Biología Molecular y Citogenética PDF

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA El laboratorio de citogenética y cultivo celular 1 / 1. Introducción y contextualización práctica 3 / 2. ¿Qué es un laboratorio de citogenética y cultivo celular? 4 / 3. Instalaciones 4 / 4. Caso práctico 1: “Equipos de conservación” 5 / 5. Organigrama...

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA El laboratorio de citogenética y cultivo celular 1 / 1. Introducción y contextualización práctica 3 / 2. ¿Qué es un laboratorio de citogenética y cultivo celular? 4 / 3. Instalaciones 4 / 4. Caso práctico 1: “Equipos de conservación” 5 / 5. Organigrama 5 / 6. Área de procesado y bandeado 6 / 7. Área de microscopía y digitalización de imágenes 6 / 8. Personal y funciones 7 / 9. La Genética Médica 7 / 10. Catálogo de pruebas de citogenética de un hospital 8 / 11. Caso práctico 2: “Cómo detectar alteraciones cromosómicas” 9 / 12. Programas de formación 10 / 13. Gestión de la calidad 11 / 14. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad 12 / 15. Bibliografía 12 © MEDAC ISBN: 978-84-18864-26-1 Reservados todos los derechos. Queda rigurosamente prohibida, sin la autorización escrita de los titulares del copyright, bajo las sanciones establecidas en las leyes, la reproducción, transmisión y distribución total o parcial de esta obra por cualquier medio o procedimiento, incluidos la reprografía y el tratamiento informático. Conocer qué es un laboratorio de citogenética y cultivo celular. Distinguir qué diferencias hay entre estos dos tipos de laboratorio. Tomar contacto con la organización e instalaciones de dichos laboratorios. Aprender las funciones del personal de laboratorio. Comprender la importancia de la gestión de la calidad en los laboratorios de citogenética y cultivo celular. / 1. Introducción y contextualización práctica Todo técnico de Anatomía Patológica y Citodiagnóstico necesita diferenciar claramente el laboratorio de citogenética del de biología molecular y, del mismo modo, distinguir la sección de citogenética propiamente dicha de la de cultivo celular o tisular. En esta unidad nos centraremos en conocer las partes y funciones de estas últimas, las cuales cumplen una función crucial en el diagnóstico de cromosomopatías (alteraciones cromosómicas). A continuación, vamos a plantear un caso práctico a través del cual podremos aproximarnos de forma práctica a la teoría de este tema. Escucha el siguiente audio, donde planteamos la contextualización práctica. Encontrarás su resolución en el apartado «Resumen y resolución del caso práctico de la unidad». Fig. 1. Cultivos celulares Audio intro. Un estudio de cariotipo https://bit.ly/3eT60pM TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR Biología molecular y citogenética /4 / 2. ¿Qué es un laboratorio de citogenética y cultivo celular? El laboratorio de citogenética y cultivo celular es una instalación especializada dentro de los laboratorios de biología molecular. Actualmente, ha cobrado tal relevancia que precisa de un laboratorio especializado para sus técnicas. Cuenta, a su vez, con dos secciones bien diferenciadas: • Laboratorio de cultivos celulares: para conseguir el crecimiento de células eucariotas en medios artificiales hasta que son detenidas en mitosis. • Laboratorio de citogenética: donde se realizan los estudios de cromosomas metafásicos (recuerda que los estudiaremos en la unidad 7). Sus implicaciones clínicas las veremos en unidades siguientes, principalmente relacionadas con el diagnóstico de cromosomopatías. Audio 1. El laboratorio de citogenética y cultivo celular https://bit.ly/3eQdIky / 3. Instalaciones En un laboratorio de citogenética y cultivos celulares deben distinguirse tres salas: 1. Sala de cultivos o zona estéril Es la sala que requiere de mayor higiene y asepsia, es decir, debe estar libre de gérmenes, pues en ella se realizan los cultivos celulares, que se contaminan muy fácilmente (los hongos y bacterias que puedan contaminarlos crecen con mayor facilidad que las células del paciente, impidiendo que estas últimas se desarrollen). Lo ideal es que se encuentre aislada y que cuente con cabinas de flujo laminar, una ligera presión positiva, aire filtrado y temperatura regulada. Todo ello con el objetivo de garantizar la asepsia de las técnicas. 2. Salas de técnicas generales Es una sala (pueden ser diversas) en la que la esterilidad ya no es primordial. En ella se encuentra el equipamiento y los recursos para realizar las técnicas generales del laboratorio, es decir, el resto de técnicas excepto los cultivos celulares, como por ejemplo: cariotipos, tinciones, técnicas de citogenética molecular, etc. En ella se distingue una zona oscura para las técnicas de fluorescencia. Puede dividirse en secciones bien diferenciadas para cada tipo de técnica. 3. Sala de frío Instalaciones frigoríficas o con congeladores y equipos de criogenia para conservar las muestras. Sabías que... Las incubadoras de CO2 nos ofrecen las condiciones ambientales óptimas para el correcto desarrollo de los cultivos celulares. /5 TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional / 4. Caso práctico 1: “Equipos de conservación” Planteamiento: A la hora de comprobar que contamos con todo el equipamiento necesario para montar un laboratorio de citogenética y cultivos celulares, necesitamos conocer si disponemos del equipo adecuado de conservación de muestras y reactivos. Nudo: La cuestión es, ¿qué equipos de conservación se precisan en dicho laboratorio? Desenlace: En estos laboratorios se debe contar con tanques de nitrógeno líquido, ya que permiten conservar las muestras durante años porque se mantienen por debajo de los -100º C. En cambio, para los reactivos, con neveras y congeladores de laboratorio ya será suficiente para conservarlos. Los cultivos celulares se mantienen menos tiempo en los congeladores debido a que no alcanzan temperaturas tan bajas como los tanques de nitrógeno líquido, donde la congelación es más rápida y el tamaño de los cristales de hielo formados es menor, dañando menos la estructura celular. Por supuesto, para proteger las células del duro proceso de congelación, los medios de cultivo deben llevar incorporados un crioprotector como dimetilsulfóxido al 10 % o glicerol. / 5. Organigrama Consiste en un esquema que refleja la jerarquía que existe entre los diferentes integrantes del personal de un laboratorio, así como el flujo de trabajo e información que se establece sobre los procedimientos que en él se desarrollan. De esta manera, se refleja cuál es el grado de responsabilidad de cada profesional y con qué otros miembros está en contacto directo. En la cúspide encontramos un director de laboratorio o jefe de servicio, cuya función es coordinar el resto de secciones y trabajadores del laboratorio. También atiende directamente a los clientes y pacientes si es preciso, realiza la validación de las técnicas y calibración del instrumental del laboratorio (si es necesario), y relaciona diferentes técnicas que se usan en un protocolo común. Sus funciones se resumen en coordinar y garantizar la calidad de las pruebas. Inmediatamente por debajo del director de laboratorio o jefe de servicio, tenemos al coordinador de área o jefe de sección. Estos se disponen en cada sección, controlando los procedimientos y el personal correspondiente a unas muestras o técnicas determinadas, supervisando así los procesos analíticos y realizando labores de valoración de los estudios mediante la elaboración de informes. Sus funciones son validar las técnicas y coordinar al personal humano responsable de las mismas. Por debajo de este, tenemos al coordinador técnico, encargado de supervisar a los técnicos que reciben y procesan las muestras, así como de la gestión del stock de los productos del laboratorio. Coordina directamente a los técnicos de laboratorio. Finalmente, tenemos a los técnicos, que son quienes habitualmente realizan las técnicas y procedimientos, aunque no son los únicos, ya que algunas técnicas las realizan los facultativos por la experiencia requerida para ello o por la responsabilidad que acarrea su procesado. Jefe de servicio Jefe de área Coordinador técnico Técnicos Fig. 2. Organización general de un laboratorio hospitalario TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR Biología molecular y citogenética /6 / 6. Área de procesado y bandeado Corresponde al área inmediatamente próxima a la sección de cultivos celulares, es decir, al área de técnicas generales. Recordemos que los cultivos se debían preparar en una zona estéril. Una vez están listos, debemos procesar las muestras, se llevan a esta zona para ello. Aquí se realizará el procesado de los cromosomas a partir del sacrificio celular del cultivo y la extensión del mismo en un portaobjetos, para posteriormente realizar la tinción con colorantes específicos como orceína y Giemsa u otras técnicas como el bandeo cromosómico. El bandeo es otra de las técnicas que se desarrollan en esta sección, y supone un tipo particular de tinción donde se da color a diferentes bandas claras y oscuras en los brazos del cromosoma. Estas bandas sirven para distinguir anomalías en los cromosomas, ya que existe un código para referirnos a cualquier banda o subbanda obtenida por esta técnica. Por supuesto, cada banda contiene unos genes concretos. Las regiones se enumeran a partir del centrómero. / 7. Área de microscopía y digitalización de imágenes Esta zona pertenece a la sección de técnicas generales. Se contempla como parte de la zona en la que se procesan las muestras, aunque es una sección diferente, ya que previamente hemos procesado las muestras y han quedado dispuestas para ser evaluadas por el facultativo. El facultativo debe emitir un informe y, para facilitar su trabajo y realizar un registro de las muestras, es preferible contar con un sistema de digitalización de imágenes. Esto permite al facultativo visualizar las muestras de una manera más sencilla y, a su vez, conservar un gran banco de imágenes de cara a futuras revisiones, docencia o investigación. El mundo de la microscopía es muy amplio y existen diferentes variedades de microscopios. En el laboratorio de citogenética se emplean los microscopios ópticos, tanto los de luz transmitida (digamos, el convencional) como los de luz reflejada (por ejemplo, los microscopios de fluorescencia). La muestra se prepara mediante los procesos de fijación, deshidratación, inclusión, corte y tinción para poder observarse al microscopio. Estos procesos se deben realizar en muestras incluidas en parafina, generalmente para el laboratorio de anatomía patológica, mientras que, en otros campos como la citología o la citogenética, basta con fijar y teñir la muestra. Una vez la muestra está debidamente procesada, pasa a ser observada al microscopio y, mediante un software específico, se almacena en la base de datos de un ordenador. Los softwares específicos permiten almacenar, analizar y editar las imágenes. En el tema correspondiente del módulo Técnicas Generales de Laboratorio se ahondará más sobre los diferentes tipos de microscopía y digitalización de imágenes. Sabías que... Una de las grandes ventajas de la digitalización de imágenes ha sido poder compartirlas con otros profesionales en cualquier parte del mundo. TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional /7 / 8. Personal y funciones Como hemos explicado en el apartado de Organigrama, en el laboratorio de citogenética tendremos distintos profesionales que realizarán una función específica. Distinguiremos, fundamentalmente, entre técnicos y facultativos. Los técnicos realizan las técnicas de cultivo, procesado, tinción y montaje de las muestras, así como otras labores auxiliares en su servicio relacionadas con el stock y la elaboración de listados de productos empleados, agotados, etc. En resumen, se encargan de realizar las técnicas del laboratorio. Los facultativos, en cambio, no realizan las técnicas, sino que se encargan de que el aparataje esté debidamente calibrado (también pueden realizarlo los técnicos) y de valorar las técnicas realizadas. Avalan que los resultados sean fiables bajo su criterio y emiten informes que después otros profesionales clínicos necesitan para poder hacer diagnósticos concretos. En muchas ocasiones, el diagnóstico ya viene planteado desde el mismo laboratorio por el facultativo en cuestión. Aunque hay algunas excepciones y variaciones, el personal técnico está formado por técnicos superiores en Anatomía Patológica y Citodiagnóstico o Laboratorio Clínico y Biomédico; por otro lado, los facultativos son Médicos, Farmacéuticos, Químicos, Bioquímicos o Biólogos que acceden por oposición al puesto de F.E.A., acrónimo de Facultativo Especialista de Área. Habitualmente son Analistas Clínicos o Bioquímicos Clínicos. Fig. 3. Técnicos especialistas en laboratorio / 9. La Genética Médica La Genética Médica es la rama de la genética que se encarga del diagnóstico de las alteraciones producidas en los genes. Dentro de esta ciencia se encuentra la citogenética, pues su misión es diagnosticar cromosomopatías en los pacientes. Aun así, la Genética Médica engloba otras técnicas y ramas de la biología molecular, como las técnicas de PCR, clonación y secuenciación de ADN (que estudiaremos en próximas unidades) para encontrar alteraciones y mutaciones en el material genético. Cada vez cobran más importancia las secciones de genética médica en los hospitales, no solo como parte del laboratorio especializado en técnicas de biología molecular y citogenética, sino también como unidades médicas donde se ofrece asesoramiento y consejo genético. Es decir, en ellos se estudian las familias en las que hay probabilidades de padecer patologías genéticas porque existen antecedentes o viceversa (a partir de una patología genética diagnosticada se buscan antecedentes que hayan podido pasar desapercibidos en la familia). Genética Médica Consejo Genética Consulta Médica Fig. 4. Principales funciones del servicio de Genética Médica Pruebas de Biología Molecular y Citogenética TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR Biología molecular y citogenética /8 / 10. Catálogo de pruebas de citogenética de un hospital En un hospital regional debe haber un laboratorio orientado a la genética, la biología molecular y la citogenética y cultivos celulares. En ellos, se realizan los procedimientos que ya hemos descrito, destacando, sobre todo, aquellos enfocados a poder observar al microscopio óptico el cariotipo mediante su tinción o mediante fluorescencia para resaltar regiones concretas de los mismos (una vez han sido marcados con sustancias fluorescentes). Como ya estudiaremos en unidades posteriores, el cariotipo es el complemento cromosómico de un individuo que viene definido por las características morfológicas y numéricas de sus cromosomas (la máxima expresión del empaquetamiento del ADN) en metafase mitótica, mientras que la hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica basada en la detección y localización de una secuencia de ADN específica en un cromosoma. Para poder tener una idea más representativa de los procesos que se desarrollan en un laboratorio de citogenética, observad la imagen. Es un catálogo de los procedimientos que se realizan en el Hospital Central de Asturias, el cual se puede consultar de manera libre a través del siguiente enlace: http://www.hca.es/huca/web/contenidos/websdepartam/Cartera%20Laboratorios/citogenetica.pdf Fig. 5. Catálogo de pruebas del laboratorio de citogenética del Hospital Central de Asturias /9 TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional / 11. Caso práctico 2: “Cómo detectar alteraciones cromosómicas” Planteamiento: Tras haber conocido más a fondo los cromosomas y los procesos que se realizan en un laboratorio de citogenética y cultivos celulares, ya debemos saber cómo se detectan las alteraciones cromosómicas. Nudo: Así pues, ¿qué pasos llevaríamos a cabo para realizar el análisis de un cariotipo en un laboratorio de citogenética y cultivos celulares? Desenlace: Lo primero sería recibir la muestra biológica, por ejemplo, de sangre, y cultivarla en medios de cultivo apropiados para el crecimiento de la misma. Estos medios se enriquecen con nutrientes, hormonas y factores de crecimiento para que las células eucariotas (en este caso linfocitos) crezcan y se desarrollen sin problemas, todo ello en condiciones controladas de humedad, temperatura, etc. Cuando las células han crecido y se han desarrollado, se detiene la división celular y se añade cloruro potásico (KCl) para que las células se hinchen, esto hará que se observen mejor al microscopio. Finalmente, solo queda preparar una extensión en un portaobjetos, teñirla y estudiarla. Toma de muestra Cultivo celular Detención de división celular Adición de KCl Extensión en portaobjetos Tinción Observción al microscopio Fig. 6. Esquema del procesamiento cromosómico TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR Biología molecular y citogenética / 10 / 12. Programas de formación En cualquier laboratorio clínico se trabaja con muestras humanas, las cuales deben procesarse con la mayor profesionalidad, eficacia y eficiencia posible, para lo cual el personal debe estar perfectamente capacitado. Es fundamental que todo profesional que trabaje en el laboratorio esté acreditado como tal y es muy recomendable que, además, cuente con formación continuada para ampliar conocimientos y especializarse en secciones o técnicas concretas. Además de esto, el laboratorio debe contar con protocolos normalizados de trabajo (PNT), los cuales el Instituto Nacional de Seguridad y Salud en el Trabajo define como: «...documentos escritos que describen la secuencia específica de operaciones y métodos que deben aplicarse en el laboratorio para una finalidad determinada. Proporcionan una manera única según la cual deberá realizarse la operación cada vez que se repita en el laboratorio. Son los documentos complementarios al Manual de Calidad cuya finalidad fundamental es establecer cómo, quién, y cuándo debe realizarse una actividad allí prevista.» Los laboratorios deben contar con un programa de formación para tener a sus empleados actualizados en el uso de sus aparatos y en las nuevas técnicas que puedan introducirse, así como en posibles variaciones de las ya empleadas. Es decir, mantenerlos reciclados. Otro aspecto importante, es formar debidamente a las nuevas incorporaciones o a los técnicos en sus prácticas de formación profesional (FCT), de manera que pasen por etapas en las que las responsabilidades crezcan gradualmente hasta que adquieran las destrezas necesarias para dominar ellos mismos las técnicas o la sección en cuestión. PNT Procesos Normalizados de Trabajo actualizados. Formación continuada Cursos reglados, sesiones de actualización, congresos, seminarios, etc. Alumnos/trabajadores en prácticas Evaluación de las competencias y responsabilidades, en orden creciente; primero tutelados y finalmente de manera autónoma. Tabla. 1. Programas de formación. / 11 TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional / 13. Gestión de la calidad Pese a no ser uno de los aspectos más llamativos a la hora de trabajar en un laboratorio, es el más importante. La calidad es la confianza que tenemos en que unos resultados son fieles a la realidad. De esta manera, un laboratorio con un alto nivel de calidad nos proporciona la seguridad y la tranquilidad de saber que sus resultados son de confianza y el F.E.A. (Facultativo Especialista de Área) podrá elaborar informes fiables para que el clínico emita diagnósticos acertados. Se distinguen tres fases en la calidad de un laboratorio: • Fase preanalítica Contempla todos aquellos procesos desde que se solicita la muestra hasta que se pone a disposición del procesado de la misma, es decir: la solicitud del análisis, la toma de la muestra, el envío al laboratorio, su codificación y etiquetado y su almacenaje. En esta fase, los responsables son todos aquellos que participan en dichos procesos: médico solicitante, cirujanos y enfermeros, celadores y técnicos de laboratorio. • Fase analítica Corresponde a todas las técnicas mediante las que se procesa la muestra. Contempla un método de trabajo estandarizado (PNT), unos aparatos calibrados y una higiene y seguridad en el trabajo apropiados. Esta fase es responsabilidad del técnico. • Fase postanalítica Aquellos procesos que implican informar de los datos obtenidos en el laboratorio, es decir, elaborar informes claros, sin que quepa en ellos duda alguna, presentados en las unidades de medida que corresponda y con la confidencialidad que se requiere. La gestión de residuos del laboratorio también se considera de la fase postanalítica. En esta fase la responsabilidad se divide entre el técnico y el F.E.A. Fase preanalítica Toma de las muestras, traslado y registro en el laboratorio Fase analítica Procedimientos analíticos Fase postanalítica Informe de los resultados y gestión de residuos Fig. 7. Fases de la gestión de calidad en un laboratorio TEMA 1. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVO CELULAR Biología molecular y citogenética / 12 / 14. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad En esta unidad hemos conocido que existen dos secciones en los laboratorios de citogenética: la de citogenética propiamente dicha y la de cultivos celulares. Estos últimos son muy delicados, pues requieren de una especial asepsia, debido a la facilidad con la que sufren contaminaciones y crecen microorganismos como bacterias y hongos en lugar de las células de estudio. Por ello, se divide en el área estéril, para los cultivos; el área de procesado de muestras, para el resto de las técnicas; y el área de frío, para mantener refrigeradas y así poder conservar los reactivos y muestras. A su vez, en los laboratorios encontramos una clara jerarquía, con el jefe de servicio (para coordinar el laboratorio), el jefe de área (para coordinar su sección), el coordinador técnico (para coordinar a los técnicos) y los técnicos (para realizar los procedimientos); todo ello en el contexto de un ambiente de trabajo con los debidos planes de formación para mantener actualizado a su equipo de trabajadores y unos estrictos controles de calidad que garanticen la fiabilidad de los resultados obtenidos. Resolución del caso práctico de la unidad Para realizar un estudio citogenético, la muestra en cuestión tiene que recorrer un largo camino hasta que se elabora su informe correspondiente. Primero, un enfermero o médico debe extraer la muestra. Un celador la debe etiquetar correctamente y la debe enviar al laboratorio. Hasta aquí la fase preanalítica, que depende de los médicos, enfermeros y celadores. Una vez en el laboratorio, se procede a su codificación para que sea totalmente confidencial. A continuación, pasa a la zona estéril, donde se cultivan las células en las condiciones apropiadas. Llegado el momento, el cultivo pasa a la zona de procesado, donde se realizan la extensión de la misma y su tinción convencional (fluorescente o bandeado) para pasar después a ser montada y observarse al microscopio. Hasta aquí la fase analítica, a cargo de los técnicos. Finalmente, el F.E.A. la evalúa y emite el informe pertinente que llega hasta el médico solicitante de dicha prueba, finalizando la última etapa del control de calidad, la fase postanalítica. / 15. Bibliografía Caparrós Mota, M., Cuenca Pardo, J. B. y Sipán Sarrión, M. C. (2016). Biología molecular y citogenética. Madrid: Paraninfo. Martí Veciana, A. (1999). «NTP 508: Aseguramiento de la calidad en los laboratorios de higiene industrial: procedimientos normalizados de trabajo (PNT)». Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Recuperado de: https://www.insst.es/documents/94886/327064/ntp_508.pdf/ae8328ac-ec17-4a04-b7de-24b4442a14d2 Mérida F. J. y Moreno, E. E. (2015). Manual para técnico superior de laboratorio clínico y biomédico. Módulo III: biología molecular y citogenética. Madrid: Médica Panamericana. Gómez-Aguado, F., Lorenzo Luque, M. I., Simón Luis, F. y Hernández Giménez, B. (2015). Biología molecular y citogenética. Barcelona: Altamar. Ponsoda Ayala, M. (2015). Técnicas generales de laboratorio. Madrid: Paraninfo.