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Il benzopirene è continuamente inalato, venendo prodotto dalla combustione incompleta di combustibili organici (sigarette, carburanti, etc.). METABOLISMO DELL’ALCOOL ETILICO L’alcol etilico viene assorbito a livello dello stomaco, passa in circolo agisce anche a livello del SNC; il 5% del carico v...

Il benzopirene è continuamente inalato, venendo prodotto dalla combustione incompleta di combustibili organici (sigarette, carburanti, etc.). METABOLISMO DELL’ALCOOL ETILICO L’alcol etilico viene assorbito a livello dello stomaco, passa in circolo agisce anche a livello del SNC; il 5% del carico viene eliminato con le urine, la respirazione e con la traspirazione cutanea, mentre il 95% è metabolizzato dal fegato (non a caso è l’organo che subisce le principali conseguenze dell’abuso di alcool acuto e cronico). INTOSSICAZIONE ACUTA (80G DI ETANOLO AL GIORNO) Per ingestione di forti dosi di alcol si possono avere una serie di sintomi che vanno dalla semplice ebbrezza al coma. Fatta eccezione per i casi più gravi, l’intossicazione acuta (sbornia, ubriacatura) si risolve spontaneamente entro le 12-24 ore. La depressione respiratoria con perdita di conoscenza è un’eventualità fatale, che dipende dalla quantità di alcol ingerita, ma anche dalla tolleranza dell’individuo (adattamento indotto dall’assunzione precedente della sostanza). INTOSSICAZIONE CRONICA (55 G DI ETANOLO AL GIORNO) Quando l’assunzione di alcool è costantemente eccessiva e prolungata (quotidianamente ma anche saltuaria), si manifestano nell’arco degli anni una serie di effetti tossici a carico di tutto l’organismo. Molti dei danni causati dall’abuso di alcol non sono reversibili, cioè non guariscono una volta che ci si è disintossicati (a differenza delle conseguenze dell’intossicazione acuta). SINTOMI ASSOCIATI ALLE DIVERSE CONCENTRAZIONI EMATICHE DI ALCOOL 80-100 mg/dl: dose limite legale per guida di veicoli. 200 mg/dl causano ebbrezza in un bevitore occasionale. 300-400 mg/dl causano coma e morte in bevitore occasionale. 700 mg/dl: dose tollerata da un alcolista che abbia aumentato di 10 volte il suo livello di P450 (CYP2E1) per induzione. L’etanolo è principalmente substrato dell’enzima alcool deidrogenasi (ADH), espresso negli epatociti, che lo ossida in acetaldeide (MEOS), a partire direttamente dalla mucosa gastrica e continuando poi nel fegato. L’acetaldeide è pericolosa e deve essere eliminata il prima possibile: in un sistema efficiente l’acetaldeide deidrogenasi (ALDH) rapidamente la smaltisce in acido acetico. In concentrazioni basse di etanolo, solo una 20 piccola quantità dell’etanolo è metabolizzata dal citocromo P450 (CYP2E1), mentre assume un ruolo preponderante quando ne sono assunte grandi quantità. JAPANESE FLUSH SYNDROME Reazione istaminica dovuta all’accumulo di acetaldeide particolarmente frequente nelle popolazioni asiatiche in relazione ad una maggiore attività di ADH non bilanciata o addirittura associata ad una diminuita attività dell’ALDH. 14 marzo 2024 Soggetti Carico Via metabolica Sani Normale ADH 90%, MEOS 8%, CATALISI 2% Sani Acuto MEOS 25% Alcolisti cronici Normale per un alcolista MEOS 50% Sono gli intermedi del metabolismo dell’etanolo gli artefici della sua tossicità, in particolare nell’assunzione cronica e acuta si ha l’accumulo di intermedi tossici, soprattutto a livello epatico (dove queste reazioni hanno luogo). Tutte le reazioni che hanno come substrato l’etanolo hanno in comune l’acetaldeide come prodotto. Nella reazione catalizzata dal citocromo, tuttavia, prevedendo trasferimenti elettronici, viene prodotta una certa quantità di ROS e si consuma NADPH. Durante l’assunzione acuta, quindi, si hanno quindi accumulo di ROS, acetaldeide e deplezione di NADPH: l’aumento di attività del MEOS fa sì che vengano prodotti più intermedi tossici. L’ etanolo, in elevate quantità, compete con gli altri substrati di CYP2E1 (farmaci, anestetici, cancerogeni) e ne ritarda il catabolismo, potenziando gli effetti tossici. STEATOSI O DEGENERAZIONE GRASSA Accumulo abnorme di trigliceridi nelle cellule parenchimali. Il fegato, maggiormente coinvolto nel metabolismo degli acidi grassi, è più soggetto a steatosi, si può tuttavia sviluppare anche in cuore, muscoli e reni (non solo per l’assunzione di etanolo). 21 Le cellule del fegato sono metabolicamente molto attive: oltre alla produzione di bile e di detossificazione del sangue, è responsabile anche della produzione della gran parte delle proteine plasmatiche come il sistema del complemento, infiammatorie, albumina, etc. La disomogeneità di colorazione dipende quindi dal fatto che nel citoplasma di queste cellule c’è un grande sviluppo di membrane, come il RE dove sono associati i ribosomi per la produzione di proteine o il Golgi per la loro modifica post-traduzionale. Nelle cellule in steatosi le bolle di trigliceridi occupano quasi completamente il citoplasma e comprimono il nucleo, sottoponendo la cellula ad un grande stress meccanico (finché il nucleo è visibile la cellula non è morta). Se il soggetto interrompe l’assunzione di alcol, le cellule sono in grado di smaltire questi depositi e recuperare funzionalità. Il fegato è implicato nella biosintesi, smistamento e catalisi degli acidi grassi. In particolare: Riceve i grassi assunti con la dieta sotto forma di chilomicroni, particelle che si formano durante il processo digestivo che contengono colesterolo, trigliceridi e una componente proteica. Riceve i lipidi mobilizzati dai depositi. I chilomicroni sono idrolizzati nel fegato per liberare i lipidi in essi immagazzinato, essi possono essere indirizzati a: Turnover dei fosfolipidi di membrana Produzione di energia Altri distretti corporei sotto forma di apo-lipoproteine associate come LDL (low-density lipoprotein) L’accumulo anomalo di lipidi è causato da un difetto nello smistamento di questi lipidi. Questo può essere causato da problemi nella sintesi delle proteine trasportatrici. Un’altra causa è una mancanza di efficienza nell’ossidazione (utilizzo) dei lipidi. Il metabolismo dell’etanolo è direttamente responsabile della maggior parte dei suoi effetti tossici. Il 95% dell’etanolo ingerito viene ossidato e l’85% è ossidato negli epatociti. 1. L’etanolo è detossificato dalla ADH citosolica e dal MEOS del reticolo endoplasmatico liscio, che lo convertono in acetaldeide. 2. NAD+ è il coenzima assolutamente necessario per la conversione dell’etanolo ad acetaldeide da parte della ADH e da acetaldeide ad acetato da parte della ALDH. 3. L’acetaldeide, più tossica dell’etanolo, viene rapidamente convertita ad acetato dalla aldeide deidrogenasi mitocondriale, ALDH. 22 Una molecola di NAD+ viene usata per convertire l’etanolo ad acetaldeide ed una per convertire l’acetaldeide ad acetato. 𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙𝑜 + 𝑁𝐴𝐷 + → 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑎𝑙𝑑𝑒𝑖𝑑𝑒 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑎𝑙𝑑𝑒𝑖𝑑𝑒 + 𝑁𝐴𝐷 + → 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 Queste reazioni: Aumentano il rapporto NADH/NAD inibisce la β-ossidazione (catalisi dei lipidi) e ciclo di Krebs. Portano ad un accumulo di acetato, che stimola la sintesi di trigliceridi. L‘acetaldeide è tossica e danneggia le membrane biologiche, ciò causa: o A livello delle membrane del RER diminuzione della sintesi delle apolipoproteine. o A livello delle membrane mitocondriali perdita di funzione con diminuita β-ossidazione degli acidi grassi e diminuzione della produzione di ATP. o Inibizione la sintesi proteica. L’alcolismo è la maggior causa di steatosi epatica nel mondo “più progredito”. Può essere aggravato da diete iperlipidiche o ipercaloriche. Infatti, un eccessivo apporto di grassi satura la capacità metabolica del fegato ed i grassi si depositano sotto forma di trigliceridi non solo nel tessuto adiposo (di riserva), ma anche nel fegato, cuore etc. La steatosi si manifesta ogni qualvolta vengano inibite le vie di smaltimento dei grassi: Inibizione della β-ossidazione degli acidi grassi via il ciclo di Krebs che avviene nei mitocondri. Ogni danno della fisiologia mitocondriale porta con sé steatosi Scarso/mancato apporto di proteine ed amminoacidi ad es. per alimentazione insufficiente (da fame, da alcolismo elevato che genera inappetenza, da diete sbilanciate). Diminuisce la sintesi di apo- lipoproteine che servono all’assemblaggio delle lipoproteine che portano fuori i lipidi dal fegato. Da inibizione della sintesi proteica per intossicazione o per infezione virale con uno o più dei vari virus dell’epatite (A,B,C etc.). Da intossicazione con sostanze che provocano la formazione nel fegato di ROS, che a loro volta causano perossidazione lipidica e danni alle altre classi di macromolecole. L’aflatossina B è una tossina prodotta dai funghi Aspergillus flavus e A. parasiticus che viene metabolizzata dal CytP450 e forma un epossido, precursore del benzopirene, composto in grado di formare addotti al DNA → potere mutageno. Può formarsi in derrate alimentari, in particolare cereali, conservate in ambienti con scarsa aerazione e alta umidità. I livelli di aflatossina sono rilevabili con kit commerciali. A livello epatico l’etanolo causa, oltre alla steatosi, anche epatite acuta o cirrosi, condizioni gradualmente più gravi che si verificano in base alla quantità e la regolarità con cui esso è assunto. Alla base di queste condizioni vi è la necrosi (morte cellulare), che libera sostanze dannose nello spazio intercellulare. Negli alcolisti cronici si sviluppa un danno epatico irreversibile o cirrosi alcolica caratterizzata da: Massiccia morte per necrosi delle cellule epatiche Sovvertimento dell’architettura lobulare del fegato a causa di un processo fibrotico che interessa l’intero organo (processo cicatriziale) e che è disposto in modo disordinato. Il sistema immunitario ripulisce il tessuto necrotico e i fibroblasti lo sostituiscono con tessuto fibrotico (materiale acellulare, cicatriziale). TOSSICITÀ DIRETTA DA CHIMICI Sostanze patogene che agiscono come tali: bloccano direttamente processi alla base della sopravvivenza cellulare. 23 AVVELENAMENTO DA CO (MONOSSIDO DI CARBONIO) Il monossido di carbonio è un prodotto di combustione incompleta dei combustibili organici (carbone, olio, legno, carburanti, sigarette, etc.). È inodore, insapore, incolore. Il target del CO è la molecola di emoglobina. Ogni molecola di emoglobina è tetramerica e ognuna delle 4 globine possiede un gruppo eme in grado di legare l’ossigeno. È una proteina allosterica: il legame con un atomo di ossigeno (nei polmoni) rende gli altri siti ancora più affini ad esso, al contrario la perdita di un atomo di ossigeno (nei tessuti periferici) fa sì che anche gli altri atomi di ossigeno vengano liberati. Il monossido di carbonio è tossico perché legandosi saldamente agli atomi di ferro nell'emoglobina del sangue forma un complesso molto più stabile dell'ossiemoglobina; inoltre, l'affinità dell'emoglobina verso il CO è 200 volte quella verso l'ossigeno. La formazione di questo complesso fa sì che l'emoglobina sia satura di CO e che sia quindi incapace di distribuire l'ossigeno al corpo, questo causa una deficienza di ossigeno. Anche basse esposizioni al monossido di carbonio possono ridurre la concentrazione di ossigeno nel cervello al punto che la vittima diventa incosciente e muore poi di asfissia: il cervello è il primo organo ad essere colpito in quanto molto energivoro (consumo di ATP) e dipendente dalla glicolisi (i neuroni non ossidano i grassi). La grande affinità del CO per l’emoglobina fa sì che si leghi ad essa anche in piccolissime quantità, e vi può rimanere fino alla morte del globulo rosso (120 giorni ca). 19 marzo 2024 AVVELENAMENTO DA CN- (CIANURO) Il cianuro deriva dalla dissociazione dell’acido cianidrico o di un suo sale, è prodotto da alcuni batteri, funghi e piante. Può essere inalato o ingerito. Funziona come inibitore della citocromo ossidasi mitocondriale formando con il rispettivo gruppo eme un complesso relativamente stabile. Viene così impedito il rilascio dell'ossigeno da parte dell'emoglobina al sistema di trasporto degli elettroni → Sangue venoso di color brillante. I primi sintomi sono: cefalea, vertigine, bruciore alla bocca e alla faringe, tachicardia, nausea, vomito e dolore ai muscoli. In seguito, i segni clinici si fanno più gravi: convulsioni, coma. INIBITORI DELLA SINTESI DELLE PROTEINE Il blocco della sintesi proteica avviene per infezioni virali (epatite B), tossine di origine batterica, vegetale e fungina. Amanita phallodies, A. ocreata, A. verna, A. bisporigera, Conocybe filaris, Galerina autumnalis, G. marginata, G. venenata, Lepiotia castanea, L. helveola, L. josserandii e specie similari producono amanitine. Provocano un avvelenamento molto grave perché i sintomi compaiono dopo 6-8 ore dall’ingestione, cioè quando le amanitine si sono diffuse in tutto il corpo e sono penetrate all’interno delle cellule uccidendole. Le conseguenze sono più gravi in cellule di tessuti con elevato metabolismo e sintesi proteica, quali fegato, rene e pancreas, che vanno incontro ad estesa necrosi con perdita di funzione degli organi stessi. Danni estesi anche agli epiteli intestinali. Le amanitine sono polipeptidi che agiscono a piccole concentrazioni, si legano alla RNA polimerasi DNA- dipendente (II) e bloccano la produzione di mRNA, quindi la sintesi proteica. Sintomi: vomito, diarrea emorragica, disidratazione, crampi addominali, intossicazione generale causata dalla perdita di funzione di metabolismo del fegato con ittero (steatosi), pancreatite. Altri potenti inibitori della sintesi proteica sono tossine proteiche di origine vegetale o batterica (tossina difterica, tossina prodotta da Pseudomonas aeruginosa). 24 Le tossine proteiche di origine vegetale che bloccano la sintesi proteica si indicano col nome generale di RIP. (ribosome inactivating proteins). Bloccando la sintesi proteica, le RIP uccidono le cellule. Sono più affetti gli organi cui le tossine si legano più specificamente ed in cui la sintesi proteica è più essenziale (fegato, reni, pancreas, epiteli). Sono degli enzimi, quindi sono sufficienti quantità minime di tossina: una singola molecola di ricina (concentrata nei semi di ricino) nel citosol è in grado di inattivare circa 1500 ribosomi/minuto. I semi di A. precatorius contengono una sostanza tossica, l'abrina. La pianta vive in aree tropicali e i suoi semi sono utilizzati in collane ornamentali. Se il soggetto ha tagli cutanei la tossina può entrare in circolo e provocare danno. AGENTI BIOLOGICI COME CAUSA DI MALATTIA Nonostante la disponibilità e l’uso di vaccini e di antibiotici, le malattie infettive rimangono un importante problema di salute in tutto il mondo, in particolare nei paesi in via di sviluppo, dove causano ancora la morte di milioni di persone ogni anno. Batteri: sono i più piccoli organismi dotati degli apparati per la loro crescita e replicazione utilizzando i materiali tratti dall’ambiente. Sono detti procarioti in quanto mancano di organizzazione nucleare complessa come membrana nucleare e apparato mitotico. Virus: sono simbionti intracellulari di piccole dimensioni e di organizzazione semplice. la particella virale completa si chiama virione. Il virus è costituito da una macromolecola di acido nucleico (DNA o RNA) rivestita da una struttura proteica detta capside che protegge l’acido nucleico e ne consente la trasmissione da una cellula ospite all’altra. Presentano un solo tipo di acido nucleico: DNA o RNA, ma non entrambi. Sono totalmente dipendenti da una cellula vivente (sono dei parassiti intracellulari obbligati). Protozoi: sono eucarioti unicellulari che possono replicarsi in modo intra- o extra-cellulare. Fra i primi, il Plasmodium (causa della malaria) nei globuli rossi e la Leishmania nei macrofagi; fra i secondi, Trichomonas vaginalis. Sono un’importantissima causa di malattie (malattia del sonno, toxoplasmosi, coliti, dissenterie, ecc.), soprattutto nei paesi poveri. Sono trasmessi da insetti, per via oro-fecale e infettano soprattutto sangue o intestino. Miceti: sono organismi microscopici eucarioti che a differenza dei batteri posseggono un nucleo circondato da una membrana nucleare. Sono eterotrofi e vivono come saprofiti, parassiti e commensali su una grande varietà di substrati. Possono essere unicellulari (lieviti) o multicellulari (muffe). Inducono micosi: possono essere cutanee o più profonde (es. granulomi o ascessi). Possono dare gravi infezioni sistemiche opportunistiche in pazienti immunocompromessi (es. candida o aspergillus). Elminti: sono organismi parassiti vermiformi che vivono all’interno di un ospite traendone sostentamento e arrecandone un danno. In generale nell’uomo non si moltiplicano ma generano uova o larve, per cui la malattia è spesso di tipo infiammatorio e di intensità dipendente dal numero di agenti patogeni. Esempi: Taenia solium (verme solitario); filarie (elefantiasi, così chiamata per il gonfiore degli arti inferiori dei soggetti affetti dovuta a problematiche al sistema linfatico). Rickettsie, clamidie e micoplasmi (alcune STI) sono microrganismi che, pur presentando alcune caratteristiche simili a quelle dei virus, quali le piccole dimensioni, certamente inferiori a quelle medie dei batteri, e la capacità di sopravvivere e riprodursi, in genere, all’interno o comunque a spese di cellule ospiti, per altri aspetti, sono più simili ai classici batteri. Le rickettsie in genere si trasmettono attraverso punture di zecche, acari, pulci o pidocchi (vettori) che si sono nutriti in precedenza su animali infetti. RAPPORTO MICRORGANISMO-OSPITE Mutualismo: sia il microrganismo che l’ospite traggono beneficio dall’interazione. Commensalismo: il microrganismo vive nell’ospite senza provocare alcun danno. 25  Parassitismo: il microrganismo (parassita) vive all’esterno (ectoparassita) o all’interno (endoparassita) dell’ospite a spese di quest’ultimo (danno). I parassiti facoltativi possono sopravvivere nell’ambiente esterno come organismi autonomi, mentre i parassiti obbligati sono capaci di sopravvivere solo nell’organismo ospite. MICROBIOTA INTESTINALE Il nostro tratto gastrointestinale è popolato di numerose specie di batteri e lieviti. Tutte le superfici esposte (cute e mucose, intestino, genito-urinaria, etc.) sono colonizzate da batteri. Anche nello stomaco alcuni batteri possono sopravvivere, come Helicobacter pylori. Il rapporto tra ospite (uomo) e microrganismo è, generalmente, una simbiosi di tipo commensale/mutualistico: VANTAGGI PER IL MICRORGANISMO: Sorgente di nutrienti Habitat ideale per la crescita e la divisione cellulare VANTAGGI PER L’OSPITE: Assorbimento di vitamine (vit. K, biotina, riboflavina) prodotte da batteri intestinali. Prevenzione della colonizzazione di patogeni: o Produzione di batteriocine. o Stimolazione della produzione di anticorpi. o Attivazione dei fagociti. Ogni individuo è composto da circa 1012 cellule con un genoma costituito da 104 geni. L’attività trascrizionale associata costituisce l’insieme dei metabolismi dell’organismo (metaboloma). I microrganismi simbionti sono circa 1014 batteri, poi archea, fungi e virus, con più di 106 geni da cui deriva il metaboloma microbico. I metaboliti prodotti dal microbiota intestinale complementano quelli del metaboloma mammifero per raggiungere il fitness massimo. Infatti, questa simbiosi svolge un ruolo nella catalisi degli xenobioti, protettivo dell’integrità strutturale dell’epitelio intestinale e contro i patogeni. Il microbiota cambia durante la vita dell’individuo. I cambiamenti non riguardano solo la numerosità di microrganismi, ma anche la sua diversità (in base alla dieta). Il microbiota del neonato è composto da circa 30 specie e dipende da quello materno ed è diverso in base al tipo di parto (naturale o cesareo) o nutrimento (allattamento materno o sintetico). Durante la gravidanza e prima maternità il microbiota vaginale e della ghiandola mammaria riflette quello intestinale in modo che il neonato possa venire colonizzato dalle stesse specie. Disbiosi (vs. eubiosi): sbilanciamento nella composizione del microbiota (eccesso patobioti, perdita commensali, riduzione diversità), comune a diverse condizioni patologiche quali la malattia celiaca, disordini metabolici come obesità e diabete, disordini dell’alimentazione, autismo e disordini dell’umore ed ansietà (intestino e SNC sono strettamente legati e si influenzano a vicenda). La disbiosi è associata anche stress, antibiotici, dieta scorretta, abuso di etanolo, infiammazioni croniche. Un profilo alterato del microbiota è stato associato a disturbi neurodegenerativi, come il Parkinson e il morbo di Alzheimer. La dieta mediterranea, ricca di prodotti di origine vegetale è ideale per mantenere la eubiosi, mentre la dieta occidentale è associata allo sviluppo di disbiosi. I commensali intestinali producono una serie di metaboliti raggruppati nell’acronimo SCFAs (Short Chain Fatty Acids) che hanno molteplici ruoli, tra cui contribuire al benessere locale dell’intestino e sistemica (multiorgano, 26 compreso il SNC). A partire dalle fibre alimentari, attraverso un metabolismo fermentativo, i batteri producono SCFAs (acetato, proprionato e butirrato) e raggiungono il circolo sanguigno sistemico. SNC Gli SCFAs sono in grado di superare la barriera emato-encefalica per raggiungere il SNC (cross talk tra intestino e cervello). Qui si sono registrate una serie di attività in cellule diverse: Neuroni: favoriscono neurogenesi, migliore memoria. Microglia: favoriscono lo sviluppo e della funzionalità, inducono un profilo omeostatico, riducono la segnalazione infiammatoria. Astrociti: riducono la segnalazione infiammatoria. Barriera emato-encefalica: migliorano l’integrità e riducono la permeabilità. FEGATO Attraverso la vena porta, nel fegato migliorano la funzione epatica, produzione di insulina, produzione di grasso bruno (adipociti carbogenici). INTESTINO Nell’intestino hanno azione antiinfiammatoria, promuovono la produzione di proteine di adesione tra le cellule dell’epitelio, di muco e stimolano i meccanismi di riparazione delle lesioni intestinali. Nelle cellule enterocromaffini stimolano la produzione di ormoni che, attraverso la circolazione, agiscono nel SNC come la serotonina. PATOGENICITÀ Capacità di provocare nell’ospite fenomeni patologici. La patogenicità non è la regola; in effetti, si manifesta con una frequenza così bassa, coinvolgendo un numero di specie talmente circoscritto, considerata la straordinaria diffusione dei batteri sul nostro pianeta, da rappresentare un’anomalia. La malattia è dovuta solitamente a “trattative” per la simbiosi tra organismi che non vanno a buon fine, a un superamento della linea di separazione da una parte o dall’altra, a una “errata interpretazione” biologica dei rispettivi “confini”. - Lewis Thomas La patogenicità è solitamente bilanciata: è lo stato ideale nel quale la massima proliferazione e diffusione avviene con la minima alterazione della fisiologia dell’ospite (per favorire la diffusione). La patogenicità si esprime grazie a: Trasmissibilità da un ospite all’altro Infettività (cioè replicazione nell’ospite) Virulenza (cioè possibilità di superare le difese dell’ospite) Un microrganismo è patogeno se è in grado di invadere e moltiplicarsi con conseguente danno dell’organismo ospite. La patogenicità dipende da: Fattori di virulenza. Carica batterica (numero iniziale di batteri che infettano). Stato di salute, in particolare immunitario, dell’ospite. 27  21 marzo 2024 FATTORI DI VIRULENZA Fattori elaborati da batteri patogeni, funzionali al loro ciclo vitale e coinvolti nella patogenesi della malattia causata dall’infezione batterica. I fattori di virulenza sono il prodotto di un processo di co-evoluzione dei microorganismi con il loro ospite. Durante l’evoluzione un microorganismo patogeno “impara’’ come sovvertire la fisiologia dell’ospite a proprio vantaggio, i.e. i fattori di virulenza sono creati “su misura” attorno a funzioni chiave fisiologiche. Flagelli: aiutano la penetrazione negli strati mucosi e dentro i tessuti Fimbrie e adesine: mediano il legame del batterio alle cellule e alla matrice extracellulare Enzimi: degradano componenti dello strato mucoso, m. plasmatica Tossine: i batteri producono numerose esotossine ed endotossine. Causano alterazione della fisiologia dell’ospite e/o dei suoi meccanismi di difesa in modo tale da promuovere la proliferazione e la diffusione batterica. TOSSINE BATTERICHE Le tossine batteriche sono molecole elaborate prodotte da batteri allo scopo di modificare l’ospite a proprio vantaggio (= proliferazione e/o diffusione). In generale hanno un target cellulare specifico (tropismo limitato), ma in alcuni casi sono pantrope. Il loro bersaglio più frequente sono le cellule della risposta immunitaria, ma molti altri tessuti possono venir colpiti a seconda dei vantaggi specifici del batterio. Le tossine batteriche sono disegnate dall’evoluzione attorno ad una funzione chiave dell’organismo ospite. Quindi studiarle significa: Conoscere meglio la patogenesi molecolare della malattia in cui esse sono coinvolte. Conoscere allo stesso tempo meglio una funzione chiave dell’ospite. Poter elaborare nuove strategie terapeutiche o preventive (farmaci, vaccini). Magari poter usare le tossine stesse come agenti terapeutici. Proprietà Esotossine Endotossine Proteine secrete da batteria sia Gram- LPS, lipoproteine rilasciate dalla Microbiologica positivi che Gram-negativi lisi di batteri Gram-negativi Chimica Termolabili Termostabili Sintomi e azione specifici su cellule o Sistemico: febbre, diarrea, vomito, Modo di azione tessuti definiti: enterotossiche, shock neurotossiche, citotossiche (o pantrope) Elevata: neutralizzabili da anticorpi Modesta: non neutralizzabili da Immunogenicità → permettono lo sviluppo di vaccini. anticorpi Le esotossine sono secrete dal batterio, mentre le endotossine sono componenti strutturali del batterio e diventano dannose solo quando esso è distrutto. ESOTOSSINE BATTERICHE Proteine che danneggiano direttamente il tessuto o alterano il metabolismo della cellula bersaglio o innescano attività biologiche distruttive. 28  Secrete Prodotte da Gram+ e Gram- Talora responsabili uniche malattia Veleni più potenti conosciuti Generalmente enzimi Antigeniche e neutralizzabili da anticorpi MECCANISMI D’AZIONE DELLE ESOTOSSINE BATTERICHE 1. Tossine che agiscono sulla superficie cellulare (recettori di membrana/integrità strutturale) 2. Tossine con bersagli intracellulari (→ devono essere interiorizzati dalla cellula) 3. Tossine iniettate nella cellula eucariotica (batteri che possiedono geni codificanti proteine che formano una “siringa molecolare”) TOSSINE CHE AGISCONO SULLA SUPERFICIE CELLULARE Creano un danno a livello della membrana plasmatica, sono di 2 classi: 1. Tossine formanti pori (es: Leucotossine), circa il 70% delle tossine che danneggiano la membrana) 2. Tossine che causano danno alle membrane attraverso una attività enzimatica. Tossine formanti pori Leucotossine: tossine prodotte dai batteri per attaccare i globuli bianchi dell’organismo ospite riducendone così le difese immunitarie. Danneggiano ed uccidono le cellule permeabilizzandone la membrana plasmatica mediante la formazione di pori oligomerici. Esempio di infezione batterica: gli stafilococchi Staphylococcus aureus Gram+ Capsulato Aerobio/anaerobio facoltativo Diffuso in uomo e animali Le infezioni da Staphylococcus aureus sono fra le più comuni infezioni da cocchi Gram positivi. S. aureus è un cocco piogenico, con strutture a grappoli, che causa un gran numero di infezioni cutanee, polmoniti, endocarditi, una forma di shock tossico, avvelenamento alimentare (diarrea, vomito), sovrainfezioni di ferite ed ustioni, mastiti (infiammazione della ghiandola mammaria), etc. Questi cocchi hanno un gran numero di geni di virulenza, presenti o meno in un dato ceppo: Proteine coinvolte nell’adesione ai tessuti dell’ospite (ad es. recettori per componenti della matrice extracellulare) Enzimi idrolitici (proteasi, lipasi) Tossine secrete (es. α-tossina, che forma pori nelle membrane); Superantigeni: essi iperattivano i linfociti T, con conseguente massiccio rilascio di citochine pro- infiammatorie che aumentano la permeabilità vasale, e danneggiano sistema respiratorio, fegato e reni, e causano morte per shock endotossico. Principali fattori che intervengono nella patogenicità di Staphylococcus aureus: Esotossine: o Citolisine (o emolisine) α, β, γ, δ o Leucocidine 29  o Tossina epidermolitica o Enterotossine, rilevanti nelle intossicazioni alimentari o Tossina dello shock tossico (TSS-1) o Tossine pirogene Endotossine: o Coagulasi o Stafilochinasi o Ialuronidasi o Proteasi o Enzimi lipolitici: i lipidi della cute costituiscono un meccanismo di difesa contro la colonizzazione batterica abbassando il pH o DNAsi Componenti strutturali e altre attività biologiche o Capsula, responsabile dell’attività antifagocitica o Proteina A o Coagulasi o Catalasi e superossidodismutasi Struttura della α-tossina di Staphilococcus aureus Si lega alla membrana cellulare attraverso recettori specifici nei globuli rossi, nelle piastrine e nei monociti o attraverso la fosfatidilcolina e il colesterolo in tutte le cellule di mammifero. Le dimensioni del poro sono piccole, ciò fa da filtro a ciò che può passare: Passano ioni. Non passano amminoacidi, zuccheri, peptidi. Il risultato è un’equilibrazione delle concentrazioni ioniche fra esterno ed interno ed uno squilibrio della distribuzione delle molecole più grandi che determinano una pressione osmotica (Posm). La Posm più elevata dentro determina un richiamo di acqua che permea attraverso la membrana plasmatica e fa gonfiare la cellula fino a che essa scoppia → La cellula muore di lisi osmotica. Il risultato della lisi osmotica è particolarmente grave quando riguarda neutrofili, macrofagi etc. La lisi osmotica di neutrofili, macrofagi etc. provoca il rilascio di tutte le armi che queste cellule hanno elaborato con lo scopo di uccidere e degradare batteri creando gran danni ai tessuti circostanti → pus. Ascessi, pus etc. sono caratteristici di batteri come Stafilococchi e Streptococchi che producono tossine che formano pori sulle membrane delle cellule. Per la sua capacità di causare infezioni purulente S. aureus è definito come batterio piogeno. Tossine che causano danno alle membrane attraverso una attività enzimatica Sono fosfolipasi che attaccano la membrana delle cellule eucariotiche inducendo da sole o in collaborazione con altri enzimi la lisi cellulare. L’α-tossina di Clostridium perfringens è una fosfolipasi C con azione dermonecrotica ed emolitica che causa la gangrena gassosa. Le fosfolipasi hanno come bersaglio i fosfolipidi (testa polare + glicerolo + 2 acidi grassi). La gangrena gassosa rappresenta la forma estrema di infezione clostridica necrotizzante. Una ferita poco ossigenata contaminata dalle spore clostridiche ne permette la germinazione e la produzione della tossina che 30 causa necrosi al connettivo e ai muscoli circostanti. La malattia è caratterizzata da edema, necrosi, colliquazione e formazione di gas della parte infetta; si ha anche sovrapposizione di infezione da piogeni in grado di aumentare la gangrena. Massiva emolisi. TOSSINE INIETTATE NELLE CELLULE EUCARIOTICHE Helicobacter pylori (Gram-) Praticamente tutti i pazienti con ulcera duodenale e il 70% dei pazienti con ulcera gastrica sono infettati con Helicobacter pylori. Hp è presente nell’80% dei campioni istologici prelevati dalla zona adiacente al tumore in pazienti affetti da cancro gastrico. Il 75% dei pazienti con linfoma di MALT presenta completa regressione se trattato per Hp. Il ruolo di Hp nello sviluppo del tumore sarebbe legato allo scatenamento di una risposta immunitaria a seguito dell’infezione. Per questi motivi nel 1994 Hp è stato definito carcinogeno di classe 1. Hp colonizza la mucosa gastrica, ambiente a pH estremamente basso (≈2). Il microorganismo, una volta ingerito, produce un fattore di virulenza enzimatico detto ureasi. Questo enzima converte l’urea in ammoniaca, questa una volta secreta crea un alone protettivo che tampona il pH acido dello stomaco. Allo stesso tempo i flagelli spingono il batterio al di sotto dello strato di muco dello stomaco (anche grazie alle mucinasi) fino ad aderire all’epitelio della mucosa. Utilizza poi una siringa molecolare per inserire nelle cellule della mucosa molecole effettrici tossiche. L’ulcera si forma perché l’epitelio è danneggiato, non più protetto dallo strato mucoso e quindi esposto al pH acido. Altri fattori di virulenza sono: Adesine per legare la superficie delle c. gastriche. NAP attraversa l’epitelio gastrico e recluta neurotrofili e monociti che causano danno tissutale rilasciando ROS. VacA altera le giunzioni intercellulari. CagA induce alterazioni citoscheletriche ed induce la sintesi di citochine pro-infimmatorie. 26 marzo 2024 TOSSINE BATTERICHE CON BERSAGLI INTRACELLULARI Dopo rilascio dal batterio si legano ad una/più cellula/e bersaglio mediante un recettore specifico e sono internalizzate mediante endocitosi. Le tossine batteriche a bersaglio intracellulare hanno tutte una struttura a due subunità simile detta: A-B (A: active part, B: binding part). Entrambe le subunità sono fondamentali a realizzare la tossicità e svolgono funzioni complementari: A, o parte attiva, agisce da enzima modificando un componente dell’ospite → tossicità. B, o di legame, lega il recettore di superficie per cui è specifico → specifità del bersaglio. L’interazione tra B e il suo recettore specifico causa endocitosi di A e B, essendo le due legate da un ponte disolfuro. In questo momento, nel lume della vescicola non si ha tossicità. 31 A mano a mano che la vescicola persiste nella cellula, un ATP-asi ne acidifica progressivamente il lume, portando a un cambio di conformazione di B che lo rende un canale permeabile alla subunità A. L’esposizione di A all’ambiente citosolico (riducente) fa sì che il ponte disolfuro che legava le due subunità venga rotto e A sia libero di agire. Esempi di tossine AB Toxin Organization Activity Diphtheria toxin AB ADP ribosylation Exotoxin A AB ADP ribosylation Botulinum toxin AB Zn++ protease Tetanus toxin AB protease Cholera toxin AB5 ADP ribosylation Shiga toxin AB5 Cleaves 28S rRNA Anthrax toxin LF A-B Zn++ protease Anthrax toxin EF A-B Adenylate cyclase L’organizzazione AB5 (5 subunità B legate ad 1 subunità A) aumenta l’avidità di legame della tossina (complessiva capacità di legare il proprio recettore cellulare). Tossine che hanno stessa attività enzimatica condividono la subunità A, ciò che rende il quadro clinico molto diverso è la differente specificità cellulare, data da B. Tossine ADP-Ribosyl transferasi Le tossine ADP-ribosiltranferasi batteriche entrano nella cellula ospite via endocitosi dopo essersi legate ad un recettore od utilizzano il sistema di secrezione per essere rilasciate nella cellula. Per disattivare la proteina target vi attaccano un ADP-ribosio (gruppo molto voluminoso) sottratto ad una molecola di NAD. Difterite La Difterite fu identificata da Ippocrate nel quarto secolo A.C. Questa malattia ha causato milioni di morti nella sola Europa per molti secoli fino alla sua scomparsa dovuta alla vaccinazione. La causa della difterite è l’infezione da parte di ceppi tossinogenici di Corynebacterium diphtheriae, un batterio identificato come agente eziologico della difterite da Klebs nel 1883, e coltivato per la prima volta nel 1884 da Loeffler, che dedusse che: a) la vera causa della malattia era un veleno rilasciato dal batterio e b) che tale veleno agiva sia localmente che a distanza. Il veleno di Loeffler (tossina difterica) fu isolato nel 1888 da Roux e Yersin e nel 1890 ne venne fabbricato da von Behring un antisiero. Nel 1923 Ramon ottenne un tossoide (tossina che conserva il potenziale antigenico senza essere tossica) difterico che è usato ancor oggi come vaccino antidifterite. Il tossoide è ottenuto trattando la tossina con formalina (formaldeide). Tossina Difterica (DT) Prodotta da ceppi tossinogenici di Corynebacterium diphtheriae il quale si moltiplica nelle superficie delle cellule epiteliali del corpo (naso, gola, pelle → diffusione tramite droplets) e non penetra nei tessuti circostanti. Produce una tossina che causa necrosi delle cellule della mucosa con formazione di essudato infiammatorio e pseudomembrane. Nel tempo, diffonde soprattutto al cuore e al SN dove causa dei danni importante. La DT è la sola responsabile dell’insorgenza della patologia, per cui la DT detossificata ed è utilizzata nella formulazione del vaccino. 32 La tossina attiva è formata da due frammenti A e B di 21 e 37 kDa rispettivamente. Presenta tre domini distinti: 1. Dominio che lega il recettore 2. Dominio di traslocazione 3. Dominio catalitico Meccanismo d’azione della tossina difterica La morte cellulare è causata da un blocco della sintesi proteica secondario alla ADP ribosilazione di EF-2. EF-2 è stato scoperto grazie a DT ed è importantissima durante la sintesi proteica per l’allungamento della catena polipeptidica dei ribosomi. Il bersaglio della tossina sono le cellule cardiache, nervose e renali (tossina pantropa). La porzione “D" del vaccino DTP contiene il tossoide difterico per stimolare la sintesi di Abs “neutralizzanti”, ossia diretti verso il componente B della tossina → no internalizzazione. Il risultato dell’inibizione della sintesi proteica a livello clinico Tipicamente in 2-3 giorni, si sviluppano: Faringite essudativa pseudomembranosa Febbre non elevata Linfoadenomegalia Edema del collo Le complicanze sono dovute all'azione sistemica (pantropia) della tossina prodotta dal batterio; esistono tre categorie di complicanze: cardiache, nervose e renali. Le complicanze cardiache sono miocardite difterica con steatosi del miocardio (degenerazione grassa) per diminuzione della sintesi di carnitina acil-transferasi (che trasporta l’acil-CoA nel mitocondrio). La miocardite compare tra la 3° e la 7° giornata e si presenta con tachiaritmie e ECG anomali. Le complicanze nervose possono anch'esse essere precoci (entro la prima settimana) e tardive (oltre la quarta settimana). Tra le prime assume particolare importanza la paralisi del nervo glossofaringeo, con difficoltà nella deglutizione, e quella del velopendulo, con disturbi di fonazione. Tra le manifestazioni tardive si ha la paralisi dei nervi oculari (turbe dell'accomodazione e dei movimenti coniugati), del nervo faciale, del nervo vago e del nervo accessorio del vago, e dei nervi spinali, con polineuriti che riguardano tronco, arti e talora diaframma. Le complicanze renali, meno frequenti, si manifestano con insufficienza renale, oliguria, proteinuria, ematuria e alterazioni idroelettrolitiche. La letalità è di circa il 5-10% ma in molti casi, nei sopravvissuti, permangono danni permanenti a carico di cuore, reni, sistema nervoso. In Italia, prima dell'avvento della vaccinazione di massa (al termine della II guerra mondiale) si registravano annualmente alcune decine di migliaia di casi di difterite con più di mille morti ogni anno. La malattia è praticamente scomparsa con l’introduzione del vaccino. Nella gola permangono ceppi non tossinogenici di Corynebacterium → il vaccino ha agito come fattore evolutivo selettivo portando alla perdita di un gene superfluo. 33 Antisiero Accertata la difterite, il primo presidio terapeutico era la somministrazione di antisiero iperimmune equino (tossina ottenuta per filtrazione dalle colture inattivata con calore ed iniettata in cavalli a più riprese in modo da far sì che l’animale diventasse iper-immune. Il siero antidifterico veniva usato come antidoto nei pazienti affetti da difterite). Terapia non sempre efficace perché gli anticorpi neutralizzanti la tossina (antitossina) non entrano dentro le cellule e molto pericolosa perchè il siero di cavallo è di per sé immunogeno capace di indurre malattia da siero e reazioni allergiche. Colera Il colera, o qualcosa di simile, è noto da almeno 4000 anni. Epidemie di colera si sono susseguite attraverso i secoli provenendo dall’Oriente e sono state estese alle Americhe a partire dal 1500. Tra il 1846 e il 1863 un’onda epidemica si sparse per l’Europa e raggiunse l’Italia e il Regno Unito, fu questo il periodo in cui gli studi di Dr. John Snow (1813-1858, medico della regina Vittoria) a Londra, il Prof. Filippo Pacini (1812-1883, cattedra di Anatomia Generale e Topografica) a Firenze studiarono la malattia e ne identificarono rispettivamente la modalità di trasmissione e l’agente eziologico. Il Dr. John Snow notò che tutti i casi di colera erano concentrati nelle abitazioni circostanti la pompa di Broad Street, intuendo che l’acqua contaminata fosse la responsabile. Filippo Pacini fu il primo a isolare e dare il nome al batterio (Vibrio cholerae). Descrive la malattia come una perdita massiccia di fluidi ed elettroliti dovuta all’azione locale del vibrione sulla mucosa intestinale e raccomandò in casi estremi l’iniezione endovenosa di 10 grammi di NaCl per litro d’acqua. È il vero scopritore di Vibrio cholerae come agente causale del colera, scoperta che è comunemente attribuita a R. Koch (che invece scoprì che l’agente causale del colera era una tossina). Il genere Vibrio comprende molte specie patogene, tra cui Vibrio cholerae. Questi batteri si trovano nell’acqua fresca, nei pesci, crostacei e alghe in forma dormiente. Quando il batterio è assunto tramite il consumo di animali infetti, da esposizione diretta all’acqua contaminata oppure oro-fecale da individuo a individuo. Colonizza i villi intestinali. 34 Tossina colerica È prodotta da Vibrio cholerae, un vibrione Gram-. V. cholerae è introdotto con liquidi e cibi contaminati e aderisce ai microvilli intestinali senza mai invadere l’epitelio dove produce la tossina e altri fattori di virulenza. È un batterio poco invasivo, la patogenicità è legata alla tossina. Il colera è una malattia epidemica caratterizzata da diarrea massiva per alterazione dei meccanismi fisiologici dell’assorbimento intestinale di H2O e ioni. Nel mondo si sviluppano 5-7 milioni di casi/anno, 100,000 morti/anno. Cholera gravis, la forma più grave della malattia causa una mortalità di circa il 10%. Si perdono fino a 20 litri di acqua al giorno. La perdita di molti litri di liquidi al giorno causa: Perdita di coscienza per minor irrorazione sanguigna cerebrale. Ipoglicemia (danno soprattutto al SN). Ipokalemia per perdita di ioni K+ con le feci. Se non trattato con soluzioni glucosate il soggetto muore per collasso cardiaco e shock ipovolemico. La tossina è di tipo ADP ribosil-transferasica, ha struttura AB5: B lega 5 gangliosidi (lipidi legati a zuccheri) GM1 (alta affinità) sulla membrana apicale delle cellule epiteliali (enterociti → enterotossina). A agisce su un bersaglio citoplasmatico della membrana basolaterale detta Gs. La Gs così modificata immobilizza l’adenilato ciclasi nello stato attivato, causando un significativo (fino a 100 volte maggiore) aumento della quantità intracellulare di cAMP. Alte concentrazioni di cAMP attivano la PKA, una chinasi che ha come bersaglio il canale del cloro CFTR. Il mantenimento del canale CFTR nello stato fosforilato fa sì che rimanga aperto e che lo ione venga liberato in modo incontrollato nel lume dell’intestino. Alla sua fuoriuscita segue quella di altre specie ioniche e l'acqua, proveniente dal sangue, esce seguendo le specie osmoticamente. L’effetto finale è: Liberazione di ioni sodio, potassio, bicarbonati. Perdita di liquidi (fino a 20 L/die acqua), diarrea e grave disidratazione. Collasso cardiocircolatorio. 28 marzo 2024 Vaccino anti-colera Molte sono energie dedicate a trovare un vaccino anticolerico utilizzando come immunogeni: Tossina colerica Tossina colerica legata a gangliosidi Vibrioni colerici attenuati Tuttavia, i risultati sono stati scarsissimi e l’unica terapia valida è quella del ripristino di liquidi e sali ai pazienti insieme al miglioramento delle condizioni igienico sanitarie. 35 Pertosse Affezione della prima infanzia con esordio infiammatorio naso-faringeo e successivo interessamento delle vie aeree inferiori con accessi parossistici di tosse (canina), fenomeni broncospastici con difficoltà inspiratorie. La pertosse (o tosse canina) è una malattia causata dal batterio Gram- Bordetella pertussis. È una delle malattie infettive più contagiose che si conoscano tanto che un bambino con pertosse può contagiare fino al 90% di bambini non immuni con cui viene a contatto. Si trasmette per via aerea da persona a persona con la tosse o gli starnuti (droplets). Tossina della pertosse Tossina AB5 di 105 kDa. La porzione enzimatica della tossina ha attività ADP ribosilante nei confronti della proteina Gi, che regola l’attività dell’adenilato ciclasi. La Gi, inattivata dall’ADP-ribosilazione, non è in grado di inibire l’adenilato ciclasi, con conseguente aumento della quantità intracellulare di cAMP. A differenza della tossina colerica, che inibisce la proteina G stimolatoria (Gs), quella della pertosse inibisce una proteina G di tipo inibitorio (Gi); l’effetto cellulare finale, tuttavia, è il medesimo (↑ [cAMP]). A seconda del tipo cellulare interessato, l’aumento intracellulare di AMP ciclico da parte della PT può causare: Nell’epitelio respiratorio l’aumento delle secrezioni respiratorie e della produzione di muco, caratteristiche dello stato parossistico della pertosse (tosse, broncospasmo, dispnea). Nei fagociti, riduzione della fagocitosi (chemotassi, engulfment, killing), aiutando il batterio ad evitare la sua distruzione da parte del sistema immunitario (tossina pantropa). La compromissione del sistema immunitario da parte della PT spiega la frequenza di infezioni secondarie come polmoniti ed otiti. Vaccinazione contro la pertosse Il vaccino attualmente utilizzato è diverso da quello inizialmente sviluppato: il primo vaccino che fu somministrato era di tipo a cellule intere e consisteva nel batterio intero inattivato con rari effetti collaterali. Odiernamente, il vaccino della pertosse, parte dell’esavalente, è realizzato con la sola tossina della pertosse purificata, non più tossica ma comunque immunogenica. Questo ha reso la protezione molto più omogenea nella popolazione e ridotto ulteriormente gli effetti collaterali. Tossine Zinco-endopeptidasiche Lo studio del meccanismo di azione di queste tossine ha permesso di acquisire informazioni fondamentali che riguardano la neurotrasmissione. Una delle tossine che sono state studiate è quella botulinica, oggi utilizzata anche in trattamenti terapeutici. Il genere Clostridium contiene specie anaerobie strette tra cui alcune patogene come Clostridium tetani, responsabile del tetano, e Clostridium botulinum, responsabile del botulismo, una grave intossicazione alimentare. Questi batteri utilizzano tossine con attività zinco-endopeptidasica dette neurotossine clostridiali. Specie Malattia/tossina prodotta C. tetani Agente eziologico del tetano; tossina tetanica (tetanospasmina) C. botulinum Agente eziologico del botulismo, una grave intossicazione alimentare; tossina botulinica Agente eziologico della gangrena gassosa, una grave patologia che si sviluppa in seguito C. perfringens all’infezione di ferite con spore. I microrganismi producono gas in seguito ai processi di fermentazione ed elaborano numerose tossine ad azione necrotizzante (es. tossina alfa) C. difficile Responsabile di una sindrome diarroica associata all’uso prolungato di antibiotici 36 Esistono 7 diversi sierotipi di neurotossina botulinica (denominati dalla A alla G), mentre un unico tipo di neurotossina tetanica. Clostridium tetani Kitasato isolò il bacillo in forma pura. Tizzoni e Cattani e contemporaneamente Faber dimostrarono l’esistenza di una tossina riproducendo la malattia in animali iniettati con il filtrato di coltura. Osservarono che il filtrato era inefficace per via orale; per via endovenosa causava tetano generalizzato, mentre per via intramuscolare tetano localizzato. Von Behring e Kitasato dimostrarono che il siero di animali sopravvissuti alla malattia era protettivo. C. tetani è presente sotto forma di spore diffuse nel terreno, vivo (saprofita → si nutre di sostanza organica in decomposizione) nel’intestino di uccelli quali polli e anatre, di ruminanti e maiali, rarissimo nel’uomo. Le spore sono presenti anche nelle aree urbane, nella polvere, in piccole ferite provocate da aghi, spine, chiodi che possono essere facilmente contaminati. Suolo, polvere, feci animali. Per la maggior parte dei patogeni non è vantaggioso uccidere l’ospite, in quanto serve al patogeno come sede di riproduzione e trasmissione. C. tetani non si può definire come avere una patogenicità bilanciata, in quanto ha vantaggio ad uccidere l’ospite essendo un anaerobio stretto, che quindi trova nel cadavere l’ambiente ideale di proliferazione. Il vantaggio di questa strategia può essere capitalizzato solo se il batterio ha anche la possibilità di sopravvivere alla morte dell’ospite trasformandosi in spore. Fin dai tempi di Ippocrate il tetano (τεταηοσ) era conosciuto come una patologia caratterizzata da tre segni clinici distintivi: Trismus: impossibilità di aprire la bocca. Risus sardonicus: sorriso demoniaco, per paralisi dei muscoli facciali. Opisthotonos: marcata iperestensione del corpo, risultato di paralisi spastica dei muscoli scheletrici che parte dalla faccia, il collo e discende poi al tronco, all’addome ed agli arti. La tossina causa morte per collasso cardiaco o insufficienza respiratoria e ha azione a livello del SNC. In alcune zone dell’Africa sono frequenti casi di tetano neonatale (Tetanus neonatorum) quando il taglio del cordone ombelicale è realizzato con strumenti contaminati da spore. Immunoprofilassi antitetanica Il tetano e una malattia che si può prevenire tramite immunoprofilassi attiva (vaccinazione): l'immunizzazione attiva con il tossoide tetanico (tossina modificata in modo da non risultare più tossica ma ancora antigenica) è estremamente efficace. In caso di traumi (es. incidente) in pronto soccorso viene accertata la presenza di una copertura vaccinale recente, e ci si regola in base al tipo di ferita, che può supportare o meno la germinazione delle spore. In genere: Con ferita pulita, si somministra una dose di anatossina/tossoide entro 24h nei soggetti vaccinati da più di 10 anni. Con ferita sporca, una dose di anatossina entro 24h nei soggetti vaccinati da più di 5 anni. Nei soggetti non vaccinati, oltre alla somministrazione di tossoide, si fa una profilassi di tipo passivo tramite l’iniezione di immunoglobuline. Gaston Ramon (1886-1963) Ramon (1923) trattando la tossina tetanica con formaldeide e calore ottenne il tossoide sperimentato con successo nel 1926 su uomo. È usato ancora adesso. 37 Struttura della tossina tetanica (e delle neurotossine clostridiali) La tossina tetanica è una tossina neurotropa costituita da una subunità leggera (catena A) e subunità pesante (catena B) unite da un ponte S-S. La catena B si lega ad un recettore sulla superficie dei neuroni (ganglioside GM2) La catena A è una zinco-endopeptidasi che agisce a livello del SNC. Le spore che si trovano in ferite profonde (poco ossigenate) permettono la germinazione del batterio nello stato vegetativo, che produce a questo punto la neurotossina. Il sito di ingresso della neurotossina tetanica è la giunzione neuromuscolare: il ganglioside GM2 si trova in particolare sulla membrana del terminale pre-sinaptico del motoneurone α. L’attività tossica non si sviluppa nel punto d’ingresso: rimane nella forma AB in vesciche da cui non esce fintanto che questa non raggiunge il SNC, a livello del midollo spinale. La tossina tetanica (TeNT) è trasportata in modo retrogrado/retroassonale all’interno di endosomi non acidici (che quindi non causa cambiamenti conformazionali/lisi delle subunità) che viaggiano lungo i microtubuli. A livello dell’interneurone inibitorio la tossina è liberata, qui interferisce con il rilascio dei neurotrasmettitori inibitori (GABA, glicina) che prevengono la depolarizzazione della membrana postsinaptica e la conduzione del segnale elettrico. In assenza di neurotrasmettitori inibitori, l’eccitazione degli assoni non è contrastata, causando la simultanea contrazione dei muscoli flessori ed estensori (agonisti/antagonisti → paralisi spastica, morte per insufficienza respiratoria): durante un movimento volontario bilanciato solo uno dei due deve contrarsi, mentre l’altro deve essere inibito dall’interneurone inibitorio. Clostridium botulinum Il botulismo è una grave intossicazione alimentale causata dall’ingestione di alimenti contaminati dalla tossina botulinica. Questa tossina resiste al pH acido dello stomaco ed assorbita a livello intestinale, da cui raggiunge la circolazione sanguigna. Dal punto di vista fenotipico la situazione è opposta rispetto al tetano: la tossina botulinica causa una paralisi flaccida, in cui i muscoli scheletrici non sono in grado di contrarsi. Il microbiologo belga Emile van Ermengem fu il primo ad isolare il batterio da fette di prosciutto che avevano causato botulismo in alcuni pazienti. Il termine botulismo fu invece coniato dal medico tedesco Justinus Kerner, che osservò come i pazienti mostranti paralisi flaccida spesso avessero precedentemente assunto salsiccie (botulus in latino). Kerner preparò un estratto delle salsicce e lo iniettò su sé stesso, riproducendo localmente la paralisi. La tossina botulinica è tra le tossine più potenti conosciute ed è stata utilizzata per trattare patologie caratterizzate da iperattività dei terminali colinergici. A differenza della tossina tetanica la via d’assunzione è enterale. Il paziente sviluppa il botulismo 12-36 ore dopo l’intossicazione, percependo una grande debolezza muscolare, difficoltà di movimento, deglutizione, coordinazione, accomodazione (messa a fuoco), perde il controllo degli sfinteri rimanendo comunque vigile. Se non si interviene con ventilazione assistita il paziente muore. Il recupero può durare mesi. Si sono registrati casi di botulismo nei bambini in seguito a somministrazione di miele (casalingo) contaminato da spore di C. botulinum tramite ciuccio. 38  4 aprile 2024 Tossina botulinica Anche la tossina botulinica (BoNT) agisce a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ), tuttavia agisce a livello del sistema nervoso periferico (SNP). Causa un blocco della neuroesocitosi dell’acetilcolina nel motoneurone α. La parte B della tossina botulinica lega una molecola che è esposta solo quando la vescicola contenente Ach sta fondendo con la membrana a contatto con la NMJ e sfrutta il meccanismo di riciclo del neurotrasmettitore, neuroendocitosi, per venire internalizzata. Una volta internalizzata avviene il rilascio della porzione A che esercita la funzione tossica. Durante il rilascio del NT alcune proteine di membrana presenti all’interno delle vescicole dell’Ach sono esposte, tra queste ci sono la proteina SV2 e Syt II (sinaptotagmina II), bersaglio di diversi tipi di tossina BoNT con un’altissima affinità di legame (LD50 = 0.1-1 ng/Kg). Quando la vescicola è richiusa e all’interno del terminale assonico la sua acidificazione fa sì che avvenga il rilascio della porzione A. La porzione tossica ha attività metallo-proteasica (endopeptidasica) diretta verso proteine fondamentali al rilascio dei neurotrasmettitori (come anche la subunità A della tossina tetanica): Sintaxina: proteina transmembrana localizzata sulla membrana presinaptica della NMJ. È bersaglio della BoNT/C. SNAP-25: proteina associata alla membrana presinaptica della NMJ sul lato citosolico. È bersaglio delle BoNT/A, BoNT/C, BoNT/E. VAMP: collabora con sintaxina e SNAP-25 per realizzare la fusione della vescicola contenente Ach. È bersaglio delle BoNT/B, BoNT/G, BoNT/D, BoNT/F e della TeTN. Tutti i vari tipi di tossina sopra citati tagliano in corrispondenza dei domini di interazione tra queste proteine, che quindi non possono formare il complesso SNARE necessario alla fusione della vescicola e all’esocitosi del neurotrasmettitore. In microscopia elettronica è apprezzabile come in presenza di neurotossina le vescicole vengono ammassate in prossimità del terminale pre-sinaptico, senza possibilità di fondersi con la membrana e rilasciare il neurotrasmettitore. Uso terapeutico della tossina botulinica La tossina botulinica è altamente specifica per i terminali colinergici: piccolissime quantità sono sufficienti per bloccare i terminali colinergici che innervano le fibre muscolari ma anche quelli autonomici che innervano le ghiandole. L’azione della tossina, inoltre, è reversibile e diffonde molto poco dal sito d'iniezione. Esistono molte patologie umane caratterizzate da iperattività dei terminali colinergici, molto invalidanti dal punto di vista sociale e psicologico, per cui la BoNT è utilizzabile come farmaco: 1973: Dr. Alan Scott usò per primo la BoNT/A come agente terapeutico per trattare lo strabismo nelle scimmie (causato da iperattività dei terminali colinergici). 1978: Scott trattò i primi pazienti volontari con strabismo. 1989: FDA approvò l'utilizzo della BoNT/A nell'uomo per il trattamento di strabismo, blefarospasmo (palpebre bloccate in posizione chiusa) ed emispasmo facciale (e.g. in seguito a ictus, ischemie). Le iniezioni devono essere ripetute nel tempo e in alcuni casi i pazienti sviluppano tolleranza al farmaco. 39