Quaderno di laboratorio Nutraceutica - Fausti Martina.pdf

LABORATORIO DIDATTICO: NUTRACEUTICA Anno universitario: 2023-2024 Studentessa: Martina Francesca Fausti 739232 Docente: prof.ssa Daniela Letizia Uberti  ATTIVITA’ -> Prendere famigliarità con le diluizioni tramite...

LABORATORIO DIDATTICO: NUTRACEUTICA Anno universitario: 2023-2024 Studentessa: Martina Francesca Fausti 739232 Docente: prof.ssa Daniela Letizia Uberti  ATTIVITA’ -> Prendere famigliarità con le diluizioni tramite preparazione di diluizioni scalari di Blu di metilene. 1. Preparare una soluzione di Blu di Metilene a concentrazione nota a. Preparare 50 mL di soluzione madre di Blu di Metilene 1,5 mM L’obiettivo della giornata é capire se la soluzione preparata ha veramente questa molarità! Massa della polvere di Blu di metilene da pesare per realizzare la soluzione madre. 2. Partendo dalla soluzione di Blu di Metilene 1,5 mM eseguire diluizioni seriali 1:3 3. Dalle diluizioni preparate, per identificare la molarità della soluzione iniziale si può procedere in 2 modi: LETTURA IN PIASTRA Trasferire 200 uL di ogni soluzione in un pozzetto di piastra 96 wells ed osservare al filtro con lunghezza d’onda pari a 620 nm. Lo strumento non permette di scegliere liberamente la lunghezza d’onda ma solo tra valori preimpostati: il valore 620 é il più vicino a quello di nostro interesse 663 nm. -> Per questo motivo la misura non potrà essere precisa come quella che si può ottenere allo spettrofotometro. Per graficare il risultato non si considerano i primi 2 valori (dopo il bianco) perchè lo strumento non é in grado di definire bene l’assorbanza della soluzione: all’analisi ottenuta infatti il valore viene barrato -> Concentrazione troppo elevata. LETTURA IN CUVETTA Trasferire 900 uL di ogni soluzione in cuvette per analisi allo spettrofotometro ed osservare alla lunghezza d’onda pari a 663 nm. Lo strumento permette di scegliere liberamente la lunghezza d’onda: viene scelta la lunghezza d’onda di 663 nm perchè a questa misura vi é il picco di assorbanza del Blu di metilene -> Per questo motivo la misura allo spettrofotmetro é più precisa di quella che si può ottenere con la lettura in piastra. Il valore di R^2 nei grafici avrebbe dovuto avvicinarsi il più possibile a 1 per ottenere linearità tra le concentrazioni e le assorbanze delle soluzioni ottenute. Si osserva una differenza tra gli R^2 dei due grafici ottenuti perchè la lettura in piastra é meno precisa rispetto alla lettura in cuvetta. In parte l’errore può essere dovuto anche ad errori nella pesata iniziale della polvere di Blu di Metilene o ad errori nei vari trasferimenti con pipette.  ATTIVITA’ -> Studio del DPPH dell’attività antiossidante del Trolox. 1. Preparare la curva di Troxol in H2O. a. Partendo da uno stock 3 mg/ml di Trolox, preparare le varie diluizioni della curva nelle rispettive eppendorf alle seguenti concentrazioni Dato che non abbiamo delle micropipette abbastanza precise per le diluizioni 8 ug/ml, 4 ug/ml e 2 ug/ml, si effettua una diluizione 1:10 delle diluizioni di 80 ug/ml, 40 ug/ml e 20 ug/ml rispettivamente. Per la preparazione di queste ultime 3 diluizioni si prelevano 100 ul delle rispettive soluzioni più concentrate e li si pongono in una eppendorf insieme a 900 ul di H2O. b. Caricare sulla piastra 96 wells i campioni per la lettura in piastra: - A1 e B1 = BIANCO -> 150 ul di DPPH 0,1 mM e 50 ul di H2O - A2 e B2 = SOLO DPPH -> 200 ul di DPPH 0,1 mM - A3-A12 e B3-B12 = campioni per i punti della curva -> 50 ul della curva di Trolox + 150 ul di DPPH 0,1 mM Aver cura di mescolare bene il contenuto dei pozzetti. Nell’esperienza si va ad analizzare l’attività anti-radicalica in vitro del Trolox. Si tratta di un antiossidante / antiradicalico scavenger, ossia di una specie che dona un suo elettrone alla specie radicalica riconvertendola nella forma stabile non radicalica. Nell’esperienza la specie radicalica è il DPPH. Il DPPH è un radicale dalla colorazione viola che vira al giallo quando viene stabilizzato da una specie antiradicalica, che nel nostro caso è il Trolox. Più la soluzione vira al giallo (ossia più è marcatamente gialla), più quantità di Trolox sta stabilizzando il DPPH. c. Avvolgere la piastra in alluminio ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in uno shaker. Leggere poi l’assorbanza a 517 nm. d. Su Excel calcolare la percentuale dell’attività anti-radicalica scavenging del Trolox con la formula  Nella costruzione della curva Trolox è stato scartato il valore di % di attività anti-radicalica relativo alla concentrazione di 4 ug/ml perchè, in fase di preparazione, il campione è stato inserito nel pozzetto errato e il risultato non risultava lineare. Nella costruzione della curva Trolox sono stati scartati i valori di % di attività anti-radicalica relativi alla concentrazione di 10 ug/ml e del bianco -> Molti valori di % di attività anti-radicalica infatti risultano essere negativi probabilmente perchè c’è stato un problema nella costruzione del bianco dovuto ad imprecisioni. La prima curva ottenuta considerando tutti i valori di concentrazione risulta essere logaritmica e non ci permette di ottenere un range di linearità: questo succede perchè a concentrazioni molto alte di Trolox il sistema si satura e la reazione va a plateau. È quindi necessario scartare i valori riguardanti concentrazioni all’incirca maggiori di 40 ug/ml. È possibile poi eseguire la media tra gli R^2 delle due curve ottenute per diminuire gli eventuali errori che possono essere stati commessi, anche se nel nostro caso la curva Trolox 1 risulta mostrare una maggiore linearità tra le concentrazioni di DDPH e la % dell’attività antiossidante del Trolox. Il valore di R^2 nei grafici avrebbe dovuto avvicinarsi il più possibile a 1 per ottenere linearità tra le concentrazioni crescenti di DPPH radicalico e l’attività antiossidante del Trolox. Il leggero discostamento dell’R^2 rispetto al valore desiderato dovrebbe essere legato al bianco per mancata precisione dei volumi prelevati.  ATTIVITA’ -> Studio del DPPH dell’attività antiossidante di estratti naturali ad uso nutraceutico. Valutazione dell’attività antiossidante 1. Calcolare la concentrazione di ciascun preparato di interesse nutraceutico 2. Per ogni composto preparare le seguenti diluizioni scalari -> 3. Caricare sulla piastra 96 wells i campioni per la lettura in piastra: - BIANCO -> 150 ul di DPPH 0,1 mM e 50 ul di H2O - SOLO DPPH -> 200 ul di DPPH 0,1 mM - tutti gli estratti delle diverse diluizioni = campioni per i punti della curva -> 50 ul del campione + 150 ul di DPPH 0,1 mM Aver cura di mescolare bene il contenuto dei pozzetti. 4. Avvolgere la piastra in alluminio ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in uno shaker. Leggere poi l’assorbanza a 517 nm. Dall’equazione della curva Trolox (abbiamo scelto la numero 5. Se Excel calcolare l’attività anti-radicalica scavenging degli estratti con la formula 1 perchè presentava un valore di R^2 più vicino a 1) si calcolano a quante unità equilaventi di Trolox corrisponde la % di attività antiossidante del DPPH ottenuta con i nostri estratti. -> IN QUESTO MODO SI PUO’ COMPRENDERE QUALE ESTRATTO HA LA MAGGIORA ATTIVITA’ ANTI- RADICALICA. Al 76% di olivo corrispondono 43 ug/ml di Trolox, quindi l’olivo è, tra gli estratti considerati, il più antiossidante.  ATTIVITA’ -> Studio di permeabilità in vitro tramite: - Dosaggio dei polifenoli - Saggio con piastra PERMEAPAD per la valutazione dell’assorbimento intestinale di polifenoli derivanti da diversi integratori ad uso nutraceutico. Dosaggio polifenoli 1. Preparare le diluizioni degli integratori in eppendorf da 1 ml. 2. Preparare le diluizioni dell’acido gallico partendo da uno stock 0,1% m/V inserendo le diluizioni in eppendorf d 1 ml. 3. Allestire la reazione -> In ogni eppendorf aggiungere: - 750 ul di H2O - 100 ul di Na2CO3 - 100 ul di standard o campione - 50 ul di Folin-Ciocateu -> Il reattivo Folin-Ciocateu viene aggiunto solo alla fine prima di far partire la reazione perchè esso reagisce con i polifenoli presenti negli integratori sviluppando una colorazione: il colore verde del reattivo vira al blu, la cui intensità é più marcata in funzione della quantità di polifenoli presente nel campione dell’integratore. Per il bianco aggiungere in provetta 850 ul di H2O, 100 ul di Na2CO3 20% e 50 ul di Folin-Ciocateu. 4. Incubare per 30 minuti: questo tempo é importante affinché la reazione indotta dal Folin-Ciocateu in presenza di polifenoli possa avvenire. Nel frattempo si può notare una colorarazione che vira man mano al blu più o meno intenso. 5. Trasferire 200 ul dalle eppendorf preparare in piastra ed effettuare la lettura allo spettrofotometro misurando l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 750 nm. 6. Su Excel calcolare la curva di taratura. 7. Dall’equazione della retta ricavare il valore di concentrazione dei polifenoli nei 3 integratori. L’integratore 1 ha la maggior concentrazione di polifenoli. L’integratore 2 ha una concentrazione intermedia di polifenoli. L’integratore 3 ha la minor concentrazione di polifenoli.  Valutazione dell’assorbimento di polifenoli contenuti all’interno di integratori ad uso nutraceutico tramite saggio con piastra PERMEAPAD. La piastra PERMEAPAD è composta da due piastre simili alle 96 wells appoggiate una sopra l’altra con nel mezzo una membrana biomimetica che mima la barriera intestinale: il fondale dei pozzetti della piastra sopra non è chiuso ma è composto da questa particolare membrana, la quale permette la comunicazione tra la zona di caricamento e la zona di prelievo. La piastra PERMEAPAD è un nuovo brevetto introdotto in commercio solo 5 anni fa. Per il caricamento dei campioni (detti accettori), questi vengono inseriti nella zona più grande (detta di caricamento), mentre il recupero della parte di campione che ha attraversato la membrana avviene dalla zona più piccola (detta di prelievo). Analizzando degli integratori con questo metodo è possibile osservare se l’integratore viene assorbito a livello intestinale e in che misura. 1. Caricare i 3 integratori nei 2 pozzetti donatori e caricare il buffer specifico per il saggio dei pozzetti accettori. 2. Si attende 1 ora -> Ciò che passa la membrana viene recuperato insieme alla soluzione disposta nel pozzetto accettore. 3. Si attendono 2 ore -> Ciò che passa la membrana viene recuperato insieme alla soluzione disposta nel pozzetto accettore. 4. Per ciasun integratore eseguire il saggio dei polifenoli come riportato nella pagina “Dosaggio polifenoli”. 5. Su Excel dedurre il valore di concentrazione dei polifenoli assorbiti per ciascun integratore al T1 e al T2. L’integratore 1 è quello che sia al T1 sia al T2 è meno assorbito, nonostante abbia la maggior quantità di polifenoli. Ha una percentuale di assorbito simile tra T1 e T2. L’integratore 2 è quello che viene più assorbito al T2. L’integratore 3 è quello che viene più assorbito al T1 tra i 3 integratori considerati, nonostante abbia una quantità di polifenoli più bassa.  L’assorbimento dei polifenoli contenuti negli integratori è altamente correlato agli eccipienti aggiunti nella preparazione: Inoltre, trattandosi di integratori nutraceutici, non è più il contenuto di eccipienti è elevato, più è elevata la richiesta una standardizzazione del prodotto: non siamo possibilità di interazione con i polifenoli limitandone quindi certi che la quantità e la percentuale di l’assorbimento. assorbimento dei polifenoli da noi calcolati essere contenuti nei 3 integratori sarà uguale anche per altre preparazioni degli stessi. A tal proposito l’integratore 1 ha un colore molto più scuro nella provetta iniziale, fatto che ci fa pensare che siano presenti molti più eccipienti rispetto agli altri 2 integratori: questo aspetto può in parte giustificare una minore percentuale di polifenoli assorbiti del primo integratore. Maggiore è la quantità di polifenoli presenti nel nutraceutico, maggiore importanza assume la diluzione che si deve operare sull’integratore per poter In laboratorio abbiamo anche notato che ogni analizzarlo al meglio. gruppo ha ottenuto risultati piuttosto diversi riguardo alla percentuale di polifenoli assorbiti tra i 3 integratori e ai due tempi. Si tratta infatti di un’esperienza molto soggetta alla variabilità di Il primo integratore è quello più ricco di polifenoli ed è stato operatore ed a possibili errori (mancato anche molto diluito (1:50 e 1:100), sarebbe comunque consigliato mescolamento delle soluzioni). ripetere l’esperienza aumentando ancora il fattore di diluizione. Questo permetterebbe di lavorare su una quantità minore di nutraceutico, ottenere una risoluzione di analisi maggiore ed un dato più sicuro e riproducibile. In generale la percentuale di polifenoli assorbiti per tutti e 3 gli integratori non va oltre il 2%, quindi comunque la maggior parte dei polifenoli contenuta negli integratori non viene assorbita.