Biología Molecular y Citogenética PDF

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Duplicación del material genético. Etapas de la síntesis proteica 6 / 1. Introducción y contextualización práctica 3 / 2. El proceso de replicación 4 / 3. La síntesis de proteínas 5 / 4. Caso práctico 1: “Edición o corrección del ARN” 5 / 5. La transcrip...

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Duplicación del material genético. Etapas de la síntesis proteica 6 / 1. Introducción y contextualización práctica 3 / 2. El proceso de replicación 4 / 3. La síntesis de proteínas 5 / 4. Caso práctico 1: “Edición o corrección del ARN” 5 / 5. La transcripción 6 / 6. Generalidades sobre la traducción 6 6.1. Fases de la traducción 8 / 7. Endonucleasas de restricción 8 / 8. Otras enzimas asociadas a los ácidos nucleicos I 9 8.1. Otras enzimas asociadas a los ácidos nucleicos II 9 / 9. Importancia en las técnicas de manipulación y análisis de moléculas de ADN 10 / 10. Un ejemplo destacado de la utilidad de las técnicas de biología molecular 11 / 11. Caso práctico 2: “Antibióticos inhibidores de la síntesis de proteínas” 11 / 12. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad 12 / 13. Bibliografía 12 © MEDAC 978-84-18864-26-1 Reservados todos los derechos. Queda rigurosamente prohibida, sin la autorización escrita de los titulares del copyright, bajo las sanciones establecidas en las leyes, la reproducción, transmisión y distribución total o parcial de esta obra por cualquier medio o procedimiento, incluidos la reprografía y el tratamiento informático. Conocer los procesos por los cuales el ADN se autoperpetúa. Aprender cuáles son las enzimas que participan en la replicación del ADN. Identificar los elementos y las partes que intervienen en la síntesis de proteínas. Comprender la importancia de estos fundamentos para entender cómo funcionan las técnicas de análisis de ácidos nucleicos. / 1. Introducción y contextualización práctica En este tema, aprenderemos los procesos por los cuales el ADN se duplica y replica en moléculas de ARN, que serán las encargadas de transportar el mensaje genético a los ribosomas para la síntesis proteica. La relevancia de esta unidad radica en la gran utilidad de conocer estos procesos para poder manipularlos y poder, asimismo, analizar y modificar los ácidos nucleicos con fines diagnósticos, terapéuticos y de producción industrial. A continuación, vamos a plantear un caso práctico a través del cual podremos aproximarnos de forma práctica a la teoría de este tema. Escucha el siguiente audio, donde planteamos la contextualización práctica. Encontrarás su resolución en el apartado «Resumen y resolución del caso práctico de la unidad». Fig. 1. Polirribosoma visto al microscopio electrónico Audio intro. Síntesis proteica https://bit.ly/2yEgSr7 TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA Biología molecular y citogenética /4 / 2. El proceso de replicación La replicación del ADN es el proceso a través del cual esta molécula se duplica. Lo podríamos definir como la copia del ADN «materno» para formar 2 moléculas de ADN «hijas», idénticas a su progenitora y, por lo tanto, idénticas entre sí. Existen unas características comunes a procariotas y eucariotas: • Es semiconservativa: en cada molécula hija, una de las hebras procede del ADN original que se ha replicado; pero la otra cadena es de nueva síntesis. • La replicación comienza en puntos de inicio concretos, donde el ADN se desenrolla, formando una estructura de bucle. Sus extremos se denominan horquillas de replicación. • Es bidireccional: tiene lugar en ambas hebras a la vez, y en cada una se dirige hacia los extremos. • Es semidiscontinua: desde el punto donde comienza a replicarse, tiene dos sentidos que tomar en la misma hebra: en el sentido 5’-3’, la replicación es normal (hebra conductora), pero en el sentido 3’-5’ lo hace de manera discontinua, formando los conocidos fragmentos de Okazaki. En este proceso, primero se separan las dos hebras de ADN en un punto concreto. Partiendo de ese punto central, se sintetizarán las nuevas cadenas hacia cada extremo del ADN, es decir, en el sentido de las horquillas de replicación. A continuación, se produce la replicación mediante las polimerasas (enzimas que sintetizan ácidos nucleicos, las estudiaremos en el apartado 8). En el punto donde comienza la replicación, se añade un cebador (secuencia corta de ARN), que actúa como «señal» para que dé comienzo la replicación. Cuando el sentido es 5’-3’, actúan normalmente partiendo del cebador inicial, pero si es 3’-5’, necesitan varios cebadores repartidos por la hebra de ADN que se va a replicar (sintetizando el nuevo ADN entre los cebadores). Así es como están formados los fragmentos de Okazaki, mediante cadenas híbridas de ARN (cebador) y ADN (nueva hebra sintetizada). Recuerda que el proceso mediante el cual se separan las hebras del ADN se conoce como fusión o desnaturalización y que, cuando se vuelven a emparejar, hablamos de hibridación o renaturalización. Recuerda... Existen unas características comunes entre procariotas y eucariotas. /5 TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional / 3. La síntesis de proteínas Es el proceso mediante el cual un gen codifica un polipéptido o proteína. Se distinguen dos etapas: 1. La información se transcribe del ADN (que no puede abandonar el núcleo celular) al ARN (que sí puede hacerlo). La transcripción la estudiaremos en el apartado 5. 2. La información se traduce del ARN a la proteína. La traducción la estudiaremos en el apartado 6. Esta relación direccional es conocida como dogma central de la biología molecular. Así, el primer paso nos permite trasladar la información genética (en el ADN) a un vehículo (el ARN) que pueda transportarla hasta los verdaderos productores de proteínas. Esto es preciso porque el ADN no abandona el núcleo celular, ya que se trata de una molécula demasiado grande e importante para hacerlo. Este ARN se conoce como ARN mensajero (ARNm). El ARNm podrá salir del núcleo, donde los ribosomas se unirán a él y comenzará la síntesis de proteínas con la ayuda del ARN transferente (ARNt). El ARNt transportará el aminoácido específico para la secuencia de 3 nucleótidos (triplete) que corresponda en el ARNm. Los ribosomas se encargarán de formar los enlaces peptídicos entre los diferentes aminoácidos, y así es como se traduce la información genética en proteínas. / 4. Caso práctico 1: “Edición o corrección del ARN” Planteamiento: El ARN, al igual que el ADN, sufre también ciertos procesos de edición o corrección. De hecho, hay un fenómeno que se conoce como edición del ARN, donde este se modifica una vez se ha transcrito desde la molécula de ADN Nudo: Como no deja de tratarse de mutaciones, nos interesa conocer y estudiar este proceso, ya que las repercusiones de las mismas pueden ser importantes. ¿Cuál crees que puede ser una de sus principales consecuencias? Recuerda que una de las moléculas de ARN que sufre esta edición es el ARN mensajero. Desenlace: Efectivamente, la edición del ARNm altera la secuencia de nucleótidos que se va a traducir en el orden que deben llevar los aminoácidos de una proteína. En consecuencia, puede producirse una proteína anómala que, en el mejor de lo casos, será afuncional, y, en el peor, provocará una enfermedad grave, como algún tipo de cáncer. Por ello, es importante conocer este proceso y sus consecuencias para realizar diagnósticos tempranos de enfermedades importantes. Es primordial no confundir la edición del ARN con la maduración del ARN, ilustrado en la figura de la derecha, siendo este último un proceso natural y necesario para la transcripción. Fig. 2. Maduración del ARN mensajero TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA Biología molecular y citogenética /6 / 5. La transcripción La transcripción en es un proceso, que tiene lugar en el núcleo, por el cual la secuencia de nucleótidos del ADN se copia a una molécula de ARN mensajero. Este proceso es asimétrico, ya que solo una de las hélices de DNA se usa como molde. El ARN recién transcrito se denomina precursor y debe madurar. La copia no es exactamente igual, debido a que en el ARN no existe la timina, por lo que en su lugar debe colocarse un uracilo. Aunque se tenga que dar este cambio, la información no se altera de ninguna forma. El fragmento de ADN constituye la llamada unidad de transcripción, que se compone de tres partes: el promotor (no se transcribe, solo indica donde debe comenzar el proceso y la hélice adecuada), la secuencia codificadora del ARN (parte que se copia a ARN) y el terminador (también se copia a ARN e indica el final de la transcripción). Para que la transcripción se de en el lugar adecuado, existen unas secuencias específicas, denominadas promotores eucarióticos, que son reconocidas por las ARN polimerasas (tres en eucariotas) y los factores transcripcionales. • El promotor eucariótico, en eucariotas son tres RNA polimerasas que transcriben diferentes genes. El encargado de los genes que codifican las proteínas es la ARN polimerasa II, que cuenta con los siguientes elementos: • Caja TATA: secuencia de siete pares de bases que se encuentran en prácticamente todos los genes de las células eucariotas. Su secuencia es TATAAAA y se localiza a una distancia de 30 pares de bases antes del punto de inicio de la transcripción. • Caja CAAT: su secuencia normal es GGCAATCT y se encuentra unos 100 pares de bases antes del punto de inicio. Fig. 3. Transcripción del ADN en ARN. • Intensificadores: modulan la transcripción a distancia para que los genes se expresen en el momento más adecuado. Las ARN polimerasas no se unen a ellos, pero son necesarios. Su localización es variada. • Factores transcripcionales: proteínas que facilitan la unión de la ARN polimerasa al ADN. Pueden ser generales (necesarios para que se produzca la transcripción) o específicos (influyen en la eficacia de la tasa de transcripción). / 6. Generalidades sobre la traducción La traducción consiste en sintetizar proteínas atendiendo a las instrucciones que contiene el ARNm. De hecho, conocemos como código genético al orden que existe entre las bases nitrogenadas del ARNm y la secuencia de aminoácidos en que este derivará. Como ya sabéis, tres nucleótidos codifican un determinado aminoácido. Esto es lo que se conoce como tripletes o codones. De esta manera, cada codón solo equivale a un aminoácido concreto, aunque un aminoácido puede ser codificado por diferentes codones. Por ello, se conoce que el código genético está «degenerado». Audio 1. Los ribosomas https://bit.ly/2yFuP8e TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional /7 Hay cuatro codones especiales, estos son: • AUG: además de codificar la Metionina, inicia la secuencia de traducción. • UAA, UAG y UGA: indican el final de la traducción. Primera letra U C UUC U Leu UUA UUG G Tercera letra Cys Phe UUU A Tyr UGU Ser UAU UGC UCU UAC ALTO UCC UCA ALTO UCG UAA UAG UGA U C A G Trp UGG Leu CUU C CUC CUA CUG His Pro CAU Arg CCU CAC CGU CGC CCC CCA Gln CGA CCG CAA CGG U C A G CAG lle AUU AUC A AUA Met AUG Val GUU G GUC GUA GUG Asn Ser Thr AAU AGU ACU AAC AGC ACA Lys Arg ACG AAA AGA AAG AGG ACC C A G Asp Ala GAU Gly GCU GAC GGU GGC GCC GCA Glu GGA GCG GAA GGG GAG Tabla. 1. Código genético U U C A G TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA Biología molecular y citogenética /8 6.1. Fases de la traducción El proceso de traducción consta de tres fases: 1. Fase de iniciación. Todo comienza con la subunidad menor de un ribosoma unida a un ARNt con el aminoácido Metionina. Entonces, llega la molécula de ARNm y la unidad menor se desplaza por él hasta que alcanza un codón AUG. Una vez ocurre esto, la subunidad mayor del ribosoma llega y se ensambla a la subunidad menor. Esta subunidad mayor tiene tres localizaciones (E, A y P), y el ARNt inicial queda ubicado en la localización «P». 2. Fase de elongación. Al sitio «A» se une un nuevo ARNt con el correspondiente aminoácido (según el siguiente codón en el ARNm). Entonces, la subunidad mayor se desplaza, pasando el ARNt del sitio «P» al «E», y el del «A» al «P», mientras que entre los dos aminoácidos se forma un enlace peptídico gracias a una enzima catalizada en la subunidad mayor del ribosoma. A continuación, la subunidad menor se desplaza en el mismo sentido que lo había hecho la mayor, desechando el primer ARNt que ya se ha separado de su aminoácido. Así queda de nuevo un ARNt con su aminoácido en el sitio «P», dejando «E» y «A» libres, para que, a continuación, otro ARNt traiga un nuevo aminoácido al sitio «A» y se vuelva a repetir este proceso. 3. Fase de terminación. El ribosoma llega a una de las secuencias de terminación, donde en lugar de acoplarse un aminoácido lo hacen proteínas conocidas como factores de terminación. Es aquí cuando se desprende la cadena polipeptídica y se separa el ARNm de la subunidad menor, y esta, a su vez, de la mayor. Este proceso no lo lleva a cabo habitualmente un único ribosoma, sino que lo realizan varios ribosomas simultáneamente. Recuerda... Todo comienza con la subunidad menor de un ribosoma unida a un ARNt con el aminoácido Metionina. / 7. Endonucleasas de restricción Las endonucleasas de restricción son enzimas bacterianas que cortan la molécula de ADN bicatenario en secuencias específicas, cortas, de unos 4-8 pares de bases y generalmente palindrómicas (se leen igual del derecho que del revés). Cada endonucleasa reconoce unos sitios de restricción concretos, dianas de restricción, siendo cada enzima diferente dependiendo de la especia bacteriana. En bacterias estas enzimas son un mecanismo de defensa frente al ADN vírico. Se pueden clasificar en endonucleasas que generan bordes cohesivos y en las que producen bordes romos: • Endonucleasas que generan bordes romos: cortan de manera simétrica el ADN, es decir, cortan las dos hebras a la misma altura en cada extremo. • Endonucleasas que generan bordes cohesivos: el corte es asimétrico. En cada hebra se corta a una altura diferente. Los extremos cohesivos son más útiles en clonación, ya que se mantienen juntos los fragmentos de ADN con mayor facilidad para que las enzimas ligasas los puedan unir, siendo más difícil para estas cuando los extremos son romos. /9 TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional Las utilidades al dominar esta técnica son innumerables: • Por ejemplo, esto nos permite cortar secuencias concretas de ADN, que contienen genes específicos, para trasladarlos a otros organismos. • En el ámbito sanitario, se emplean para determinar mutaciones o alteraciones en los cromosomas, pues se cortan regiones específicas de los mismos y se valora que tengan el tamaño adecuado (ya que, si los fragmentos de ADN son menores de lo esperado, significa que el paciente ha sufrido una deleción, es decir, una pérdida de material genético). • También podemos usar enzimas específicas para mutaciones conocidas, de tal manera que si aparece un fragmento de ADN mayor al que cabría esperar en una mutación, es debido a que el paciente está sano. Las enzimas de restricción se nombran con tres letras en cursiva, según la especie bacteriana de origen, y un número romano que corresponde al orden en el que se han ido aislando. Si encontramos una cuarta letra en mayúscula, es para concretar una cepa específica de dicha bacteria. Figura 4. Enzima de restricción que genera bordes cohesivos / 8. Otras enzimas asociadas a los ácidos nucleicos I Aunque las enzimas de restricción cobran una importancia notable en las técnicas de biología molecular, no hay que olvidar otras de gran interés, que son necesarias para llevar a cabo estos procedimientos. Entre todas se pueden realizar diversas ediciones del material génico. • Ligasas: son enzimas encargadas de unir los enlaces entre un grupo fosfato y un nucleótido, es decir, de unir dos fragmentos de una hebra de ADN o ARN. Se conocen fundamentalmente cuatro tipos, estando la ligasa tipo 1 implicada en la replicación, y las tipo 2, 3 y 4 en la reparación del ADN. • Polimerasas: se encargan de sintetizar cadenas de polinucleótidos a partir de una hebra molde. Añaden los nucleótidos complementarios a los de la cadena que emplean de referencia. Siguen el sentido 5’-3’ como, por ejemplo, ocurre en la replicación del ADN. 8.1. Otras enzimas asociadas a los ácidos nucleicos II Transcriptasas inversas o retrotranscriptasas: realizan el proceso inverso a la transcripción. Sintetizan una cadena de ADN a partir de una cadena molde de ARN. El ADN que se produce se conoce como ADN copia (ADNc). Es propio de los retrovirus, que transcriben su material genético (ARN) a ADN para incorporarlo en la célula huésped. Estas enzimas son fundamentales para poder amplificar ARN, porque no puede realizarse mediante las técnicas de PCR habituales (técnica para realizar copias de ADN, no de ARN; se estudiará con más profundidad en la unidad 14), por lo que este se transcribe a ADN (conocido como ADNc), que sí se puede amplificar mediante PCR. En este caso, hablamos de una RT-PCR. Topoisomerasas: su función es reducir la tensión a la que se ven sometidas las hebras de ADN bicatenario en las regiones próximas a las horquillas de replicación. TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA Biología molecular y citogenética / 10 / 9. Importancia en las técnicas de manipulación y análisis de moléculas de ADN Las diferentes técnicas de manipulación y análisis de ADN tienen como finalidad diagnosticar enfermedades y aprovechar los procesos de la biología molecular para nuestro beneficio. El análisis cromosómico nos permite diagnosticar alteraciones morfológicas y numéricas de los cromosomas, tales como la trisomía del 21 o el Síndrome de Down. Otras técnicas, como las ya citadas con enzimas de restricción, nos permiten manipular fragmentos de ADN para incorporarlos a nuevos organismos y permitir que estos produzcan sustancias que nos interesen, como el caso de la E. coli productora de insulina. La PCR es una técnica imprescindible en Biología Molecular que amplifica una cantidad, que en principio es insuficiente, de ADN para poder ser analizada (obteniendo, entonces, la cantidad suficiente). Con otras técnicas de secuenciación y análisis de ADN podemos conocer secuencias conocidas de nucleótidos que sean características de diferentes especies de microorganismos, facilitándonos de esta manera el diagnóstico microbiológico. Por supuesto, estas técnicas también se emplean mucho en análisis de paternidad y en Medicina Forense. Podríamos resumir las utilidades de la Biología Molecular como las siguientes: • Diagnóstico de enfermedades. • Producción industrial en Biotecnología. • Análisis de perfiles de expresión génica. • Identificación de microorganismos patógenos. • Detección de genes asociados a enfermedades genéticas y a cáncer. • Pruebas de paternidad. • Identificación de individuos en Medicina Forense. Fig. 5. Prueba de ADN para identificación de sospechoso en escena del crimen / 11 TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional / 10. Un ejemplo destacado de la utilidad de las técnicas de biología molecular La biotecnología consiste en aprovechar los procesos de la biología molecular para nuestro beneficio. Vamos a ver una de las mayores utilidades que tiene la manipulación de los ácidos nucleicos, la producción industrial de insulina. La insulina es una proteína que sintetizan las células de los islotes Beta del páncreas. Estas producen la insulina porque, en su ADN, tienen los codones correspondientes para que se sinteticen los aminoácidos en el orden apropiado que forma la molécula polipeptídica de insulina. Así, aislamos de una célula pancreática el fragmento de ADN que codifica la molécula de insulina, es decir, el gen de la insulina, gracias a la acción de las endonucleasas de restricción. A continuación, extraemos un plásmido (fragmento de ADN bacteriano) y se ensambla el gen de la insulina en el plásmido mediante la acción de las ADN ligasas, consiguiendo así que una bacteria produzca insulina humana. Fig. 6. Producción de insulina mediante biotecnología / 11. Caso práctico 2: “Antibióticos inhibidores de la síntesis de proteínas” Planteamiento: existe una serie de medicamentos que empleamos para eliminar las infecciones bacterianas. Se trata de los antibióticos. Es un grupo muy heterogéneo en lo que se refiere a su composición química y mecanismo de acción, que tienen como función común tratar las infecciones bacterianas. Al tomar unos grupos concretos de antibióticos, las bacterias mueren. Esto se debe a que no pueden desarrollar su metabolismo normal. Algunos antibióticos impiden que puedan sintetizar las proteínas adecuadas para su correcto funcionamiento y, de este modo, no matan directamente al germen, pero impiden su desarrollo, crecimiento y reproducción. Se conocen por ello como bacteriostáticos. Nudo: ¿qué puede ocurrir en las bacterias para que estos antibióticos impidan la síntesis proteica? Desenlace: estos medicamentos se dirigen a los ribosomas que, como ya sabes, son los orgánulos celulares encargados de realizar la síntesis proteica. Algunos inhibirán a la subunidad mayor, mientras que otros lo harán con la menor, provocando que la bacteria no pueda sintetizar proteínas y limite su crecimiento y desarrollo. De tal manera, se podrá controlar y solucionar la infección. TEMA 6. DUPLICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO. ETAPAS DE LA SÍNTESIS PROTEICA Biología molecular y citogenética / 12 / 12. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad Tras estudiar esta unidad, es fundamental conocer la replicación, es decir, la capacidad que tiene el ADN para duplicarse, así como la forma en que lo realiza, con la ayuda de cebadores de ARN que incorporan las primasas y con la síntesis de cadenas nuevas gracias a las ADN Polimerasas. Además, cabe destacar el concepto de «fragmentos de Okazaki», que son cadenas discontinuas entre cebadores de ARN que posibilitan trabajar a las polimerasas en el sentido correcto. La transcripción permitirá al ADN copiar la información que porta en el ARN para, así, llevar la secuencia de bases a los ribosomas y convertirla en una secuencia de aminoácidos, en el proceso conocido como traducción. Conociendo estos procesos y las enzimas que intervienen, podemos manipular los ácidos nucleicos para cortar, pegar y transcribir secuencias concretas de ácidos nucleicos, es decir, genes, en nuestro beneficio. Resolución del caso práctico de la unidad Para poder producir calcitonina en el laboratorio, necesitamos una maquinaria tan precisa y sofisticada, que solo la poseen las propias células. Por ello, vamos a tomar las células del tiroides y las vamos a cultivar en el laboratorio. Nuestra finalidad será extraer el fragmento de ADN que codifica para la síntesis de la calcitonina, es decir, queremos aislar el gen de la calcitonina. Para ello, deberemos emplear enzimas de restricción específicas que cortarán el ADN en los puntos apropiados para poder aislar la secuencia de bases del gen que estamos buscando. Una vez tengamos el gen separado del ADN, lo introduciremos en otra célula, por ejemplo, en la bacteria Escherichia coli: extraeremos un plásmido de la misma (fragmento de ADN) donde encaje nuestro gen para la calcitonina, uniremos ambos fragmentos con la ayuda de las ADN ligasas y lo reincorporaremos de nuevo a la bacteria. De esta manera, habremos conseguido que la E. coli produzca calcitonina para nosotros. / 13. Bibliografía García Gregorio, M., Papí, M. A. y Furió Egea, J. (2009). Biología, 2 bachillerato. Guía didáctica. Paterna: ECIR Gómez-Aguado, F., Lorenzo Luque, M. I., Simón Luis, F. y Hernández Giménez, B. (2015). Biología molecular y citogenética. Barcelona: Altamar. Caparrós Mota, M., Cuenca Pardo, J. B. y Sipán Sarrión, M. C. (2016). Biología molecular y citogenética. Madrid: Paraninfo. Khan Academy. «Genética molecular». Recuperado de: https://es.khanacademy.org/science/high-school-biology/hs-molecular-genetics RNA Editing. Recuperado de: https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/rna-editing Universidad de Cantabria. «Replicación del ADN». Recuperado de: https://ocw.unican.es/pluginfile.php/879/course/section/967/Tema%25207B-Bloque%2520IReplicacion.pdf