  Meilleure sélection embryon viable 16 Nouvelle technologie Time Lapse Geri®, MERCK 17 Nouvelle technologie Environnement de culture optimal influencé par plusieurs variables critiques : température, gaz, lumière et humidité. Toute modification peut avoir un impact considérable sur l'efficacité du milieu de culture et le développement embryonnaire. Conditions d’incubation optimales et culture sans perturbation - minimiser le stress environnemental pouvant impacter le développement des embryons (fluctuations générées par les ouvertures des portes). 18 Nouvelle technologie Vidéo : étude cinétique embryonnaire, anomalies de développement embryonnaire 19 Nouvelle technologie J1: visualisation de la fécondation J2: embryon clivé 4 cellules J3: embryon clivé 8 cellules J4: embryon en compaction J5/J6: blastocyste 21 Morphologie vs. algorithme time-lapse pour taux de naissances vivantes 22 Congélation des embryons Congélation par vitrification +++ - des embryons surnuméraires = Nombre d’embryons obtenus supérieur au nombre d’embryons transférés. → Optimisation chances de grossesse si échec transfert embryon frais → Poursuite projet parental - de tous les embryons sans transfert d’un embryon « en frais » suite à la ponction = FREEZE ALL Raisons médicales : • Risque d’hyperstimulation ovarienne (HSO) non contrôlée • Endomètre inadéquat ➢ Pathologie utérine : polype … ➢ Stimulation en phase lutéale • Impossibilité d’effectuer le transfert La congélation des embryons Et après ? - Nouveau projet parental - Destruction - Donation anonyme à un autre couple - Donation pour recherche scientifique La Congélation 25 La congélation lente vs. vitrification Temps Figure 1: Technique de congélation lente •Diminution de la formation de cristaux de glace •Meilleur taux de survie ➢Embryons : 84% vs. 98% (Loutradi et al.,2008) ➢Ovocytes : 55% vs. 85% (Jeffrey Boldt, oocyte cryopreservation.,2011) •Révision en 2011 de la loi de bioéthique → vitrification ovocytaire 26 La vitrification : principe Probabilité de vitrification égale à : (Pente de descente en température × Viscosité) / Volume Vitrification ovocytaire = cryoconservation autorisée en France depuis 2011 Température (°C) 20 0 -30 Vitrification (15 000-30 000°C / min) -196 Temps 27 Vitrification : Les techniques utilisées 1) La vitrification manuelle o Kits de vitrification et dispositifs différents selon les laboratoires : o Système de stockage : Paillettes haute sécurité Cuve d’azote liquide (-196°C) 28 Nouvelle technologie Automate de vitrification Gavi®, MERCK 29 Vitrification : Les techniques utilisées 2) La vitrification semi-automatisée : GAVI® Merck • Automate -> standardiser le processus de cryopréservation • 3 cycles adaptés à l’échantillon vitrifié: Ovocyte Embryon clivé Blastocyste • Cycle automatisé de 13 à 15 minutes • Cartouche de milieu GAVI® (deux solutions : équilibrage + vitrification, cryoprotecteurs) • Dispositif de stockage : - Pods Cuve d’azote (-196°C) - Cassette 30 La vitrification semi-automatique : GAVI® Pod Gavi®: design unique permet de stocker et maintenir l’embryon durant la vitrification tout en limitant sa manipulation. Elément clé de l’automatisation de la vitrification permet : ✓ De maintenir l’ovocyte/embryon à son emplacement lors des changements automatisés des fluides. ✓ De prévenir, grâce au scellage, le risque de contamination par l’azote liquide. ✓ Des vitesses de vitrification et de réchauffage rapides grâce aux fines parois du Pod Gavi®. 31 La vitrification semi-automatique : utilisation du GAVI® Préparation de l’automate: (1)→ Réactifs de vitrification (2) → Tip & Seal 1 3 Insertion dans le plateau de rangement du GAVI® (3) 2 Ajout 2 µl de tampon Cycle de vitrification selon les échantillons: - ovocytes - embryons clivés - blastocystes Insertion: Pod dans la cassette Stockage → visotube (-196°C) Dépôt de l’embryon ou ovocyte 32 33 34 Vitrification semi-automatique ovocytaire Utilisation technique manuelle - courbe d’apprentissage - opérateur dépendant - variabilité en fonction du nombre d’ovocytes obtenus à la ponction → Appareil de vitrification semi-automatique GAVI® (Merck) Efficacité et reproductibilité (embryons) (Dal Canto et al. 2019) 35 Vitrification semi-automatique (GAVI®) Validation sur des Ovocytes immatures voués à la destruction → Survie = 83% à 2h Ovocyte atrétique Ovocyte non atrétique 36 Congélation des ovocytes Congélation par vitrification +++ - Préservation de la fertilité - Don d’ovocytes - Absence de spermatozoïdes le jour de la ponction ovarienne : • Echec de prélèvement de sperme le jour J • Azoospermie le jour du recueil Améliorer le taux d’implantation de l’embryon ECLOSION ASSISTEE HATCHING AMELIORATION DES TAUX D’IMPLANTATION Principe: Compenser déficits embryonnaires par moyens mécaniques Indications: Échecs d’implantation / Age L’éclosion assistée ou hatching (Assisted Hatching) est une technique qui a été proposée afin d'augmenter les taux d'implantation pour les patientes ayant de faibles chances de succès étant donné leur âge ou des antécédents d'échecs d'implantation. ECLOSION ASSISTEE HATCHING Principe: vieillissement ovocytaire ou mauvaises conditions de culture => zona hardening => défaut d’éclosion → créer brèche dans zone pellucide pour faciliter éclosion Technique: perforation laser ++ Indications: âge défauts d’implantation zone pellucide épaisse Résultats: technique publiée en 1990 toujours en cours d’étude… Plus de 150 publications Figure 2. Vitrified-warmed human cleavage-stage embryos and the hatching of the embryos (A) stabilized with a holding pipette with the zona intact, (B) after quarter ZP thinning using laser-assisted hatching, (C) after half ZP thinning using laser-assisted hatching, (D) after two-thirds ZP thinning by laser-assisted hatching, (E) partial hatching of the embryos, and (F) complete hatching. Bar, 10 μm. ZP, zona pellucida. Améliorer le taux d’implantation de l’embryon Vers le DPI-A Diagnostic pré implantatoire à la recherche d’aneuploïdie 42 Améliorer le taux d’implantation de l’embryon Vers le DPI-A Diagnostic pré implantatoire à la recherche d’aneuploïdie 43