Virologie - Introduction à la virologie PDF 2024-2025

Matière : Virologie Professeur : Pr Gault Titre: Introduction à la virologie Pages :32 Équipe : Massilya M, William R, Lilian L, Shir F Date : 05/09/2024 Ronéoboss : Quentin G...

Matière : Virologie Professeur : Pr Gault Titre: Introduction à la virologie Pages :32 Équipe : Massilya M, William R, Lilian L, Shir F Date : 05/09/2024 Ronéoboss : Quentin G Semaine : 36 Table des matières I - Le virus 3 II - Physiopathologie des infections virales 6 1 - Pénétration des virus dans l’organisme 2 - Mécanismes de défense de l’organisme 3 - Diffusion du virus dans l’organisme III - Le diagnostic indirect 11 1 - Cinétique de la réaction immunitaire 2 - Principes de base de la sérologie 3 - Test ELISA 4 - Tests d’immunochromatographie sur bandelettes (très utilisé dans les AES) 5 - Western Blot – Immuno Blot 6 - Avantages et inconvénients de la sérologie 7 - Indications de la sérologie IV - Le diagnostic direct 19 1 - Présence du virus entier 2 - Présence de constituants de la particule virale 3 - Les indications du diagnostique virologique direct V - Vaccins antiviraux 23 VI - EEB 26 VII - Annales 28 Remarques : Le cours est sur théia, la ronéo a pas changé par rapport à l’année dernière à part quelques informations en plus. En italique ; partie non dites cette année ou pas important a connaître selon la prof. 2024 - 2025 Page : 2 / 32  INTRODUCTION A LA VIROLOGIE I - Le virus a - Définition d’un virus « Un virus, c’est un paquet de mauvaises nouvelles » (très bonne définition selon la prof) Un virus est formé d’un acide nucléique qui correspond au génome viral (information génétique) du virus (ADN, ARN, simple ou double brin), entouré d’une enveloppe protéique appelée capside qui vient du grec capsos et veut dire « boîte ». Cette capside est essentiellement composée de protéines et elle présente des glycoprotéines de surface. Et parfois, il y a une enveloppe. Un virus seul ne peut rien faire contrairement aux bactéries et aux levures (se multiplier, etc). Ils ont besoin de détourner à leur profit du matériel cellulaire et de pénétrer dans des cellules de manière très spécifique (contrairement aux bactéries et aux parasites) par l’intermédiaire de glycoprotéines de surface (comme des clés) portées soit par la capside ou l’enveloppe. Ces dernières se trouvent à leur surface et sont extrêmement spécifiques de chaque virus qui va reconnaître un récepteur cellulaire, c’est le pouvoir infectieux du virus. Une fois dans la cellule le virus peut se multiplier, il forme alors des virions. L’enveloppe des virus enveloppés se forme en sortant de la cellule avec la membrane plasmique (un peu comme un manteau). Ils vont donc avoir une bicouche lipidique où se trouvent les glycoprotéines qui portent le pouvoir infectieux du virus. Une membrane cellulaire est bien plus fragile qu’une capside. De ce fait, les glycoprotéines, si elles se trouvent sur une membrane seront elles aussi soumises à la fragilité de cette membrane. En effet, en cas d’agression (UV, chlore, savon etc) les virus enveloppés perdent facilement la membrane où se trouvent leurs glycoprotéines. Les virus enveloppés perdent donc beaucoup plus facilement leur pouvoir infectieux que les virus nus. Il ne faut donc pas se laisser tromper par les mots, dans le monde des virus, une enveloppe est plutôt signe de fragilité. Page : 3 / 32  b - Cycle de réplication des virus Le cycle de réplication (différentes étapes de la réplication d’un virus) des virus suit toujours à peu près le même modèle : La prof n’a pas autant détaillé cette année sur chacune des étapes (je vous mets en italique ce qu’elle n’a pas dit). Je vous laisse les infos de l’année dernière car elles aident bien à la compréhension et nous serviront pour la suite des cours. 1. L’attachement Après avoir trouvé sa cible, le virus s’attache grâce aux glycoprotéines de surface à un récepteur spécifique d’une cellule. L’interaction entre la glycoprotéine du virus et la cellule cible est extrêmement spécifique. 2. La Pénétration et Décapsidation Il va pénétrer dans le cytoplasme et va en général se décapsider dans celui-ci (mais ce n’est pas toujours vrai → HIV) et libérer son acide nucléique (ADN, ARN) qui va aller soit dans le noyau pour les virus à ADN (et certains virus à ARN) et rester dans le cytoplasme pour les virus à ARN. 3. Transcription Le génome viral va être transcrit en général par des enzymes cellulaires, mais parfois aussi par des enzymes virales cellulaires. Parfois, le génome va s’intégrer et conduire à des ARN messagers qui vont être pris en charge par les ribosomes de la cellule pour ensuite fabriquer des protéines virales. 4. Réplication Le génome viral va se répliquer en général grâce à ses propres enzymes (en général grâce à une polymérase virale propre), et va reconstituer de nouvelles particules virales et donc permettre la libération du virus soit de manière enveloppée ou nue (point 7). Page : 4 / 32  5. Intégration (pas pour tous les virus) Certains virus ont la capacité d’intégrer leur génome viral à notre génome (c’est le cas du HIV), et cela permet à ces virus de persister dans les cellules et à ce que ces derniers continuent à produire du virus comme son propre matériel génétique. 6. Assemblage, Maturation Le génome viral est transcrit en ARNs messagers qui sont eux-mêmes traduits en protéines virales par les ribosomes cellulaires. Ces protéines virales reforment des protéines de régulation et des polymérases qui s’assemblent avec le génome viral répliqué à l’intérieur d’une nouvelle capside. Il s’agit d’un nouveau virion (il y a des centaines de milliers de virions produits à partir d’une infection virale). Les virions vont ensuite interagir avec le Réticulum Endoplasmique pour acquérir des glycoprotéines. 7. Libération Ces nouvelles particules virales sortent de la cellule, soit par lyse cellulaire (virus nus) soit par bourgeonnement (virus enveloppés) et vont infecter les cellules voisines, qui en général portent les mêmes récepteurs (car au sein d’un organe cible). c - Les traitements Chacune de ces étapes va constituer une cible pour les antiviraux : Inhibiteurs de l’attachement des virus sur la membrane de la cellule (ex : inhibiteurs de fusion pour HIV, antagonistes des récepteurs). Les inhibiteurs de la décapsidation (pour HIV : molécule récente) (vieux médicament utilisé contre la grippe qui n’est plus beaucoup utilisé)). Les inhibiteurs de la transcription virale (exemple de la ribavirine, plutôt polyvalent, souvent utilisé en désespoir de cause). Les inhibiteurs de l’intégration du génome viral aux chromosomes cellulaires (HIV +++ important, il existe maintenant tout un panel d’inhibiteurs de l’intégrase virale pour empêcher cette phase du cycle de réplication). Les inhibiteurs de l’assemblage et de la maturation du virus (ex : inhibiteur des protéases pour l’hépatite C ou HIV). Les inhibiteurs de la libération virale (ex : Tamiflu : va empêcher la libération du virus de la grippe hors de la cellule). Les inhibiteurs de la réplication virale (Ses principales cibles sont les polymérases virales des virus). Ces inhibiteurs correspondent à la majorité des traitements. Il y a de nombreux antiviraux qui agissent sur cette étape (Hépatite C, HIV, Herpès). (ex : aciclovir contre le virus de l’herpes symplex dans le poly.) Les inhibiteurs de la pompe à proton (on ne les utilise plus trop) Les inhibiteurs de polymérases Maladies aiguës d’évolution rapide (grippe) – traitement efficace que si mise en route très précoce voire en profylaxie Les virus ont une capacité d’évolution qui leur permet de sélectionner des mutations Les éléments en italique n’ont pas été mentionnés, mais il faut bien retenir que chaque étape constitue une possibilité de cible pour les antiviraux ! Certains seront abordés au fur et à mesure des cours. d - Problèmes des antiviraux Mettre au point des médicaments antiviraux peut être compliqué, car les virus dépendent complètement de la cellule : La cytotoxicité des virus est un problème, car il faut tuer le virus sans tuer la cellule. Ce qui engendre des effets secondaires et des contre-indications. Pour les traitements au long cours, il y aura aussi les interactions médicamenteuses. Page : 5 / 32  Problème des virus latents (virus restant dans l’organisme sans se répliquer) : on ne peut pas utiliser la réplication cellulaire comme cible thérapeutique (car le traitement ne sera pas actif sur le virus), donc on ne peut pas lutter contre eux. Capacité des virus de sélectionner des mutants résistants aux antiviraux (VIH, hépatites). Les virus ont une plasticité génétique très importante. Non-dit cette année : De plus, pour un certain nombre de maladies chroniques, on utilise une combinaison de plusieurs antiviraux qui permettent justement de braver ces obstacles et notamment la résistance aux antiviraux. → Remarque : « ce type de question est absolument merveilleux à donner en QCM ! » Résumé de la partie : Un virus est constitué d’un génome viral contenu dans une capside pour les virus nus et avec une enveloppe autour pour les virus enveloppés, on retrouve des glycoprotéines de surface sur la capside ou l’enveloppe. Les virus enveloppés sont plus fragiles que les virus nus. La réplication des virus débute par l’attachement du virus à une cellule grâce aux glycoprotéines de surface. Puis, le virus va pénétrer dans la cellule et se décapsider, l’acide nucléique va alors être transcrit par la cellule ou des enzymes virales afin d’être répliqué. Les virions nouvellement formés vont maturer afin d’obtenir les glycoprotéines de surface. Enfin les particules virales sont libérés soit par cytolyse pour les virus nus, soit par bourgeonnement pour les virus enveloppés. Chacune des étapes de la réplication constitue une cible pour les antiviraux qui vont les inhiber. Toutefois, la cytotoxicité des virus, les virus latents et les mutations sont des problématiques dans le développement des antiviraux. II - Physiopathologie des infections virales La physiopathologie des infections virales correspond à l’histoire du virus dans l’organisme. Comment est-ce qu’il rentre ? Que fait-il une fois à l’intérieur ? Comment peut-on s’en débarrasser ? Le virus doit donc commencer par rentrer/pénétrer dans l’organisme, via une porte d’entrée. Il va ensuite se diffuser dans l’organisme afin de rejoindre son organe cible, l’organe au sein duquel il va trouver des cellules qui ont les récepteurs qui lui sont spécifiques. Il va se multiplier, déclenchant la primo-infection et va donner, ou non des symptômes. Il est important de préciser que beaucoup d’infections virales sont asymptomatiques, ou très peu symptomatiques. De plus, un même virus peut donner sur deux individus deux situations différentes, d’un côté une maladie sévère, et de l’autre presque rien. 1 - Pénétration des virus dans l’organisme a - Voie Respiratoire – LA VOIE ROYALE → Remarque : La prof a plus insisté sur cette voie et est allée un peu plus vite sur les autres. La voie de transmission efficace empruntée par des nombreux virus respiratoire, non respiratoire, enveloppé et non envelpppé La voie respiratoire est une voie très utile puisqu’on ne peut pas s’empêcher de respirer. En effet, on est obligé d’inhaler à un moment ou à un autre. Elle est empruntée par de très nombreux virus. Exemples de virus dont la cible est l’arbre respiratoire : rhinovirus, le virus de la grippe, celui de la bronchiolite (le VRS). Mais, il faut également savoir que beaucoup de virus dont la cible N’EST PAS l’arbre respiratoire emprunte celle-ci comme la varicelle car c’est une voie extrêmement efficace. La varicelle s’attrape par voix respiratoire pourtant la cible du virus est la peau au niveau des boutons. Les boutons contiennent du virus et lorsque les croûtes tombent, lorsque les vésicules virales se percent, cela transmet un aérosol qui est extrêmement contagieux que l’on va inhaler. Mais c’est aussi le cas de la rubéole, des oreillons, etc. Page : 6 / 32 Ces virus passant par la voie respiratoire peuvent être enveloppés ou nus, à ADN ou ARN. Lorsqu’on est porteur d’une infection virale, on est susceptible de l’excréter (en parlant, en toussant, en éternuant) dans des microparticules de salives appelées « particules de flügge » (microparticules de sels). Ces gouttelettes sont susceptibles de contenir des agents infectieux qui vont être inhalés, surtout si l’on se trouve dans une pièce fermée. Les particules que l’on ne respire pas vont se déposer sur les surfaces et (bien que ce ne soit pas la voie naturelle) les particules virales peuvent être inhalées via les mains, c’est à dire que l’on va les ramasser en s’accrochant à la barre du métro et les inhaler d’une façon ou d’une autre. On peut limiter cette voie de diffusion par le port du masque et le lavage des mains. b - Voie Digestive Lors de l’ingestion de particules virales, elles passent par l’estomac, un milieu tr ès acide (Ph autour de 2). Ensuite, les particules virales arrivent dans le duodénum où elles subissent un lavage à la bile, un liquide très alcalin (basique) afin d’atteindre enfin le reste du tube digestif ainsi que leurs organes cibles pour pouvoir se multiplier. Les particules virales doivent donc être résistantes afin d’emprunter la voie digestive et de résister à ces changements de milieux. La voie digestive est donc utilisée par les virus nus/non enveloppés EXCLUSIVEMENT Ils vont donc pouvoir persister dans l’environnement et ainsi disséminer via l’alimentation, dans des endroits fermés (bateaux de croisière) et on va avoir beaucoup de mal à se débarrasser de ces virus dans les secteurs fermés comme les services hospitaliers, les EHPAD. On les retrouve également dans les coquillages bivalves. Les virus empruntant la voie digestive peuvent avoir pour cible le tube digestif, c’est le cas de tous les virus des gastro-entérites virales dans le cas notamment d’ingestion de particules virales par l’ingestion de coquillage bivalves crus ou peu cuit qui sont des virus très résistants mais beaucoup de virus vont également emprunter cette voie parce que leurs capacités de résister dans le milieu extérieur sont très importantes comme le virus de l’hépatite A / E ainsi que toute la famille des entérovirus (cours consacré plus tard) ayant beaucoup de cibles (le cœur, les poumons, le cerveau etc). La voie digestive peut correspondre à un mode de transmission dit par « Voie directe » c’est à dire d’homme à homme et contribue à ce que l’on appelle le péril-fécale. Une infection digestive commence par l’ingestion du virus, puis on le réplique, et on l’excrète avec un taux de réplication énorme (pour 10 particules virales ingérées, on considère que l’on va émettre dans les selles entre 1010 e t 1012 particules virales par gramme de selles). Ces particules se transmettent par les mains d’homme à homme. c - Voie Muqueuse Muqueuses Buccales Il existe des infections locales comme l’herpès simplex 1 (HSV1). Mais aussi des infections dites systémiques. En effet, cette muqueuse peut être empruntée par des virus dont la cible peut être autre comme le cytomégalovirus (CMV), le virus Epstein Barr (EBV) (ou mononucléose infectieuses → maladie du bisou), HHV-6 et HHV-7. Muqueuse Sexuelle Infection locale : HSV2, Papillomavirus Infections systémiques : HIV, Hépatite B, CMV, HTLV Conjonctive La conjonctive peut également être une porte d’entrée muqueuse pour un certain nombre de virus, en particulier l’herpès simplex, l’adénovirus et donner des infections locales plus ou moins sévères. d - Voie sanguine Page : 7 / 32  Le sang est un cas un peu particulier puisque le sang est par définition difficile d’accès. Les raisons d’infections peuvent être : Les causes iatrogènes, des suites d’un soin médical, sang et produit dérivés, matériel biomédical, exploration fonctionnelle. La toxicomanie par voie intraveineuse Les accidents d’exposition au sang des personnels soignants, qui consistent à une exposition par coupure ou piqûre, à du sang contaminé par un virus Par le sang, on peut transmettre tous les virus qui ont une étape de virémie au cours de leur multiplication. Mais les plus fréquemment impliqués sont l’hépatite C, hépatites B le HIV. Virémie : présence d’un virus dans le sang La voie sanguine est une voie vis-à-vis de laquelle on a beaucoup de prévention. En effet, nous avons fait beaucoup de progrès vis-à-vis de la contamination iatrogène, en revanche, il est plus compliqué de réguler les problèmes de toxicomanie intraveineuse. Enfin, les accidents d’exposition au sang ont également grandement diminué grâce à la prise en compte d’un certain nombre de mesures. e - Transmission mère-enfant La transmission peut se faire à différents moments de l’interaction intime d’un enfant : En prénatale, c’est à dire in utero, qui donne lieu à des syndromes malformatifs (la rubéole, le cytomégalovirus, le virus de la varicelle). Elle peut également donner lieu à des maladies foeto-placentaires (parvovirus B19, un agent de mort fœtale in utero assez fréquent). En périnatale (le plus souvent), c’est à dire au moment de l’accouchent (au contact des muqueuses), qui est la voie la plus fréquente de transmission de la mère à l’enfant des virus, comme le HIV, l’hépatite B et HSV2. En postnatale, et notamment par l’allaitement, on peut transmettre un certain nombre d’agents viraux. Toutes ces voies peuvent être sujettes à des mesures de PRÉVENTION. Bien qu’il soit difficile de se prévenir contre les cytomégalovirus et le Parvovirus B19, il est possible de prévenir la transmission des autres virus. On arrive à bien contrôler les transmissions mère-enfant dans les pays riches, et à condition de pouvoir suivre les femmes enceintes tout au long de leur grossesse. f - Voie cutanée La peau est une barrière naturelle difficile à pénétrer pour un virus. Toutefois, il existe des infections cutanées localisées comme : Les papillomavirus (virus nus = resistant) qui donnent des verrues. Les verrues plantaires ou autres verrues cutanées sont des virus qui se multiplient au niveau des épithéliums cutanés. Les poxvirus qui donnent des nodules du trayeur. L’infection par voie cutanée peut être une infection transcutanée qui va être transmise par des vecteurs comme un certain nombre d’insectes piqueurs/mordeurs qui vont pouvoir transmettre beaucoup de virus (aurait pu apparaître dans « voie sanguine »). On a également la rage qui va se transmettre essentiellement par morsure (de chien) pour la plupart des cas, donc par voie transcutanée. Page : 8 / 32  2 - Mécanismes de défense de l’organisme a - Défense non-spécifique Les barrières naturelles La peau L’épithélium respiratoire, avec les cils vibratiles qui font remonter les sérosités/mucosités qui permettent d’éliminer un certain nombre d’agents infectieux Le reste des épithéliums Les cellules phagocytaires (qui ne sont pas spécifiques de l’agent viral), qui vont être capables de détruire les virus lorsqu’elles en rencontrent. Les cytokines, avec une action propre antivirale non spécifique (éventuellement virucide ou stimulatrice du système immunitaire) qui vont activer les défenses immunitaires b - Défense spécifique Immunité cellulaire (lymphocytes T) avec des cellules spécialisées dans la destruction des cellules infectées de virus. Immunité Humorale (lymphocytes B) avec la synthèse d’anticorps neutralisant qui vont être capable de reconnaître les virus, de les englober et ainsi empêcher l’interaction de la glycoprotéine virale avec son récepteur. c - Stratégie d’échappement virale Le virus peut cibler des organes peu accessibles pour le système immunitaire, comme le système nerveux central (HSV, VZV), la peau (verrue = papillomavirus)... Le virus peut être capable de diminuer sur l’expression des molécules HLA (HIV, Cytomégalovirus CMV) Le virus peut jouer sur la variabilité antigénique (la grippe notamment). En mutant, le système immunitaire ne le reconnaît plus, et peut réinfecter l’organisme. Le virus peut jouer sur la latence virale. En effet, certains virus se mettent dans une situation où le système immunitaire ne les voit pas, et ne peut donc pas les attaquer. Ex : virus Epstein Barr 3 - Diffusion du virus dans l’organisme a - Infections virales résolutives Tout commence par la rencontre du virus pour la première fois, la « primo-infection ». Cette primo-infection peut donner lieu ou pas à des symptômes, des maladies graves ou non (en fonction du virus mais aussi de l’individu), dans tous les cas, le virus se multiplie. Cela stimule le système immunitaire qui entraîne ainsi une réponse immunitaire qui va conduire a l'élimination du virus. Cette résolution de l'infection virale conduit à la guérison si l'individu était malade et éventuellement à la constitution d'une immunité protéctrice plus ou moins définitive car le corps va fabriquer des anticorps pour contrer les antigènes de protéines virales. Ainsi, il s'agit d'une infection dont la réponse immunitaire mise en place contre le virus est efficace et entraîne la guérison : l’action du système immunitaire permet in fine de se débarrasser du virus. L'immunité, par l’acquisition d’anticorps, peut être : Définitive, pour les virus sans variants (ex : Rubéole, Rougeole, Oreillons, hépatite A, Parvovirus B19). Ces maladies immunisent durablement l'individu, elles sont immunisantes : on aura ces maladies qu’une seule fois dans sa vie, une fois qu’on les a faites on ne peut pas retomber malade de cette même maladie. Page : 9 / 32  Partielle, pour les virus ayant beaucoup de variants, on peut parler de plasticité du génome ou de mutations (ex : grippe, rhume, gastro-entérite, bronchiolite), ainsi les anticorps fabriqués contre le premier virus ne vont pas très bien marcher et on peut retomber malade d’un virus voisin mais on reste dans des infections qui se résolvent. Il existe aussi une forme d’infection résolutive, moins joyeuse, qui peut entraîner la mort (ex : Grippe très sévère, fièvre hémorragique comme Ebola avec 80 % de mortalité, hépatite fulminante, rage avec 100 % de mortalité, encephalopathie). Donc on guérit, mais on meurt…en gros à la fin ton système a réussi à te débarrasser du virus mais c’est trop tard tu finis par mourir. b - Infection virale persistante (non résolutive) Dans ce cas là, on fait toujours une primo-infection. Cette primo-infection conduit ou pas à des symptômes/maladies en fonction du virus et/ou de l’individu. Seulement après ça ne se résous pas et il va y avoir une persistance du virus dans l'organisme selon 2 modes différents. La persistance virale peut être : Réplicative : Cela commence donc par une primo-infection qui va entraîner une maladie aiguë dont on guérit. On a l’impression que c’est fini mais pourtant le virus a persisté en continuant à se répliquer en permanence ce qui génère une infection virale chronique. C’est une infection qui peut passer inaperçue pendant longtemps mais qui persiste sur un mode réplicatif. Parfois on peut en guérir spontanément (hépatite C par exemple mais toujours selon un faible pourcentage), en mourir spontanément (HIV), ou bien on peut avoir des maladies chroniques plus ou moins sévère (hépatite B). Certaines de ces maladies chroniques peuvent être guéries ou bien améliorées par des traitements qui doivent être maintenue a vie. (VIH, HTLV , VHB VHD VHC) Latence virale - Non réplicative : Ici on a encore le même principe avec la primo-infection dont on guérit. Sauf que le virus ne disparaît pas de l’organisme, il va persister sur un mode non réplicatif que l’on va appeler la latence virale (ex : Herpès virus) avec l’exemple de la varicelle et du zona. C’est une alternance entre latence et réactivation : Primo infection → latence → cycle de réactivation → remise en latence. On ne peut pas traiter ces virus en phase latente car cela ne servirait à rien, le virus ne bougeant pas étant « caché » dans la cellule. Il existe une primo-infection s’accompagnant de la symptomatologie du virus ou non. Puis l'individu guérit de cette primo-infection mais le virus ne disparaît pas, il va persister sur un mode dit « latent » au cours duquel il ne se réplique pas, il ne donne pas de symptôme, le génome viral persiste dans le noyau des cellules de façon non intégrée (sous forme d' « épisome »). De temps en temps, le virus se réveille de sa phase de latence pour mettre à nouveau en jeu un cycle de réplication, aller réinfecter de nouvelles cellules autour puis se remettre dans une nouvelle phase de latence. Donc ces virus vont alterner des cycles de latence et de réactivation tout au long de la vie de l'individu. Les réactivations peuvent être symptomatiques ou asymptomatiques (la plupart du temps). Tous les virus de la famille Herpes Viridae fonctionnent selon ce principe. Dans le modèle de l’herpès simplex 1 (HSV1) oropharyngé : Le plus souvent pendant l’enfance et peu symptomatique, ca passe inapercu, ca guerit tout seul et le virus reste caché et de temps en temps il se réactive L’HSV donne une primo-infection au niveau oral, c’est une infection muqueuse, souvent chez les enfants : une gingivostomatite herpétique. Il s’agit de nombreuses vésicules douloureuses dans la bouche pleine de virus HSV. Suite à la primo-infection, une maladie aiguë peut ou non se développer. Beaucoup de primo-infections herpétiques sont asymptomatiques, mais lorsqu’elles sont symptomatiques, celles-ci sont assez spectaculaires. Le virus se multiplie énormément au niveau des cellules épithéliales de la bouche qui sont très innervées. Puis, le virus reconnaît les terminaisons nerveuses, pénètre dans les ramifications axonales et remonte le cours axonal dans le sens rétrograde afin de gagner le noyau du neurone où il va se mettre en latence. Son génome rentre dans le noyau sous forme d’épisome et génère la transcription de gènes par la cellule, ce qui le maintien en état de latence. C’est comme si le virus hypnotisait la cellule pour qu’elle fabrique des protéines sans qu’elle ne se rende compte de sa présence. Enfin, un stimulus non clairement identifié engendre un signal qui permet la reprise du cycle de réplication. Le virus se multiplie de nouveau et réplique son génome, fabrique des protéines et des petits virions qui reprennent le chemin inverse, descendent le long de l’axone et retournent au niveau de leur cible préférentielle qui est la bouche. Il donne un bouton de fièvre, qui apparaît souvent avec le stress. Ce bouton est plein de virus, il est très contagieux et disparaît en quelques jours ; puis le même cycle recommence. Page : 10 / 32  Il existe aussi des infections virales non évolutives, non réplicatives, qui donnent des transformations cellulaires, c’est à dire qui rendent la cellule cancéreuse. Il existe un certain nombre de virus dont le cycle de réplication peut conduire à des cancers, c’est ce qu’on appelle des infections virales transformantes. Heureusement, ces cancers ne surviennent pas chez tous les individus qui contractent ces virus. Parmi ces virus, on retiendra le papillomavirus, le virus Epstein Barr, les hépatites B et C. En conclusion, il existe des infections résolutives et des infections persistantes, au sein desquelles on distingue les persistances réplicatives qui donnent des maladies chroniques, les persistances non réplicatives (en particulier tout ce qui concerne la latence virale) et les infections virales transformantes. III - Le diagnostic indirect Il y a deux façons d’aborder les choses : Soit on fait du diagnostic direct, c’est à dire qu’on recherche directement le virus ou un de ses constituants, soit les antigènes soit le génome viral. (on peut donc rechercher le génome virale ou les protéines virales aussi appelé antigènes viraux) Soit on fait du diagnostic indirect, qui repose sur la recherche de marqueurs (les anticorps) de notre réponse immunitaire à l’infection virale, c’est la sérologie virale. La sérologie est la recherche d’anticorps spécifiques dirigés contre un virus dans le sang. L’infection par le virus commence par la primo-infection, on génère une réponse immunitaire avec une synthèse d’anticorps qui nous permet éventuellement de guérir avec une immunité plus ou moins définitive. On peut : guérir de la partie aiguë de l’infection, rester en infection chronique ou en infection latente. Le but de la sérologie est de trouver ces Anticorps au laboratoire quelque soit le mode d’évolution du virus. A noter que, la vaccination conduit à la production d’anticorps. 1 - Cinétique de la réaction immunitaire Fabriquer des Ac prend du temps, il existe une cinétique d’apparition des Ac (= immunoglobulines). On met le t0 au jour de la primo-infection ou contage, c’est à dire le jour où je rencontre le virus pour la première fois. Lorsqu’on attrape un virus, on est plus ou moins malade et il se passe un certain temps avant que l’organisme ne développe des anticorps. Les premiers Ac à apparaître sont les IgM (qui ne persistent pas dans le temps) (ce n’est pas tout à fait vrai, les IgG apparaissent quasiment en même temps), mais ils ne persistent pas dans le temps, ils vont persister quelques semaines puis disparaître. Ce sont donc des marqueurs de primo-infection. Les IgG apparaissent à peu près simultanément ou un petit peu plus tard que les IgM, facteur dépendant de la sensibilité des tests. Les IgG vont persister et on va les garder plus ou moins toute notre vie : ils constituent la cicatrice sérologique. Entre le moment où on attrape le virus et le moment où on fabrique des Ac que le laboratoire est capable de détecter, il va s’écouler du temps qui varie en fonction des virus. En général cela met au moins 10-15 jours, mais on peut aller jusqu’à 30 jours ou plus, pour fabriquer des Ac. On ne pourra les détecter qu’au bout de ce laps de temps, c’est ce qu’on appelle la fenêtre sérologique. Page : 11 / 32  2 - Principes de base de la sérologie La sérologie repose sur l’idée qu’une particule virale possède une information génétique, des glycoprotéines et des protéines. Pour la sérologie, on ne va pas utiliser le génome, on va s’intéresser aux protéines et glycoprotéines qui constituent les antigènes (Ag). Contre ces Ag on fabrique des Ac spécifiques (les immunoglobines), qui ne sont pas spécifiques de la totalité de la protéine, en général notre organisme divise ces protéines en épitopes. Une même protéine virale peut donner lieu à beaucoup de mini Ag, qui vont donner lieu à la synthèse de multiples Ac spécifiques. On fabrique vis-à-vis de tous ces Ag des Ac très spécifiques. L’affinité entre anticorps et antigènes est propre, intime, forte et va former un complexe. Ce complexe peut lui même être considéré comme un antigène et être reconnu par une autre immunoglobuline, spécifique d’Ac humains. On parle de fabriquer des immunoglobulines qu’on marque avec un petit drapeau pour pouvoir les reconnaître. C’est à dire que lorsqu’on fabrique des Ac suite à une infection virale, ces Ac sont capables de se complexer et de neutraliser l’infection grâce à la formation d’un complexe Ag/Ac. Ce complexe Ag/Ac constitue un Ag détectable en laboratoire en utilisant des Ac secondaires spécifiques des immunoglobulines humaines marquées par un petit drapeau qui est une enzyme ou une molécule qui émet de la lumière on appel cela des anticorps conjugués. A partir de ce principe, on peut réaliser différents tests : - Test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) - Immunochromatographie sur bandelette TROD, savonnette - Westernblot/immunoblot 3 - Test ELISA Le test ELISA est le plus simple pour comprendre le principe de la sérologie on le fait avec un automate. On achète auprès de firmes spécialisées des tests spécifiques d’une infection virale. On prendra l’exemple de l’hépatite A. Si un laboratoire veut un test contre l’hépatite A, il va acheter des trousses diagnostiques qui vont être constituées de cupules de plastiques recouvertes d’un mélange d’antigènes du virus de l’hépatite A. On ajoute ensuite le sérum du patient dans les cupules, si le patient a des Ac spécifiques contre un certain nombre d’épitopes des protéines de l’hépatite A qui recouvre le puit, alors il y aura interaction avec les antigènes situés dans les cupules. On éliminera le reste du sérum par lavage. On se retrouve avec des cupules recouvertes d’Ag sur lesquels se sont complexés les Ac du patient. Ces complexes constituent des Ag, on va donc utiliser des Ac anti- immunoglobulines humaines (fournis par le laboratoire) marqués par un un luminogène qui émet de la lumière qui va être mesurée par un automate. Ces Ac secondaires vont reconnaître les immunoglobulines humaines, s’y accrocher et le petit drapeau va permettre de les repérer et de les détecter. Soit on mesure l’intensité de la lumière soit de manière plus classique cet Ac conjugué peut être conjugué avec une enzyme qui lorsque l’on va rajouter dans le puit son substrat, va entraîner une réaction colorée que l’on va pouvoir visualiser. Cela va nous permettre de visualiser ce complexe antigène-anticorps. (ce qui est important et de comprendre l’interaction spécifique puis révélation de cette interaction) Page : 12 / 32  La coloration est variable, elle peut être très intense, pâle, blanche, vive. On ne mesure pas à l’œil la couleur, on la mesure en spectrophotométrie, ce qui nous donne un indice numérique, une densité optique que l’on compare au seuil. On dépose en parallèle du sérum du patient de contrôle dont on connaît la valeur, positif ou négatif. Tout ce qui sera au-dessus sera positif et inversement tout ce qui sera en dessous sera négatif. On compare donc cette densité seuil aux densités des patients et on obtient un diagnostic. Les tests ELISA sont très courant, il est donc important de les connaître et de comprendre leur utilisation pour un certain nombre de test d’origine virale. 4 - Tests d’immunochromatographie sur bandelettes (très utilisé dans les AES) Cette année, la professeur est passée rapidement sur cette partie; elle conseille +++ de se référer au polycopié. TEST RAPIDE DANS LE RENDU DU DIAGNOSTIQUE (58min) Appelés TROD, ces tests sont plus simples, par exemple pour avoir des résultats en urgence (dépistage HIV). On utilise ce test depuis longtemps à l’hôpital pour les cas des accidents d'expositions au sang (AES). L’intérêt de cette méthode est alors capitale car elle permet une détection très rapide, permettant ensuite de mettre en place un traitement prophylactique d’urgence pour éviter l’infection. Page : 13 / 32  La bande est comme une sorte de papier buvard qui comporte différentes zones (3 zones en plus de la zone de dépôt) : La zone de dépôt (en bas sur le schéma). On y dépose une goutte de sang total ou de sérum. Par capillarité, le sérum va migrer sur toute la bandelette. Une première zone (1 sur le schéma) sur laquelle est déposée des antigènes viraux HIV, conjugués à une molécule colorée en rouge qui s'appelle le Sélénium, et mobilisables (sous forme soluble). Une deuxième zone (2 sur le schéma) dans laquelle on trouve des antigènes viraux HIV qui sont fixés cette fois-ci sur la bande. Et une troisième zone (3 sur le schéma) sur laquelle on trouve des anticorps anti-HIV fixés sur la bande qui correspond à la zone contrôle Interprétation : Si le test est HIV négatif : Il n'y aura aucun marquage dans la zone 2. Cependant, il y aura bien un marquage dans la zone 3 qui est la zone de contrôle de la migration. Si le test est HIV positif : On observera un marquage dans les zones 2 et 3. Le test est non valide donc non interprétable s’il n'y a pas de marquage dans la zone 3. (Il y a eu un problème dans la migration) Cette technique basée sur la reconnaissance antigène/anticorps. Chronologie du processus de migration : L’enseignante précise que cette partie est importante à comprendre (même si elle n’est pas forcément à apprendre) et qu’il est donc conseillé de se référer au polycopié. Tout d'abord, le sérum traverse la zone n°1 contenant les antigènes viraux HIV conjugués au Sélénium. Ces antigènes vont alors être mobilisés par le sérum et solubilisés. A cet endroit de la bande, on obtient du sérum mélangé aux antigènes viraux marqués à la molécule rouge. Ces antigènes marqués au Sélénium sont emportés par la suite par le sérum du patient. On pourrait penser que les antigènes viraux du HIV vont se précipiter sur les anticorps anti-HIV présent dans le sérum du patient, et c'est vrai. Cependant ces antigènes ne sont pas en excès contrairement aux anticorps du patient, il n'y a donc pas de problème pour la suite de la réaction ! Le mélange formé franchit alors la deuxième zone contenant les antigènes HIV fixés sur la bande. Ainsi, si le patient a des anticorps anti-HIV, ils se fixent sur cette zone. C'est donc une zone importante pour le diagnostic. On observera un marquage rouge (suite aux quelques antigènes marqués au Sélénium qui se sont fixés à ces Ac dans la zone n°1). S'il n'y a pas d'anticorps, il n'y aura pas de marquage. La dernière zone contenant les anticorps anti-HIV permet la fixation des antigènes marqués au Sélénium de la première zone et permet ainsi de confirmer que la migration s'est bien passée. On observera TOUJOURS un marquage à ce niveau, sinon le test n’a pas fonctionné. 5 - Western Blot – Immuno Blot Avec ce test on joue sur la SPÉCIFICITÉ Ce test est important à comprendre, en particulier dans le cadre du test HIV (la prof nous renvoie au polycopié sur la partie HIV). Ce test repose donc sur des bandelettes en nylon (achetées en firme) sur lesquelles on retrouve toutes les protéines virales (=Ag) d’un même virus, disposées sur la bandelette en fonction de leur taille et de leur charge électrique. Chaque bandelette est donc spécifique d’un virus parce que chacune d’elle contient les antigènes virales. Page : 14 / 32  Il s'agit de la recherche d'anticorps sériques chez le patient par des techniques d'ImmunoBlot ou de Western Blot. Les dispositifs sont commercialisés et simplement commandés par le laboratoire. L'ImmunoBlot utilise seulement certaines protéines virales alors que pour le Western Blot toutes les protéines du virus sont testées. Pour les deux tests la méthode est identique : Tout d’abord, on fait réagir le sérum du patient sur la bandelette, et après incubation si les Ac du patient reconnaissent les protéines virales (Ag) ils vont rester sur la bandelette. Ensuite, on ajoute des Ac anti-Ig humaines marqués par une enzyme qui vont permettre la coloration. Enfin, l’étape de révélation se fait grâce à l’ajout du substrat de l’enzyme qui produira une réaction colorée. Si le test est positif, alors on sait à quel anticorps correspond chacune des bandes que l’on voit grâce à la migration en fonction du poids moléculaire. Si le test est négatif, alors on ne voit rien sur la bandelette. Exemple : Analyse de Western Blot des Ac anti-HIV-1 Partie de gauche : coupelles utilisées pour l’incubation et le lavage des bandelettes Partie de droite : Bandelette n°1 : western blot positif : il existe une bande colorée au niveau de toutes les protéines de HIV-1 (le sérum contient des Ac dirigés contre chacune de ces protéines) Bandelette n°2 : western blot négatif Bandelette n°3 : western blot positif : le western blot est incomplet mais répond aux critères de positivité de l’OMS pour l’infection par HIV-1. Le sérum contient des Ac dirigés contre gp160, gp110, p64, p34 et p25 Bandelette n°4 : western blot indéterminé : le western blot est incomplet et ne répond pas aux critères de positivité de l’OMS. Toutes les bandes correspondent à une interaction antigène/anticorps. Page : 15 / 32  6 - Avantages et inconvénients de la sérologie Avantages Inconvénients Simple à réaliser La fenêtre sérologique : au début de l’infection le patient ne présente pas encore d’Ac d’où le risque de faux Automatisable, par exemple le test négatifs. Il faut donc soit refaire un test plus tard, soit ELISA est automatisé et permet de choisir un autre test pour se défaire de la fenêtre faire de grosses séries, c’est la routine sérologique. Il faut bien réfléchir à ce qu’on veut de laboratoire qui permet de fournir lorsqu’on prescrit un test sérologique. un nombre important de résultats Le sérum possède énormément d’Ac, il peut donc arriver Peu coûteux que certains Ac se lient à des antigènes qui ne leur Bonne sensibilité et spécificité correspondent pas : cela entraîne donc des faux positifs. La réponse sera plus ou moins importante. Si on augmente Accessible à tous les laboratoires la sensibilité en mettant plus d’Ag viraux, il y a une perte de spécificité. Les bébés : lors de la naissance, ils possèdent les IgG de la mère et certains tardent à les chasser (entre 6 mois et 1 an). Il y a risque de faux positifs si ce sont les IgG de la mère qui réagissent. Attention : on pourrait vouloir se baser sur l’analyse des IgM chez les bébés cependant ce n’est pas possible car ils présentent un profil d’immuno-déprimé, et mettent beaucoup plus de temps à produire des IgM. Ex : à la naissance, un bébé né d’une mère HIV positif aura une sérologie positive. Ce n’est pas possible qu’elle soit négative. Attention aussi aux immuno-déprimés ou en cas d'immaturité du système immunitaire (bébés) : risque de faux négatifs. Cicatrice sérologique : Il y a des virus pour lesquels on ne peut détecter que des IgG = il n’y a pas de test pour détecter les IgM (par exemple, le virus de l’Hépatite C). Ainsi, il est impossible de distinguer les IgG des IgM, on ne peut pas trancher entre une infection actuelle ou une infection passée. 7 - Indications de la sérologie a - Diagnostic d’une infection virale aiguë Une des premières indications à la sérologie est le diagnostic d’une maladie virale. Exemple : Un patient consulte car il ne se sent pas bien, a un ictère et des douleurs dans l’hypocondre droit, des nausées et des vomissements. C’est probablement une hépatite. Afin de savoir si c’est une hépatite virale ou non, il faut pouvoir utiliser un test qui détecte les IgM spécifiques afin d’émettre un diagnostic. Pour pouvoir faire le diagnostic via un test sérologique, l’incubation (= période entre le moment où j’ai attrapé le virus et où j’ai contracté les premiers symptômes) doit être plus longue que la fenêtre sérologique (environ 2 semaines), afin que le patient ait eu le temps de fabriquer des anticorps au moment où il développe les signes cliniques. Page : 16 / 32  Soit des maladies où les symptômes prennent plus de temps à apparaître que la durée de la fenêtre sérologique. ➔ C’est le cas dans l’hépatite A, l’Epstein Barr, le CMV, l’infection par le virus B19 ou la mononucléose infectieuse. A l’inverse, lorsque la durée d’incubation est brève (moins d’une semaine), comme dans le cas des infections respiratoires telles que la grippe, les IgM ne sont pas encore détectables au moment de l’apparition des signes cliniques, et l’approche sérologique ne sera pas indiquée dans ce contexte. Attention : Les IgM réapparaissent parfois lors de réactivations virales (notamment la famille Herpès). Lors d’une réactivation virale, l’organisme se met à reproduire des IgM. Pour le CMV chez une femme enceinte, on ne va pas mener les mêmes prises en charge en fonction de si c’est une primo-infection virale ou une réactivation virale du CMV. Si l’on a des IgM et des IgG en même temps, on va se servir de l’avidité des IgG afin de différencier une primo-infection d’une réactivation. L’affinité entre IgG (=anticorps) et antigène évolue avec le temps, elle est d’autant plus forte que les IgG maturent (= vieillissent). Lorsque l’on n’arrive pas à trancher entre une infection récente et une infection ancienne, on va donc mettre des Ag viraux avec les anticorps du patient dans un tube. On ajoute un agent dissociateur qui dissociera ou non le complexe antigène/anticorps en fonction de l’avidité du complexe : l’affinité entre antigène/anticorps est faible : l’agent dissociateur arrivera à séparer le complexe, on détectera donc l’anticorps l’affinité entre antigène/anticorps est élevée : l’agent dissociateur n’arrivera pas à les séparer le complexe, on ne détectera pas l’anticorps. On va mesurer ce qu’il reste d’anticorps après introduction de l’agent dissociateur. La mesure de l’avidité des IgG nous permet donc de statuer sur le stade de l’infection : l’avidité entre les IgG et l’antigène est faible : en faveur d’une primo-infection virale (infection récente) l’avidité entre les IgG et l’antigène est élevée : en faveur d’une réactivation virale (infection ancienne) Quand on ne peut toujours pas trancher, on est contraint de faire d’autres tests. Dans 1/3 des cas, l’avidité est intermédiaire. Il est donc impossible de trancher dans ce cas. Page : 17 / 32  b - Statut sérologique La connaissance du statut sérologique vis-à-vis de certaines infections virales permet d’évaluer le risque d’infection pour un patient donné, et peut, dans certains cas, permettre de prévenir une infection virale. Par exemple, dans le cas de la rubéole chez la femme enceinte, on va doser les IgG anti-rubéole : Si le test est positif, la patiente est immunisée et il n’y a donc pas de suivi à effectuer ; Si le test est négatif, il va donc falloir effectuer une surveillance sérologique pendant la grossesse et une vaccination au décours. Autre exemple, dans le cas de l’Hépatite A, on va doser les IgG anti-HAV avant un voyage en pays d’endémie ou terrain à risque : si le test est positif, le patient est immunisé ; si le test est négatif, il faut vacciner le patient. c - Dépistage sérologique des infections virales chroniques La sérologie prend toute sa valeur dans le dépistage des infections virales chroniques : HIV, virus de l’hépatite C (HCV), virus de l’hépatite B (HBV) en sont les exemples type, avec recherche d’Ac anti-HIV et anti- HCV, et pour HBV, recherche d’Ac anti-HBc et anti-HBs (voir cours spécifiques). Dans le cas d’un dépistage HIV positif, le patient est atteint de la maladie, on installe une prise en charge HIV. Cependant, dans le cas de certaines infections comme l’hépatite C, un dépistage Hépatite C positif peut vouloir signifier que le patient est en train de faire une hépatite chronique ou bien que le patient est déjà guéri. Résumé de la partie : Tests sérologiques Immunochromatographie sur ImmunoBlot / WesternBlot bandelettes Ce qui est présent sur le test et qui 1 antigène spécifique du virus Plusieurs / toutes les protéines réagira (ou non) avec le sérum du virales du virus patient Test négatif pour un antigène Marquage dans la zone 3 Pas de marquage à la hauteur du poids moléculaire de l’antigène concerné Test positif pour un antigène Marquage dans les zones 2 et 3 Marquage à la hauteur du poids moléculaire de l’antigène concerné Test invalide Pas de marquage - Avantages Inconvénients Simple La fenêtre sérologique : risque de faux négatifs. Automatisable Le sérum possède énormément d’Ac : faux positifs. Peu coûteux Les bébés : faux positifs si ce sont les IgG de la mère Bonne sensibilité et spécificité qui réagissent. Accessible Immuno-déprimés : faux négatifs. Cicatrice sérologique Page : 18 / 32  Indications à la sérologie virale Diagnostic d’une Incubation doit être plus longue que la fenêtre sérologique –> hépatite A, l’Epstein infection virale aiguë Barr, le CMV, l’infection par le virus B19 ou la mononucléose infectieuse. Détermination du stade de l’infection : l’avidité entre les IgG et l’antigène est faible : en faveur d’une primo-infection virale (infection récente) l’avidité entre les IgG et l’antigène est élevée : en faveur d’une réactivation virale (infection ancienne) Statut sérologique évaluer le risque d’infection pour un patient donné prévenir une infection virale –> Voyage pour l’Hépatite A –> Rubéole chez la femme enceinte Dépistage infection HIV, hépatites (attention, cas où chronique non discernable de guéri) virale chronique Le plus souvent, lorsque l’approche indirecte n’apporte pas la réponse recherchée, on a recours au diagnostic direct. IV - Le diagnostic direct Le diagnostic direct consiste en la recherche, à partir d’un prélèvement biologique, de la présence du virus « entier » ou d’un de ses constituants. 1 - Présence du virus entier LA PROF A DIT QUE LA PARTIE a et b NE SONT PAS À CONNAITRE a - Microscope électronique Dans l’idéal on recherche le virus entier. L’ancienne méthode pour détecter le virus entier consiste à observer les particules virales en microscopie électronique. Ce système n’est plus utilisé aujourd’hui car il est très compliqué et inexploitable en routine. Cette technique permet de détecter les particules virales présentes dans le prélèvement à une concentration ≥106 particules/mL, ce qui est rarement obtenu. b - Isolement des particules virales en culture cellulaire Rappel : Les virus sont strictement dépendants des cellules pour se développer. Ils ne peuvent donc être isolés que s’ils sont cultivables (ce qui n’est pas le cas de tous les virus) sur des lignées cellulaires adaptées. Technique très utilisée jusqu’à récemment, elle reste néanmoins très compliquée car les laboratoires doivent entretenir des lignées cellulaires (permettant de cultiver différentes types de virus) différentes (de part la spécificité des récepteurs) ce qui représente un travail conséquent. Il faut également inoculer l’échantillon clinique sur ces cellules et observer tous les jours au microscope pour Page : 19 / 32 détecter une réaction, cela est trop long pour être utilisé en routine. A titre d’exemple, dans le cas du cytomégalovirus cela nécessite 15 jours à 3 semaines. Cette technique est donc aujourd’hui délaissée par la majorité des laboratoires au profit d’autres méthodes. Cependant, cette technique reste réalisée en particulier dans des laboratoires spécialisés l’utilisant pour conserver les souches de virus des patients et pour rechercher des résistances des virus aux médicaments (pour les herpès par exemple). 2 - Présence de constituants de la particule virale Les techniques précédemment citées étant trop complexe ou longues à mettre en place, en routine, on privilégiera la recherche de constituants de la particule virale. Dans ce cas, on recherchera soit des protéines (=antigènes) soit du génome viral. a - Détection des Ag (= antigènes) viraux Il existe différentes méthodes pour les détecter. Certains antigènes viraux sont solubles dans le sang. Au cours du cycle de réplication virale certains virus utilisent leurs antigènes pour fabriquer leur particules virales, ces antigènes vont être fabriquer en excès et seront alors solubles dans le sang. Ceux-ci peuvent être détectés de la même manière qu’on détecterait des anticorps. C’est-à dire qu’on va utiliser des trousses commerciales dont les puits seront tapissés d’anticorps anti-antigène sur lesquels on versera le sérum du patient, il s’agit donc de test ELISA ou d’immunochromatographie vus précédemment dans le cours. L’interaction Ag-Ac est révélée à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique qui prend l’Ag viral en sandwich. Ce deuxième Ac, conjugué à une enzyme (par exemple la peroxydase) ou à un « luminogène », développera, en présence d’un substrat spécifique, une réaction colorée ou luminescente dont l’intensité sera mesurée par un automate. La recherche d’antigènes solubles dans le sang est la technique la plus couramment utilisée actuellement, par exemple pour l’hépatite B via son antigène HBS. Les autres Ag qui peuvent être recherché dans ce contexte, sont notamment l’Ag p24 de HIV, l’Ag du virus de la dengue... Certains anticorps sont excrétés, par exemple dans les selles, ils peuvent également être détectés par les techniques ELISA ou d’Immunochromatographie. Les Ag intracellulaires peuvent aussi être détectés par immunofluorescence : les cellules recueillies dans le prélèvement sont fixées sur une lame et mises en contact avec un Ac monoclonal spécifique du virus recherché, marqué à la fluorescéine, comme illustré ci-dessous. Page : 20 / 32  Avantages et inconvénients de la détection d’Ag viraux Avantages : - Simple à réaliser - Automatisable - Peu coûteux - Très spécifique (peu de faux-positif) Inconvénients : - Beaucoup moins sensible que la PCR, sauf en ce qui concerne l’antigène HBS du virus de l’hépatite B. b - Les génomes viraux Une des techniques étant de plus en plus utilisée est la détection des génomes viraux (=l’information génétique des virus) par PCR et RT-PCR (quand le génome du virus est de l’ARN). La recherche du génome viral peut se faire à partir de tous types de prélèvements biologiques : sang, urines, liquides de vésicules, prélèvements respiratoires, liquide cérébro-spinal, selles, biopsies, liquide amniotique... L’échantillon doit être acheminé au laboratoire dans les heures qui suivent le prélèvement, afin de garantir au mieux la préservation du génome. Les prélèvements sur écouvillons et les biopsies doivent être placés dans un milieu de transport adéquat. La détection des génomes viraux à partir des prélèvements biologiques repose essentiellement sur des techniques de PCR en temps réel. En effet, à la fin d’une PCR classique le produit est déposé sur un gel d’agarose, celui-ci migre et la révélation est assurée par des agents fluorescents. Cette technique prend du temps et le problème est que à l’ouverture du tube il y a un véritable aérosol du produit amplifié dans le laboratoire, ce qui peut contaminer les prochains échantillons malgré les précautions prises. La PCR en temps réel, quant à elle, se déroule dans un automate où est placée une sonde qui s’hybride et émet de la fluorescence en temps réel, au fur et à mesure des cycles de réplication. L’automate mesure l’intensité de la fluorescence, à partir d’un certain seuil atteint la recherche est positive. Avec cette technique, le tube n’est jamais ouvert, il n’y a donc aucun risque de contamination. De plus, elle permet une approche quantitative (ex : charge virale avec le HIV pour apprécier l’efficacité d’un traitement). L’échantillon doit être acheminé au laboratoire dans les heures qui suivent le prélèvement, afin de garantir au mieux la préservation du génome. Les prélèvements sur écouvillons et les biopsies doivent être placés dans un milieu de transport adéquat. L’approche multiplex s’est beaucoup développée ces dernières années. Dans un même tube réactionnel cette technique permet d’amplifier et de détecter jusqu’à une vingtaine d’agent infectieux (virus, champignons, bactéries peuvent être mélangés). C’est une méthode très sophistiquée et complexe à mettre en œuvre, elle permet une approche syndromique (=rechercher plusieurs agents infectieux à partir du même prélèvement). Par exemple, chez un malade présentant une méningite, les potentielles origines sont multiples (virales, parasitaires, bactériennes) avec la PCR multiplex toutes les pistes peuvent être testées en une fois. De plus, les résultats sont très rapides (environ 2h). Les autres indications des PCR multiplex sont les cas d’infections respiratoires, infections méningo-encéphalites, infections gastro-intestinales. Aujourd’hui, on accorde une importance particulière aux séquences génomiques des virus pour rechercher des résistances aux anti-viraux. Page : 21 / 32  c - Avantages et inconvénients de la PCR Avantages : - Recherche possible dans tout type de prélèvement : urine, sang, LCR, prélèvement respiratoires, biopsie - Très sensible - Très spécifique - Approche quantitative - Approche qualitative - Approche multiplex avec recherche de plusieurs génomes viraux au sein d’un même prélèvement : diagnostic par syndrome (méningo-encéphalite, infection respiratoire…) - Analyse des séquences virales (génotypes de résistance aux antiviraux) Inconvénients : - Coûteux : investissement matériel conséquent, prix du réactif (100€ la PCR multiplex, 30€ la PCR simplex) - Fragilité des génomes viraux (surtout ARN) : importance des conditions de prise en charge du prélèvement (faux négatifs) - Risque de contamination (faux positifs) - Sensible aux inhibiteurs des enzymes de la PCR (existants chez certains individus) présents dans le prélèvement (faux négatifs) - Variabilité génétique des virus (prise en compte de l’évolution dans la conception et le suivi des amorces et des sondes) - Haute technicité 3 - Les indications du diagnostique virologique direct Durée d’incubation La durée d’incubation, c’est-à-dire le temps entre le moment où on attrape le virus et le moment où on est malade, permet d’estimer s’il vaut mieux faire une PCR ou une sérologie. La PCR prend tout son sens lorsque la durée d’incubation est inférieure à la durée de la fenêtre sérologique, c’est le cas de la grippe, du VRS (bronchiolite), du Covid. Pour ces maladies, on va donc procéder à la détection non pas par sérologie mais par PCR. La détection génomique est généralement plus sensible que la détection d’antigènes. Différencier infection chronique et passée La deuxième indication importante est de savoir si une sérologie positive signe une infection chronique ou une infection passée (hépatite C ou B). Dans ces cas là, la sérologie positive pousse à rechercher du génome viral par PCR. Quand la sérologie est positive : - Si la PCR est positive, c’est une infection actuelle, - Si la PCR est négative, c’est une cicatrice sérologique marquant une infection ancienne. Page : 22 / 32  Quantifier la charge virale Une autre indication de la PCR est de quantifier, mesurer la charge virale. Selon les virus, la charge virale spontanée peut être très sable, comme pour l’infection chronique de l’hépatite C, ou plus fluctuante comme pour le VIH. Si on donne une traitement efficace, la charge virale doit s’effondrer : diminution puis plus rien. Il est important de suivre la charge virale des patients qui ont des traitements chroniques au long court pour détecter un échappement thérapeutique. Ces échappements thérapeutiques (par exemple dans un cas de VIH, le traitement marchait bien puis la charge virale augmente brusquement) peuvent être dus à des mutations, mais surtout à l’inobservance du patient. L’inobservance peut conduire à l’émergence de mutations : la réplication virale n’est plus écrasée. Devant un échappement thérapeutique, on est souvent amené à faire le séquençage du génome viral du patient pour détecter d’éventuelles mutations de résistance Résumé de la partie : Diagnostic direct : - soit du virus entier ◦ Microscopie Electronique ◦ Culture Cellulaires - soit de ses constituants Ag : ➔ solubles dans le sang (ELISA, immunochromatographie) ➔ excrétés (ELISA, immunochromatographie) ➔ intracellulaires (immunofluorescence) Génomes viraux : ➔ PCR ➔ RT-PCR ➔ PCR multiplex (approche syndromique) Indications : ➔ durée d’incubation < fenêtre sérologique ➔ différencier infection chronique et passée ➔ quantifier la charge viral. V - Vaccins antiviraux a - A quoi sert un vaccin antiviral ? Lorsque l’organisme rencontre un virus pour la première fois (= primo-infection), celui-ci diffuse jusqu’à son organe cible puis se multiplie déclenchant ou non des symptômes variés. Page : 23 / 32  Les vaccins sont administrés avant tout contact (ex : HAV) de l’individu avec le virus ciblé dans le but d’induire une réponse immunitaire protectrice vis-à-vis de la primo-infection virale, c’est la vaccination préventive. Certains vaccins peuvent également être administrés dans les jours suivant le contact présumé, ce qui permet d’éviter de développer la maladie, c’est la vaccination prophylactique. Une fois exposé au virus, le vaccin sert à protéger de l’infection et à atténuer grandement les symptômes, ce qui permet de se protéger de la maladie mais aussi des différentes formes sévères qui peuvent mener à l’hospitalisation voire à la réanimation (ex : Covid). Un autre rôle du vaccin est de couper la chaîne de transmission. Il existe une multitudes de vaccins qui interviennent à différents moments du développement de l’infection virale. Le vaccin idéal confère une protection de l’infection efficace et durable sans effet secondaire. Il existe deux grands groupes de vaccins : les vaccins vivants (= atténués) et les vaccins non vivants (= inactivés). Vaccins vivants (=atténués) Le premier vaccin date de 1789, c’est Edward JENNER qui en est à l’origine, contre la variole qui causait en France 400 000 morts par an. La variole s’attrape par voie respiratoire amenant à l’époque à la mort de multiples personnes. JENNER remarque que les vaches atteintes par la variole possèdent les mêmes signes cliniques que la variole humaine. Cependant les hommes aux contacts de leurs vaches pouvaient attraper la variole sans en mourir et être par la suite protégé de la variole humaine. Suite à ces remarques, il récupère du jus de pustule de variole de vache afin de le déposer sur une scarification de volontaire sain, ce qui donne une pustule qui guérit. Cela a amené à la protection contre la variole. Vache du latin vacca à donner le nom vaccination. Ici c’est une approche jennerienne de la vaccination c’est- à-dire le vaccin vivant atténué. Les vaccins vivants sont des virus vivants dont la virulence a été atténuée par génie génétique ou par passage en série en culture cellulaire ce qui les rend non pathogènes pour l’homme. Les vaccins sont inoculés (par injection, inhalation, digestion…) mais leur caractère vivant leur confère la capacité de se répliquer chez le vacciné au niveau de l’organe cible, sans induire la pathologie associée au virus sauvage, présence seulement d’une infection asymptomatique qui déclenche le système immunitaire pour induire une réponse immunitaire humorale et cellulaire qui permet d’être protégé face à une nouvelle exposition au virus. L’immunité conférée par ces vaccins est de très bonne qualité car proche de l’immunité obtenue par l’infection naturelle. A RETENIR : INTERDIT son administration chez les immunodéprimés et les femmes enceintes. Exemple de vaccins vivants : Rubéole, Oreillon, Rougeole, Varicelle, Fièvre jaune… LA PROF A DÛ ALLER VITE SUR LA FIN DU COURS Vaccins non vivants (=inactivés) PASTEUR décide de lutter contre la rage (zoonose mortelle, temps d’incubation long = vaccination prophylactique possible) en inactivant le pouvoir infectieux par asséchement d’une moelle contaminée qu’il injecte à Joseph MEISTER (9 ans) victime d’une grave morsure par un chien enragé. Joseph ne développera jamais la rage grâce à ce vaccin. Les vaccins tués ne sont pas vivants, le virus ne se réplique pas mais continue de générer des antigènes immunogènes (production d’Ac). Ils sont inactivés par inactivation chimique ou physique. Page : 24 / 32  b - Vaccins sous-unitaires Le vaccin sous-unitaire est le premier vaccin produit par génie génétique. Il permet d’obtenir des protéines recombinantes immunogènes. Exemple : Vaccin contre l’hépatite B avec production et purification d’antigènes HBs qui est la protéine immunogène du virus. L’injection de cet antigène génère la production d’anticorps anti-HBs qui protège contre l’infection par le virus de l’hépatite B. c - Vaccins virus-like Ce sont des pseudo-particules virales produites in vitro par genie génétique. Elles sont non- infectieuses et obtenues par auto-assemblage spontané de protéines virales constitutives de la capside. Ces pseudo-particules virales (VLP pour virus-like particles) permettent l’expression des antigènes immunogènes dans une conformation identique à celle du virus sauvage. On a ici une meilleure spécificité car dans le cas de vaccins inactivé, les particules immunogènes sont parfois dégradés et ne génèrent pas des Ac aussi spécifique des structures du virus d’origine. Exemple : Vaccin contre le papillomavirus, (association de protéines recombinantes). d - Vaccins tués, sous-unitaires, VLP Par ces vaccins, on administre des antigènes viraux qui ne diffusent pas, ne se multiplient pas et qui ne possèdent pas d’organe cible. Mais ils génèrent une synthèse d’anticorps (réponse immunitaire humorale) qui empêche le virus de pénétrer dans la cellule. Ex : Grippe, Hépatite A, Hépatite B, Papillomavirus A la différence des vaccins vivants, tous ces vaccins inactivés n’ont aucun pouvoir infectieux donc pas de contre-indication (sauf l’allergie) mais ils sont moins immunogènes, il faut donc une plus grande quantité d’antigène ce qui implique des rappels et parfois l’ajout d’un adjuvant. Ils peuvent tout de même être hyper efficace. LA PROF A SAUTÉ LA DERNIÈRE PARTIE CETTE ANNÉE ET A DIT QU’ELLE N’ÉTAIT PAS IMPORTANTE e - Vaccins arrivés sur le marché avec le SARS-CoV Vaccins ARN SARS-CoV-2 Synthèse in-vitro d’ARNm correspondant à une séquence de protéine qui nous intéresse (ici la protéine Spike) enveloppé dans des particules lipidiques qui vont être prise en charge par la machinerie cellulaire pour le traduire en protéine immunogène. Il y alors synthèse de l’antigène puis des anticorps neutralisants. L’intérêt de cette approche est l’absence de manipulation du virus. Elle est simple et ajustable. Ne demande pas d’adjuvant et ne possède pas d’effet indésirable majeur à ce jour Vaccins chimériques non SARS-CoV-2 On utilise un virus (souvent adénovirus) modifié par génie génétique afin qu’il ne puisse plus se répliquer. Puis on insère dans son génome des séquences codant pour la spike du SARS-CoV-2 donc, lorsqu’on nous administre le virus celui-ci pénètre dans nos cellules, libère son génome sans pouvoir se répliquer. En revanche, il va libérer l’information génétique pour SARS-CoV-2 et permettre la production d’antigène donc la synthèse d’anticorps. L’intérêt de cette approche est l’expression des protéines comme pour une infection naturelle ce qui rend le vaccin plus efficace que les vaccins inactivés. Page : 25 / 32  L’ inconvénients principale c’est qu’il existe une fréquence élevée d’infections aux adénovirus, donc présence préalable fort probable d’Ac anti-adénovirus chez le sujet. Ex : AstraZenzca (ADV de chimpanzé), Janssen (ADV-5, peu courant en pathologie humaine), Spoutnik (ADV-5 + ADV-26). VI - EEB Cycle de réplication du virus Attachement, Pénétration et décapsidation, Transcription, Réplication , Intégration (pas tous les virus), Assemblage et maturation, Libération Les traitements antiviraux ciblent différentes étapes du cycle de réplication du virus Effets indésirables des traitements antiviraux - cytotoxicité - impossibilité d’éradiquer les virus latents - inefficacité contre les mutants Portes d’entrées du Virus : -Voies Respiratoires Infection de l’arbre respiratoire -Voies digestives Virus responsables des gastro-entérites, entérovirus, hépatite A et E -Voies muqueuses Muqueuse buccale, sexuelle et conjonctive -Voie sanguine HIV, hépatite B et C -Voie mère-enfant Prénatale, Périnatale et Postnatale -Voie cutanée Papillomavirus, Poxvirus, virus de la rage Différents mécanismes de défense - non spécifiques - spécifiques Page : 26 / 32  Différents devenirs des infections virales - résolutives (guérison ou mort) - non résolutives (maladies chroniques ou latentes) Deux diagnostics pour les infections virales : - direct : recherche directe du virus ou d’un de ses constituants - indirect : recherche de marqueurs du virus : sérologie virale (recherche d’anticorps spécifiques) Tests sérologiques (indirect) : - Test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) - Immunochromatographie sur bandelette, très rapide - Westernblot/Immunoblot, très spécifique Indications de la sérologie : - Infection virale aiguë : l’incubation doit être plus longue que la fenêtre sérologique. Pour différencier une primo-infection d’une réactivation, on se sert de l’avidité des IgG. - La connaissance du statut sérologique vis-à-vis de certaines infections virales permet d’évaluer le risque d’infection pour un patient donné, et peut, dans certains cas, permettre de prévenir une infection virale. - Dépistage sérologique des infections virales chroniques Diagnostic direct : - soit du virus entier : Microscopie Electronique Culture Cellulaires - soit de ses constituants Ag : solubles dans le sang (ELISA, immunochromatographie), excrétés (ELISA, immunochromatographie), intracellulaires (immunofluorescence) Génomes viraux : PCR, RT-PCR, PCR multiplex (approche syndromique) - Indications : pour une durée d’incubation < fenêtre sérologique, pour différencier infection chronique et passée, pour quantifier la charge virale Deux grand groupes de vaccins: Les vaccins vivants (= atténués) et les vaccins non vivants (= inactivés) Autres type de vaccins : sous-unitaires, VLP, ARN, chimérique Page : 27 / 32 VII - Annales 2019 Session 1: QCM 1 : L’enveloppe virale : A. protège le génome viral du milieu extérieur B. est absente chez certains virus C. contient des glycoprotéines interagissant avec les récepteurs cellulaires D. dérive des membranes cellulaires E. est très sensible aux agents physiques et chimiques QCM 2 : Quelles sont les propositions exactes concernant les portes d'entrée des infections virales ? A. La varicelle se transmet par voie respiratoire B. Les papillomavirus peuvent se transmettre par voie cutanée C. Les papillomavirus peuvent se transmettre par voie muqueuse D. La grippe peut se transmettre par voie digestive E. Les méningites à entérovirus peuvent se transmettre par voie digestive QCM 3 : Quelles sont les propositions exactes concernant le diagnostic de l'infection par le virus de l’hépatite C (HCV) ? A. Le dépistage de l'infection chronique par HCV repose sur la recherche d'anticorps par un test ELISA B. Un test ELISA positif pour HCV doit être confirmé par westernblot C. Un test ELISA positif pour HCV peut correspondre à une infection guérie D. La mesure de la charge virale de HCV permet de dépister les réinfections virales E. Le dépistage de l'infection aiguë par HCV repose sur la recherche d'IgM anti-HCV 2020 Session 1 QCM 1 : Les virus nus (1 à 5 bonnes réponses possibles) A. peuvent se transmettre par voie respiratoire B. peuvent se transmettre par voie digestive C. ne peuvent pas persister plus de 48h dans le milieu extérieur D. n'utilisent pas de récepteur pour pénétrer dans les cellules E. ne peuvent pas avoir un génome de type ARN Page : 28 / 32 QCM 2 : Les antiviraux : A. sont dirigés contre les ADN ou ARN polymérases cellulaires B. peuvent être des analogues nucléotidiques interrompant la chaîne d’élongation de l’ADN viral C. peuvent être actifs sur les formes latentes des infections virales D. sont inactifs sur les formes chroniques des infections virales E. peuvent être actifs sur les primo-infections virales QCM 3 : Les infections virales : A. ne peuvent jamais conduire à une immunisation durable (protection contre les ré-infections) car les virus sont trop variables génétiquemen B. peuvent être à l'origine de cancers C. peuvent être asymptomatiques D. peuvent dans certains cas être traitées par des antibiotiques E. persistent toujours dans l'organisme soit sous forme latente soit sous forme réplicative (infection chronique) QCM 4 : Les vaccins viraux : A. sont contre-indiqués chez la femme enceinte lorsqu'ils sont produits par génie génétique B. sont toujours contre-indiqués chez la femme enceinte ("on ne vaccine pas une femme enceinte") C. peuvent être constitués par des virus infectieux mais non pathogènes D. ne confèrent pas de protection contre les virus susceptibles d'établir une infection chronique E. peuvent parfois être administrés à titre prophylactique dans les jours qui suivent un contact avec un agent viral pathogène QCM 5 : Concernant les approches de diagnostic en virologie, laquelle (ou lesquelles) de ces affirmations est (ou sont) exactes ? A. L’absence d’anticorps indique l’absence d’infection B. Le génome viral n'est pas détectable en cas d'infection virale asymptomatique C. La présence d'anticorps spécifiques d'un virus est le témoin d'une infection récente ou ancienne par ce virus D. Quand une infection est asymptomatique il n'y a pas de réponse anticorps détectable E. Les techniques de détection des génomes viraux utilisées couramment sont très sensibles Page : 29 / 32 QCM 6 :Le diagnostic sérologique en virologie : A. peut être combiné à une recherche d'antigènes viraux pour diminuer la durée de la fenêtre sérologique B. peut être réalisé par immunochromatographie sur bandelette C. est très utile chez le nouveau-né pour dépister rapidement une contamination mère-enfant par le VIH D. est très spécifique et ne donne pas de résultats faussement positifs E. est très sensible et ne donne pas de résultats faussement négatifs QCM 9 : Les entérovirus : A. sont les principaux agents des gastroentérites virales B. sont des virus enveloppés C. peuvent être à l'origine de méningites D. peuvent être à l'origine d'infections respiratoires E. ne peuvent pas être détectés par PCR car de trop nombreux virus sont en cause 2021 Session 2 QCM 1 : L’enveloppe virale : A. protège le génome viral du milieu extérieur B. est présente chez tous les virus C. contient des glycoprotéines interagissant avec les récepteurs cellulaires D. dérive des membranes cellulaires E. est très sensible aux agents chimiques et physiques QCM 2 : La primo-infection virale : A. est toujours symptomatique car le patient n'a aucun moyen de défense B. peut se résoudre et conduire à une immunité protectrice durable contre le virus en cause C. peut être évitée lorsqu'il existe un vaccin efficace D. n'est grave que chez les immunodéprimés E. peut conduire à des maladies virales chroniques QCM 3 : Les traitements antiviraux : A. sont toujours contre-indiqués chez les femmes enceintes B. peuvent avoir des effets secondaires toxiques pour le rein C. peuvent devenir inefficaces du fait de l'émergence de virus résistants présents au sein de la quasiespèce D. sont inactifs sur les étapes latentes des infections virales E. sont contre-indiqués chez les immunodéprimés Page : 30 / 32 QCM 4 : Le diagnostic direct en virologie : A. permet de détecter les anticorps anti-viraux dans le sérum B. permet la détection des antigènes solubles dans le sérum C. permet de rechercher simultanément le génome de différents virus D. permet de mesurer la charge virale E. est moins sensible que le diagnostic indirect 2022 Session 1 QCM 1 :L’enveloppe virale : A. est un facteur de fragilité du virus vis-à-vis du monde extérieur B. est un élément constitutif de tous les virus C.contient des glycoprotéines interagissant avec les récepteurs cellulaires D. dérive des membranes cellulaires E. protège le virus des agents chimiques et physiques QCM 2 : Laquelle ou lesquelles de ces affirmations sont exactes ? A. Les virus ne possèdent pas de capside B. Toutes les infections virales s’accompagnent d’une virémies C. Toutes les infections virales peuvent être à l’origine de malformations congénitales D. Les antiviraux actuels ne ciblent pas les formes virales latentes E. Certains virus peuvent induire des cancers QCM 3 : LE diagnostic indirect en virologie : A. Est utilisé pour la recherche du génome viral B. Est utilisé pour la recherche des antigènes solubles C. Est utilisé pour la recherche d’anticorps spécifiques D. Doit toujours être confirmé par une technique de diagnostic direct E. Peut générer des résultats faussement positifs Correction 2019 Session 1 Q1 : BCDE Q2 : ABCE Q3 : ACD Page : 31 / 32 Correction 2020 Session 1 Q1 : AB Q2 : BE Q3 : BC (D inacceptable) Q4 : CE Q5 : CE (AB inacceptable) Q6 : AB (C inacceptable) Q9 : CD (C indispensable) Correction 2020 Session 2 Q1 : CDE Q2 : BCE Q3 : BCD Q4 : BCD Correction 2022 Session 1 Q1 : ACD Q2: DE Q3 : CE Page : 32 / 32