Tema 8: Estructura de la Unión Neuromuscular (PDF)

37 de 70 TEMA 8: ESTRUCTURA DE LA UNION NEUROMUSCULAR La union neuro-muscular es una de las sinapsis químicas mejor estudiada, dado q su tamaño permite su observación con microscopio electrónico. Ademas, es posible inervar la fibra muscular con mas de un electrodo, obteniendo unos registros y caracterización de la sinapsis mucho más fina. El NT implicado es la AcCh q se une a receptores nicotínicos. Las sinapsis neuro-musculares se empezaron a estudiar en peces. Los receptores nicotínicos fueron inicialmente aislados en peces torpedo. ESTRUCTURA DE LA SINAPSIS NEUROMUSCULAR: El elemento neural q inerva la fibra muscular es una motoneurona periférica, mielinizada por las células de Schwann. Sin embargo, a medida q el axon de la motoneurona se aproxima a la fibra muscular pierde la mielinización y se ramifica, formando el telodendro. Cada ramificaciones está envuelta por una membrana de células de Schwann pero ya no están mielinizadas. En cada una hay múltiples zonas activas (múltiples botones sinápticos). En los botones sinápticos hay mitocondria + miles de vesículas q almacenan AcCh + múltiples zonas de salida con canales de Ca tipo N. Las terminales pre-sinapticas se encuentran rodeadas por células de Schwann peri-sinápticas. Cada fibra muscular está inervada por una única neurona !!!!!!!!!!! La distancia entre la fibre muscular y la motoneurona es de 100 nm, mas q en las sinapsis del SNC. Esta hendidura esta atravesada por una lamina basal formada por tejido conectivo. Esta lamina basal se encuentra también alrededor de toda la estructura de la sinapsis de la motoneurona. En la region post-sináptica, la membrana de la fibra muscular presenta una serie de invaginaciones o crestas a fin de: Evitar q la AcCh liberada por la neurona se disperse => favorece la [AcCh] en las crestas Aumentar la superficie y => permitir una mayor [receptores nicotínicos] La lamina basal también se introduce en las crestas, donde es soporte de determinadas proteínas. Los canales de NA dep. de voltaje se encuentran en la zona mas profunda de la cresta, mientras q los receptores nicotínicos se encuentran en la zona más externa. Los sitios de liberación están perfectamente alineado con la membrana post-sináptica donde se encuentran los receptores nicotínicos. En la membrana post- sináptica hay clusters de receptores nicotínicos (densidad alta de receptores). Cuando el PA llega a la membrana pre-sináptica se liberan muchísimas vesículas y se crea un potencial de placa en la membrana post-sináptica. Este potencial permite la abertura de canales de Na y amplifica la repuesta generando el potencial post- sináptico (=> se abren los canales de Ca => contracción muscular). 38 de 70 ALINEAMENTO DE CANALES DE Ca Y DERECEPTORES NICOTINICOS: La zona activa pre-sináptica está perfectamente alineada con los receptores nicotínicos en la post-sinapsis, lo cual aumenta la eficacia en la guion neuro-muscular. Esto se estudio mediante el empleo de antagonistas de los canales de Ca en la pre-sinapsis (omega(w)- conotoxina G6A = rojo) y antagonistas de los receptores nicotínicos (alpha-bugarotoxina = verde). Al superponer ambas señales se observa color amarillo, o q implica q la co-localización es perfecta. Durante el desarrollo neuro-muscular se produce esta alineación perfecta en las uniones neto-musculares y se produce una comunicación bi-direccional entre la motoneurona y la fibra muscular, q lleva a la diferenciación pre- y post- sináptica. En ello interviene la proteína agrina, secretada por la motoneurona (pre-sinapsis), q es esencial para q los receptores nicotínicos se acumulan y están alineados. La agrina tiene dominios análogos a la laminina, a la follistatina y al EGF. Los dominios de tipo laminina permiten su anclaje a la lamina basal. Cuando la agrina es liberada por la pre-sinapsis, interacciona con receptores LRP4 de la post-sinapsis. Los receptores LRP4 interaccionan con unas TyrK q se encuentran en la fibra muscular, las MUSK. Las MUSK se auto-fosforilan y fosforilan a los receptores nicotínicos en Tyr553, lo cual es esencial para su agrupamiento en las crestas. Hay una señalización retrograda necesaria para q la fibra nerviosa se detenga cuando llega a la fibra muscular. En ratones KO para MUSK se observa q la neurona sigue creciendo y no conecta con la fibra muscular (el nervio atraviesa el músculo y sigue creciendo =>no se detiene para inervar. 39 de 70 SINAPSIS DE ALTA EFICACIA: La probabilidad q cuando llega PA las vesículas se liberan es siempre menor q 1 (0.3 -0.6 y 0.6 es una probabilidad muy alta). La union neuro-muscular es una sinapsis de alta eficacia => probabilidad = 1 (siempre se liberan vesículas cuando llega PA). La union neuro-muscular es una sinapsis de alta eficacia, dado q cada terminal sináptica tiene decenas de miles de vesículas sinápticas y muchas zonas activas. La llegada del PA provoca la liberación de entre 150-200 vesículas, q activan los receptores nicotínicos y provocan una des-polarización post-sináptica de ~ 75 mV. Fatt y Katz observaron q la liberación de AcCh en la placa neuro-muscular (=zona activa) ocurre de forma cuantal, pues en reposo se detectaban mini-potenciales espontáneos (mEPPs) de amplitud muy pequeña (0.5 mV) en la post-sinapsis. Al estimular en condiciones de bajo Ca y alto Mg se produce la liberación solo cuando hay un estimulo (=> no espontáneos), entonces esta sintaxis deja de ser de lata eficacia y se observan fallos = potenciales post-sinápticos de 0.5mV o múltiples de este (1 o 1.5 o 2 o… mV). Liley observó q si en la zona pre-sináptica se hace pasar una corriente (=> se des-polariza la pre-sinapsis), la frecuencia de mEPPs aumenta. Mientras q si hay una híper-polarización la frecuencia de mEPPs disminuye. => la frecuencia de mEPPs puede alterarse si se altera el potencial de membrana pre-sináptico. Kuﬄer y Yoshikami determinaron cuantas moléculas de AcCh había en cada una de esas vesículas q se estaban liberándoos (~ 5000 AcCh q activan ~2000 receptores nicotínicos). => se necesitan 5000 moléculas de AcCh para producir una des-polarización del tamaño de 1 mEPP. Katz postuló: “la frecuencia de mEPPs esta enteramente controlada por las condiciones de la pre-sinapsis mientras q su amplitud esta controlada por las propiedades de la post-sinapsis (n° de receptores activos). Esto se debe a q en la lamina basal se encuentra la acetil_colin_esterasa q degrada una quinta parte de las moléculas de AcCh liberadas. Por otro lado, la mayor permeabilidad al Cl de la membrana de las fibras musculares hace q el potencial de reposo sea inferior al normal (-90mV < -70mV). La activación de los receptores nicotínicos produce un PA suficiente (-20mV) para superar el umbral de activación de los canales de NA dep. de voltaje y producir la contracción muscular. El potencial de placa es el q se obtiene cuando se abren los canales nicotínicos. Cómo se puede saber cuales Na entran por canales nicotínicos y cuales por canales de Na? Se utilizan inhibidores específicos de canales de Na => se observa solo el potencial de placa. El curare es un veneno q precede de una planta y actua inhibiendo a los canales de Na dep. de voltaje => impide alcanzar el umbral de activación de los canales de Na dep. de voltaje. => se produce la paralisis. Curare —| canales Na => no se genera PA. 40 de 70 Los receptores nicotínicos son permeable a Na pero también a K (entra Na y sale K) aunque la permeabilidad a K es baja. En algunas condiciones tapien el Ca puede entrar por los receptores nicotínicos. Mediante estudio de patch-clamp (whole-cell) se ha estudiado todas las características de estos receptores al ser estimulado con AcCh. Se fija el potencial de membrana a -90mV (fijar el potencial significa q no se produce des- o híper- polarización) y se añade AcCh en una pipeta. Al final se registran las corrientes. Resultados: se produce una corriente con amplitud de 2.7 pA (pico-amperio) y la velocidad de paso es de 17 x 106 iones/s.Ademas se observa q el tiempo de abertura de los canales nicotínicos varia. Cuando se fija el potencial de membrana a -130mV y se añade AcCh, la amplitud de esta corriente aumenta a 3.9 pA. Eso pq la entrada de Na es mucho mas favorecida para q se acerca al potencial de equilibrio de Na. 41 de 70 ESTRUCTURA DEL RECEPTOR NICOTINICO: El receptor tiene estructura en forma de cono, con un estrechamiento en la parte central. Son receptores ionotrópicos pentaméricos (5 subunidades): 2 subunidades alpha 1 subunidad beta 1 subunidad gamma o epsilon — gamma se expresa en estadios fetales, epsilon en adultos 1 subunidad delta Hay 2 sitios de uniones a AcCh en las subunidades alpha, cada uno formado por 6 a.a. No obstante intervienen también las subunidades beta y gamma q se encuentran adyacentes. La afinidad de os sitios de union es ≠ => la union de AcCh es cooperativa y se necesitan ambas moléculas para q el canal se abra. Ademas, en las subunidades alpha, las Cys192 y Cys193 están conservadas pq estabilizan el canal y en el N-terminal también se localiza un loop de Cys. Cada subunidad tiene 4 dominios M con ambos terminales (N- y C-) hacia el exterior. El dominio M2 forma el poro y en su interior hay a.a. negativos (Glu y Asp) q forman 3 anillos (uno en la parte externa y dos en la interna) q aportan la selectividad ionica al canal. Asi se permite el paso de cationes y se repele los aniones, tanto desde la cara citosolica al exterior (salida de K) como al revés (entrada de Na). 42 de 70 Hay otros 2 anillos en el segmento TM q son responsables de la apertura y cierre del canal: El anillo externo está formado por a.a. hidrofobicos (Leu) q soportan mal la estructura en alpha- hélice => forman pequeños codos. El anillo interno está formado por a.a. hidrofilicos (Thr y Ser) En estado de reposo, el receptor se encuentra en conformación cerrada —> las Liu se orientan de forma próxima entre si e impiden el paso de iones a través de ellas, mientras q Ser y Thr están distantes. En estado activo (se une la nicotina), el receptor tiene un cambio conformacional q aleja las Liu y aproxima las Ser y Thr, favoreciendo el transito de iones a través de los residuos hidrofilicos. A voltaje negativos se detectan corrientes de entrada de Na (predomina permeabilidad por Na) A voltaje positivos se detectan corrientes de salida de K Subunidad gamma: Durante el desarrollo se producen cambios en la expresión de las subunidades de los receptores nicotínicos y la subunidad gamma solo se expresa en los estadios pro-natales. Después es sustituida por la subunidad epsilon. Eso provoca una disminución en el tiempo de apertura del canal y aumenta su conductancia. Este proceso esta relacionado con la maduración de la sinapsis neuro- muscular, pues inicialmente las fibras están inervadas por mas de una neurona y los receptores nicotínicos no están agrupados. Después del parto, con la individualización de las neuronas y agrupación de los receptores en las crestas comienza a expresarse la subunidad epsilon. 43 de 70 ACETILCOLINA (AcCh): La AcCh se sintetiza a partir de acetil-CoA y colina, por acción de la acetil_transferasa de colina. Después, es incorporada en las vesículas sinápticas a traves del transportador vesicular de AcCh, q bombea 2 protones H+ al citoplasma por cada molecula de AcCh q transporta al interior. El gradiente de H+ determina hasta cuando la AcCh puede estar dentro. El tiempo de vida media de la AcCh en la hendidura sináptica defiende de las acetil_colin_esterasas (AchE) q hidrolizan la AcCh a colina y acetato (la colina es captada por terminales post-sinápticas para q sea reutilizable). Existen 2 tipos de acetil_colin_esterasas: 1. AchE homoméricas (en SNC) — están constituidas por 1 subunidad catalítica. Pueden ser monómeros, dímeros o tetrámeros solubles o bien pueden tener en C-terminal un glico_fosfolipido q permite su anclaje a la membrana (lábil). 2. AchE heteroméricas (en uniones neuro- musculares) — están constituidas por subunidades catalíticas y estructurales. Cada subunidad catalítica está formada por un tetrámero y este, a su vez, se une a través de puentes disulfuro a una fibra de colágeno. Las fibras de colágeno de 3 tetrámeros se entrelazan entre si y permiten la union a la lamina basal Pseudo_colin_esterasa: butiril_colin_esterasa liberada por el hígado e implicada en la hidrolisis de ésteres ingeridos en la dieta. No se encuentra en las uniones neuro-musculares ni en el SNC. Las AchE hidrolizan de forma normal una quinta parte de la AcCh liberada. INHIBIDORES DE AchE: Actúan sobre un residuo de Ser q se localiza en el entro activo de la AchE y producen el aumento de la cantidad de AcCh en la hendidura sináptica => se inhibe su degradación. La modificación q inducen puede ser: Reversible — carbamilación de la Ser —> neo_stigmina, fiso_stigmina (uso terapeutico en el tratamiento de Alzheimer) Irreversible — alquilación de la Ser —> di_ido_propil_fluoro_sfato (es un organofosforado empleado como plaguicida (pesticida) y en la guerra química. —> producen falta de oxigeno. 44 de 70 PATOLOGIAS ASOCIADAS A LA ALTERACION DE LA TRANSMISION SINAPTICA EN LA UNION NEUROMUSCULAR — SINDROME MIASTÉNICOS: La mayoría se deben a alteraciones metabólicas y algunas pueden tener carácter autoinmune, con mayor incidencia. El resto de los síndromes miasténicos congénitos son enfermedades raras. ALTERACIONES EN LA PRE-SINAPSIS: Síndrome congénito de escasez de vesículas — se debe a una disminución severa del n° de vesículas sinápticas en la placa neuro-muscular. Síndrome congénito de deficiencia del rellenado de vesículas — se debe a una alteración en los transportadores vesiculares Síndrome miasténico de Lambert-Eaton (LEMS) — es una enfermedad autoinmune en la q hay presencia de auto-anticuerpos frente a los canales de Ca tipo P/Q (92% y en algunos caso tipo N (33%)). La union de los anticuerpos produce la degradación de los canales => disminuye el n° de canales en la superficie de la pre-sinapsis. Fisiopatología — la liberación espontánea de AcCh es normal, pero la liberación regulada por Ca está disminuida pq la entrada de Ca en las terminales sinápticas es deficiente. => la transmisión sináptica inducida por la llegada de PA se ve afectada. La respuesta post- sináptica mejora con la estimulación repetida. Sintomalogía — debilidad muscular fundamentalmente en las zonas proximales de brazos y piernas, junto con alteraciones en el sistema parasimpático (sequedad de boca, impotencia, disminución de la sudoración) En el 60% de los casos, LEMS es previo a un carcinoma maligno de pulmón. Hoy en día se piensa q, como respuesta al carcinoma incipiente, el SI desarrolla anticuerpos cuyo epítopo es similar al de los canales de Ca llevando al desarrollo de la enfermedad. Tratamientos Sustancias q favorecen la liberación de AcCh — 4-aminopiridina (bloquea canales de K). El problema es q causa efectos secundarios => se utilizan derivados de este compuesto (3,4-diamino_piridina) q tienes efectos secundario solo en SNP => menos efectos secundarios. Plasmaféresis Terapia inmunosupresora 45 de 70 ALTERACIONES EN LA LAMINA BASAL: Síndrome congénito de deficit de acetil_colin_esterasa — es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en las subunidades estructurales de la AchE (en las fibras de colágeno): Mutaciones en el dominio de union rico en Pro (PRAD), implicado en la interacción de la fibra de colágeno con la subunidad catalítica. => se impide el ensamblaje Mutaciones en el C-terminal de la fibra de colágeno, implicado en el anclaje de la AchE a la lamina basal => no se forma la triple helice Fisiopatología — el deficit de AchE provoca un aumento de la vida media de AcCh en la hendidura sináptica y => los receptores nicotínicos permanecen abiertos un periodo de tiempo mayor incluso al periodo refractario de los canales de Na dep. de voltaje. En consecuencia, la caída de los mEPPs (mini- potenciales post-sinápticos excitatorios) es más lenta y eso puede permitir la apertura de canales de Na dep. de voltaje, así q un único estimulo puede generar más de un PA. Esto hace q la placa neuro-muscular esté activada más tiempo de lo normal, llevando a su degeneración y a una disminución del n° de receptores en la superficie. Sintomalogía — debilidad muscular generalizada. La severidad de los síntomas es mayor cuanto antes debuta la enfermedad. ALTERACIONES EN LA POST_SINAPSIS: Las alteraciones afectan a los receptores nicotínicos tanto a su expresión en la superficie como a su funcionalidad o su cinética. Miastenia gravis — se debe a una disminución del n° de receptores nicotínicos q se expresan en la placa neuro-muscular. La enfermedad puede tener 2 etiologías: Congénita — muy pocos casos Adquirida — origen autoinmune, con mayor incidencia Sintomalogía — debilidad muscular severa q se manifiesta principalmente en los músculos faciales q controlan el movimiento de los párpados y los ojos. También puede afectar a los músculos orofaringeos y en casos muy graves a la musculatura respiratoria. Cursa con episodio de remisión - exacerbación. Mediante la union de antagonista marcados radiactivamente (bungaro_toxina) se observa q las fibras musculares de los pacientes con miastenia gravis tienen menor densidad de receptores nicotínicos. 46 de 70 Clínica — se observa la diminución progresiva de la amplitud de los PAs al realizar ensayos de estimulación repetitiva sobre la fibra muscular, de forma q a partir del tercer estimulo practicante no se detecta ningún PA. Fisiopatología — la debilidad muscular se debe a la incapacidad de contracción (pq hay menos receptores). En condiciones normales, como el n° de receptores nicotínicos q se expresan en la placa neuromotora es elevado, la amplitud del PA siempre alcanza al umbral de activación de los canales de Na dep. de voltaje. En la miastenia gravis, como hay menor n° de receptores, estos se encuentran menos concentrados en la superficie y la depleción mediada por la AchE hace q la AcCh q llega a los receptores no sea capaz de producir un PA con amplitud suficiente para alcanzar el umbral de activación de los canales de Na dep. de voltaje. NO hay alteración el la liberación de AcCh !!! Como progresivamente la placa neuro-muscular se estimula en menor medida, finalmente se produce su degeneración q provoca la reversión de las invaginaciones => ↓[canales de Na dep. de voltaje] + ↓[receptores nicotínicos]. Así, una miastenia gravis mal tratada termina por derivar en parálisis. 47 de 70 Origen autoinmune — se han identificado auto-anticuerpos circulantes frente a los receptores nicotínicos. La union de los anticuerpos no impide ni altera la union de la AcCh a estos, sino q acorta su tiempo de vida media en la superficie de la membrana. Normalmente, la vida media de los receptores nicotínicos es de 5-7 días y después son internalizados por invaginaciones y se degradan en los lisosomas. Los anticuerpos acortan el tiempo de vida media a 2 días, por lo q la degradación es mucho mas rapida q la síntesis. => disminuye el numero de receptores nicotínicos en la post-sinapsis. El 15% de los pacientes con miastenia gravis presentan mayor propensión a desarrollar tumores benignos de timo, aunque se desconoce el porque. Al extirpar el timo, se observa una importante mejoría sintomatologica de la miastenia, lo cual se debe a q en este órgano es donde maduran los linfocitos T => se impide la generación de anticuerpos. Al introducir receptores nicotínicos de una especie A a otra B, se generan anticuerpos frente a estos y se observan los síntomas característicos de la miastenia gravis. Variante neonatal — aparece entre los 7-12 días tras el parto. En este caso, los anticuerpos frente a los receptores nicotínicos son transmitidos de la madre al feto a través de la lactancia. Tratamientos: Inhibidores de la AchE (pirido_stigmina) — al impedir la degradación de la AcCh, se compensa el deficit de receptores nicotínicos con el aumento del tiempo del agonista en la union neuro-muscular. Se observa recuperación inmediata de la movilidad Inmunosupresores (corticoides) Plasmaféresis — disminuye la cantidad de anticuerpos Timectomía — extirpación quirúrgica del timo 48 de 70 DEFICIENCIAS EN EL RECEPTOR DE ACCH: Se deben a alteraciones de la funcionalidad del receptor nicotínico. SINDROME DEL CANAL LENTO: Se debe a alteraciones en la cinética de los receptores nicotínicos de forma q el periodo de cierre del canal es mucho más lento. La caída de los mini-potenciales post-sinápticos excitatorios (mEPPs) presenta 2 pendientes, una inicial rapida y otra posterior muy lenta. Esto indica q algunos receptores funcionan de forma normal y otros tienen un mayor periodo de apertura. Etiología Mutaciones q afectan a la cinética de cierre del receptor — se producen en el segmento M2 y alteran los mecanismos de apertura y cierre del receptor Mutaciones q afectan a la disociación del ligando del receptor — se producen en el N- terminal, implicado en la union del ligando, y aumentan su tiempo de union al receptor. Sintomalogía — debilidad muscular en cervicales, escapulares y extensores de los dedos. La severidad de los síntomas es mayor cuanto antes debuta la patología. 49 de 70 TEMA 9: AMINOACIDOS NEUROTRANSMISORES Existen 3 a.a. neurotransmisores: Glu, GABA y Gly. La neuro-transmisión excitatoria está mediada por Glu, mientras q la neuro-transmisión inhibitoria por GABA. Las sinapsis glicinérgicas también son inhibitorias y están distribuidas por todo el SNC pero dominan en algunos núcleos concretos. Muchas veces las neuronas reciben simultáneamente estimulo inhibitorio y excitatorio => emiten una respuesta integrada buscando el equilibrio para el correcto funcionamiento del SN. Cuando la neuro-transmisión excitatoria se encuentra en equilibrio con la inhibitoria, no hay alteraciones del humor, aumenta la percepción sensorial y se facilita el proceso de aprendizaje y memoria => incrementa la plasticidad sináptica, la neuorgenesis… Cuando una de las sinapsis esta mas favorecida se produce un desequilibrio: Si predomina la neuro-transmisión excitatoria — ansiedad, insomnio, menor neuro-plasticidad, cambios volumétricos en el cerebro, mayor sensibilidad al dolor… Si predomina la neuro-transmisión inhibitoria — efecto ansiolítico, adormilación, reducción de procesos neuro- inflamatorios, reducción de la sensibilidad al dolor… TRANSMISION SINAPTICA EXCITATORIA — SINAPSIS GLUTAMATERGICAS El Glu se almacena muy concentrado en las vesículas sinápticas en comparación con su [ ] citosolica. Al ser liberado se une tanto a receptores ionotrópicos en la post-sinapsis q median la transmisión rapida, como a receptores metabotrópicos tanto en la pre-sinapsis (auto-receptores) q regulan la liberación de Glu como en la post-sinapsis. Los astrocitos recaptan el Glu liberado a la hendidura sináptica mediante sistemas de transporte específicos. En el interior de astrocitos, la Gln sintetasa transforma Glu en Gln. Gln está liberada y captada por las neuronas q, en el caso de las glutamatérgicas, la transforman de nuevo en Glu gracias a la glutaminasa. 50 de 70 TRANSPORTADORES Transportadores vesiculares de Glu = VGluT Se conocen 3 isoformas con localización ≠ pero con la misma cinética de transporte. Los transportadores más frecuentes son VGluT1 y VGluT2. VGluT3 se localiza en ≠ regiones del cerebro en menor cantidad. La actividad de todos los transportadores depende del gradiente electroquímico de protones generado en las vesículas gracias a la ATPasa. Ademas por cada Glu introducido se extrae un Cl q también debe entrar por otro canal independiente. Transportadores de Glu en las membranas Los transportadores q se localizan en las membranas, tanto pre- como post- sináptica, y en las células gliales son dependientes de Na, K y H+. NO son exclusivos para Glu sino q tambien transportan Asp. Se expresan en altas cantidades en todos los tejidos y en todo el organismo. Se introduce 1 Glu por cada 3 Na y 1 H+ q entran y 1 K q sale !!!!!! Todos los transportadores son proteínas multimericas formada por 3 subunidades q funcionan de manera independiente. Cada subunidad está constituida por 8 helices TM. Se conocen 5 isoformas q pueden ser homo- o hetero- trimeros. NO presentan diferencias cinéticas sino q la hetero-trimerización afecta a su localización subcelular, en la membrana plasmática o en los compartimentos intracelulares. Homo-trimeros: EAAT1 — células gliales EAAT2 — células gliales/neuronas EAAT5 — neuronas de la retina Hetero-trimeros: EAAT3 — neuronas EAAT4 — neuronas EAAT4 y 5 >>>> 1,2,3 Los transportadores EAAT4 y 5 se comportan como canales de Cl, pues la union de Glu permite su transito. En general, la ausencia de cualquiera de los canales no es extremamente grave, aunque todos dan un cierto fenotipo neurológico. Sin embargo, la ausencia de EAAT2 es más relevante y el fenotipo q se manifiesta es mas grave pq la vulnerabilidad ante cualquier aumento de Glu es mayor, puesto q no se consigue una correcta eliminación de la hendidura sináptica. Los ratones KO para EAAT2 mueren de forma prematura y sufren ataques epilépticos. 51 de 70 RECEPTORES IONOTROPICOS EN LA POST-SINAPSIS En la neuro-transmisión glutamatérgica están implicados 3 receptores ionotropicos (primeros 2 mas importante) Receptores AMPA — son permeables a Na y ligermente a K. Se activan por Glu y producen una respuesta rapida (des-polarizan la neurona post-sináptica). Su agonista farmacologico es el acido N-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazol_propionico Receptores NMDA — son permeables a Na y Ca y ligeramente a K. Están bloqueados por Mg => para su activación dependen tanto de la des-polarización inducida por la apertura de los receptores AMPA (q quita el bloqueo de Mg) como de la union del Glu. Producen una respuesta más lenta. Su agonista farmacologico es el N-metil-D-Asp. Receptores kainato — son permeables a Na y ligermente a K. Ante la llegada del PA y la liberación de Glu, siempre se activan primero los AMPA q permiten la entrada de Na y generan una des-polarización muy rapida y necesaria para el desbloqueo de los NMDA. Glu permanece en la hendidura sináptica el tiempo suficiente para producir igualmente la activación de NMDA. Como en situación de reposo el potencial de membrana es muy negativo, los receptores NMDA se encuentran fuertemente inhibidos por MG. Esta inhibición es dep. de voltaje. NMDA vs AMPA: La probabilidad de apertura de los receptores AMPA es mayor q la de los NMDA. Sin embargo, el tiempo de apertura de NMDAs es mayor y su afinidad es también muy elevada. La diferencia en la probabilidad de apertura se debe a q los receptores AMPA siempre se localizan en el centro de la zona activa, para garantizar q hay suficiente Glu para activarlos => requieren mayor [Glu]. Los receptores NMDA se encuentran en el extremo de la zona activa donde la [Glu] es menor. Cuando Glu es liberado en hendidura sináptica, primero se une a los AMPA => disminuye [Glu] y después con los NMDA q tienen mayor afinidad => requieren menor [Glu]. RECEPTORES AMPA — post-sinapsis: Son receptores tetramericos formados por 4 subunidades con un 80% de homología. Cada subunidad está compuesta por 3 dominios TM (1,3,4) y un dominio (2) q esta parcialmente en la membrana y forma el poro y el sitio de union a Glu. N-terminal se orienta hacia la cara extracelular (hendidura sináptica) y C-terminal hacia el citosol. Se conocen 4 subunidades (GluA) ≠. Las subunidades forman combinaciones homo- y hetero- tetramericas. La presencia de GluA2 confiere impermeabilidad al Ca dado q su modificación post- traduccional (Gln—>Arg) introduce un a.a. positivo q interfiere con el paso de este ion. Esta subunidad es recuente en los receptores AMPA de las sinapsis maduras, pero en los estadios de desarrollo aun no se ha producid la modificación de GluA2 => los receptores son permeables a Ca. La presencia de GluA2 modificada se puede determinar mediante la forma de las curvas de rectificación q relacionan intensidad y voltaje. Cuando forma parte del receptor AMPA, la relación del voltaje con la intensidad de corriente q pasa a través de este es lineal. 52 de 70 Las subunidades GluA2, A3 y A4 presentan ≠ isoformas, denominadas flip y flop, q son el resultado del splicing alternative. Se diferencian en una region de 38 a.a., y 9 de estos producen cambios en la cinetica del receptor: Las isoformas flip hacen q la de-sensibilización sea mas lenta Las isoformas flop hacen q la de-sensibilización sea más rapida. Agonista: Glu, AMPA Antagonistas: CNQX (competitivo) y benzo_diacepinas (no competitivos) REGULACION DINAMICA DE LOS RECEPTORES AMPA: - Composición en subunidades - Numero de receptores en la membrana - Cinetica del canal Principalmente en C-terminal hay números sitios de fosforilación (Ser) sobre los q actúan ≠ quinasa (CAMKII, PKC, PKA). La fosforilación del receptor aumenta la corriente q pasa a través de el y la probabilidad de apertura. => la fosforilación potencia la transmisión glutamatérgica, Mas receptores AMPA = ↑des-polarización = ↑amplitud Menos receptores AMPA = ↓des-polarización = ↓amplitud Ademas, las quinasas regulan el trafico continuo de receptores AMPA a la superficie, aumentando su expresión en la membrana. Esto se debe a los procesos de plasticidad sináptica (memoria, potenciación por aumento, depresión por retirada de receptores). RECEPTORES KAINATO: Agonistas: Glu , kainato (farmacologico) Antagonistas: CNQX (competitivo) Son receptores tetramericos formados por 4 subunidades cada una con 4 dominios. Se conocen 5 subunidades GluK diferentes: GluK1, GluK2, GluK3 — pueden formar tanto homo- como hetero- tetrameros GluK4 y GluK5 — solo forman receptores funcionales en combinación hetero-merica con una de las subunidades anteriores. En las sinapsis estudiadas, la subunidad mas abundante es GluK2. Del mismo modo q la subunidad GluA2 en los receptores AMPA, tanto GluK1 como GluK2 sufren esta misma modificación post-traduccional (Gln —> Arg) en el dominio 2, por lo q los receptores con estas subunidades son impermeables a Ca (cambia la conductancia). La cinética de activación y desactivación de los receptores de kainato es más lenta q la de los receptores AMPA. La corriente q pasa a través de ellos es muy pequeña pero como permanecen mucho mas tiempo abiertos, pasan suficientes iones para producir un cambio en el potencial de membrana. Para estudiar la cinética de los receptores kainato es necesario bloquear los receptores AMPA. Esto se consigue con potenciales de -80mV puesto q no hay acción de los receptores NMDA. Los receptores kainato se expresan en el hipocampo, en las sinapsis entre fibra musgosas y la region CA3, tanto en la pre-sinapsis (donde modulan la liberación de Glu y GABA), como en la 53 de 70 post-sinapsis (donde participan potenciando la neuro- transmisión). Asi, potencian la liberación de Glu y disminuyen la de GABA. Los mecanismos moleculares q median este proceso son ≠ en función del tipo de neurona. Se ha visto q la inyección sistémica de kainato en animales de experimentación induce convulsiones y un patrón de daño neuronal semejante al q produce la epilepsia en humano, debido a la inhibición de la liberación de GABA. RECEPTORES NMDA: Son receptores hetero-tetramericos formado por 4 subunidades cada una con 4 dominios. Se conocen 3 subunidades GluN diferentes y ≠ isoformas de cada una. Para ser funcionales, al menos 1 de ls 4 subunidades debe ser GluN1 y otra GluN2: GluN1 (8 isoformas) — presenta el sitio de union a Gly = co-activador de los receptores NMDA q permite la máxima actividad del receptor GluN2 (4 isoformas) — presenta el sitio de union a Glu = agonista fisiológico GluN3 (2 isoformas) Los receptores mas frecuentes en las sinapsis estudiadas tienen 2 subunidades GluN1 y otra 2 GluN2. La subunidad GluN3 es la q menos se expresa, y cuando está presente, la combinación mas habitual es 2 GluN1/GluN2/GluN3 q presenta menor conductancia, menor permeabilidad al Ca y menor bloqueo por Mg. La presencia de unas subunidades u otras condiciona la mayor o menor afinidad por unos agonistas u otros. Todos los receptores NMDA son permeables a Ca pero no todos tienen la mismas propiedades físicas. Esto se debe a q en la región TM2 la presencia de Asn implica permeabilidad a Ca, mientras q otros a.a. pueden dificultar su transito. Presencia de Cys q actúa como sitio REDOX Cuando ↑[H+] afecta a la funcionalidad de los receptores NMDA Antagonistas: APV, CPP MODULADORES ALOSTERICOS: Espermina — actúa como potenciador de la corriente q pasa a través de los receptores NMDA cuando esta presente GluN2B. Sobre el resto de las subunidades no tiene ningún efecto. Zinc — es antagonista de los receptores NMDA pero actúa sobre aquellos q expresan GluN2A Ifen_prodil — es antagonista con afinidad por aquellos q expresan GluN2B. Memantina y ketamina — se introducen en el poro del receptor NMDA donde inicialmente se encuentra el bloqueo por Mg y, después su activación, bloquean de nuevo el canal. => actual después perder el bloqueo por Mg El empleo de antagonistas farmacológicos permite determinar q tipo de subunidades forman los receptores. PROTEINAS ASOCIADAS A LOS RECEPTORES NMDA SINAPTICOS: Los receptores NMDA se encuentran en la post-sinapsis y a ellos se une un complejo de señalización formado por una gran variedad de proteínas q generan una electrodensidad post-sináptica elevada. Se encuentran proteínas de andamiaje (como la PSD-95) con dominios PDZ q permiten la interacción con otras proteínas, muchas dependientes de Ca (NO cintas, CAMKII…). 54 de 70 RECEPTORES NMDA SINAPTICOS Y EXTRA-SINAPTICO: Se ha visto q algunos receptores NMDA se localizan fuera de la sinapsis y, mientras q la actividad de los receptores sináptico es necesaria para q las neuronas no degeneren, la actividad de los receptores extra-sinápticos NO. => su aumento excesivo conduce la muerte neuronal. Son activados por un ↑↑↑[Glu] (liberación máxima) Los receptores sinápticos promueven la supervivencia pq inhiben la apoptosis mediante la inhibición de los genes pro-apoptoticos y la activation de los anti-apoptoticos. Esto es posible gracia a q las veas de señalización activada llevan a la activación de CREB q se trastoca al núcleo y promueve la expresión de genes de supervivencia. (ruta MAPK activa ERK —> RSK —> CREB o ruta calci_neurina —> TORC —> CREB). Los NMDA extra-sinápticos promueven la apoptosis (—>FOXO1/ FOXO3). Los NMDA sinápticos activan quinasas q fosforilan FOXO1/3 promoviendo la salida de estos del núcleo, mientras Los NMDA extra-sinápticos activan fosfatasas q des-fosforilan FOXO1/3 promoviendo la union al promotor de genes pro-apoptoticos. RECEPTORES METABOTROPICOS DE GLUTAMATO Los receptores metabotrópicos se agrupan en 3 familias. Ademas, algunos presentan varias isoformas debido al splicing alternativo del mRNA. GRUPO RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEINAS G VIA DE SENALIZACION 1 mGluR1 (a, b, c, d) G-alpha-q/11 Activacion PLC mGluR5 (a, b) 2 mGluR2 G-alpha-i/0 Inhibición AC mGluR3 3 mGluR4 Inhibición AC mGluR6 G-alpha-i/0 mGluR7 (a, b) mGluR8 (a, b) La localización mas probable de los receptores es la siguiente: Pre-sinápticos — no se encuentran en todas las sinapsis mGluR2 mGluR4 mGluR8 Sinápticos — se localizan en la zona activa de la pre-sinapsis + tienen baja afinidad mGluR7 Extra-sinápticos mGluR1/5 — post-sináptico mGluR2/3 — pre- y post-sináptico mGluR6 — post-sináptico Los receptores metabotrópicos no se expresan siempre. Sino q depende muy estrechamente del momento del desarrollo. 55 de 70 Los receptores metabotrópicos pertenecen a la familia de GPCRs con 7 dominios TM. Se caracterizan por un N-terminal muy grande q constituye 2 lóbulos extra-celulares entre los q se encuentran los 2 sitios de union a Glu. Generalmente forman dímeros unidos covalentemente a través de puentes disulfuro entre Cys del N-terminal. Suelen ser homo-dímeros pero también pueden formar hetero-dímeros entre receptores de las ≠ familias e algunos interaccionan con receptores de la familia A. La union del agonista produce el acercamiento de los lóbulos inferiores y el cambio conformacional se transmite a las proteínas G. La union del antagonista mantiene los lóbulos distantes así q el canal permanece inactivo. Algunos antagonistas competitivos se unen al sitio de union de Glu, mientras q otros son alostericos y se unen a otro sitio de union ≠, generalmente en la región de las hélices TM. Muchas empresas farmacéuticas se dedican al estudio y diseño de fármacos para estos receptores. PAM: moduladores alostericos positivo NAM: moduladores alostericos negativo ASPECTOS FISIOLOGICO Y PATOLOGICOS DE LAS SINAPSIS GLUTAMATERGICA Las sinapsis glutamatérgicas participan en la transmisión sináptica rapida => están muy implicadas en los procesos de aprendizaje y memoria. Un exceso de transmisión excitatoria produce cuadros epileptogénicos, mientras q su defecto se produce por procesos agudos como hiposa, isquemia, hipoglicemia e ictus. El ictus suele producirse como consecuencias de traumas q cursan con los efectos anteriores 2 neuronas q pierden la conexión sináptica tienden a degenerar. En todas las ENDs, inicialmente hay un problema sináptico q termina siendo un problema celular. ICTUS ISQUEMICO: La prevalencia del ictus isquémico en la población es muy elevada. En el 80% de los casos el ictus es trombótico (se produce la formación de un trombo en una de las arteria/vaso q llega al cerebro) y en el 20% de los casos es hemorrágico (se rompe un vaso sanguíneo). Incidencia muy elevada: 30% de las personas afectas de ictus mueren 30% de las personas afectas de ictus quedan con incapacidad severa. Cuando el ictus es trombótico, eso provoca una falta de riego => se va a tener un fallo anóxico (sin oxigeno) => hay muerte celular. La muerte celular provoca la liberación masiva de todo lo q hay dentro de esas neuronas, incluido el Glu. Cuando el [Glu]extracelular se mantiene elevada en el tiempo eso causa enfermedades como el ictus debido a q el glutamato es tóxico para el cerebro. En caso de ictus trombótico, el tratamiento habitual es la activación del plasminógeno tisular para disolver/romper el coágulo. El problema es q este tratamiento solo se puede aplicar en las primeras 6-8h tras el ictus y solo si se sabe con total certeza q se trata de un ictus es trombótico, puesto q si se activase el plasminógeno en condiciones de ictus ictus hemorrágico el problema se agravaría aun mas. => Cada vez más, se está realizando la eliminación quirúrgica del coágulo. 56 de 70 En la region infartada se distinguen 2 zonas: Core — zona en la q se produce la muerte neuronal (necrosis), debido a la reducción del riego sanguíneo. Esto deriva en isquemia severa y se activa la cascada citotóxica. La falta de energía se traduce en una des-polarización anóxica q lleva a la muerte celular (necrosis). Zona de penumbra — zona susceptible de neuro - protección, alrededor del core. Se reduce de forma parcial (no total) el riego sanguíneo y el fallo energético tampoco es total => esta zona es la q se intenta salvar con el tratamiento. La muerte neuronal es retardada, puesto q se expande desde el core como una onda, debido a la liberación al entorno de los componentes de las neuronas. Cuando hay un ictus, la células mueren y liberan Glu y eso induce la muerte de las neuronas en la zona de penumbra. CASCADA NEUROTOXICA DEL DAÑO ISQUEMICO CEREBRAL: En condiciones normales, las neuronas realizan glicolisis anaerobia para obtener energía necesaria para sus funciones, como mantener el equilibrio iónico gracias a la bomba Na/K q consume en torno al 50% del ATP formado. Cuando se produce isquemia, la reducción del flujo sanguíneo produce la depleción de energía => la bomba Na/K no puede funcionar => acidosis. Entonces, la bomba comienza a actuar a favor de gradiente, por lo q el flujo de iones se produce en sentido contrario y la membrana se des-polariza. => se produce una des-polarización causada por la caída energética. Esto provoca la entrada de Ca mediada por los canales de Ca dep. de voltaje q provoca la salida excesiva de Glu. Ademas, los transportadores q retiran el Glu de la hendidura sináptica son dependientes de Na y este ion debe ser de nuevo expulsado de la neurona mediante la bomba Na/K. Pero hay un deficit energético y la bomba no funciona correctamente => la acción de los transportadores también se reversa y comienza a expulsar Glu. En consecuencia, la [Glu] permanece elevada en la sinapsis durante un tiempo excesivo, lo q permite la activación de los receptores AMPA y NMDA. Esto, junto con el fallo de los sistemas de almacenamiento de Ca debido a un fallo de la bomba de Ca, provoca el aumento de la [Ca] intracelular q es tóxico pq produce peroxi_nitrato q causa un aumento del estrés oxidativo y sobretodo la apoptosis. Junto con la inflamación producida por la reperfusión y la consecuente liberación de citoquinas pro-inflamatorias se produce un daño irreversible en la célula q termina con la muerte celular (apoptosis). La eNOS genera NO q puede interaccionar con ROS y generar la peroxidación de los lípidos y al final la muerte de las neuronas. El Ca, ademas de producir NO, activa distintas lipasas/ proteasas calpaínas/ endonucleasas y todas estas provocan apoptosis. => la des-regulación de Glu y de Ca provoca la muerte celular. 57 de 70 TRATAMIENTOS: Se han realizado ensayos con distintos fármacos neuro-protectores en animales de experimentación a los q se les ha inducido el infarto cerebral agudo isquémico, obteniendo resultados positivos. Sin embargo, en los ensayos clínicos los resultados NO han sido iguálense satisfactorios. Si se trata el ictus en las primeras horas se puede introducir por las arteria una maquinaria q se abre como un paraguas y elimina el trombo, liberando la arteria. Cuando ya han pasado varias horas desde los primeros síntomas, no hay un tratamiento posible. Mirando a la cascada isquémica se pensaba de poder actuar en muchos ≠ niveles y entonces encontrar mucho tratamientos ≠: - Bloqueantes de canales de Na - Antagonistas de NMDA - Antagonistas de canales de Ca - Potenciadores de GABA - ….. Se ha demostrado q todos estos disminuyen el tamaño del infarto pero cuando se pasó a la fase clínica, ninguno ha funcionado. e.g. Los antagonistas de NMDA es verdad q pueden reducir el volumen/tamaño del infarto cerebral pero van a bloquear la transmisión sináptica de todo el cerebro, no solo de la parte Core (parte infartada) => era imposible q funcionasen. Entre las posibles causas q explican el pq los resultados no son transnacionales se encuentran: Ventana temporal — en animales se sabe el momento en el q se va a provocar el ictus. Cuando se está testando un tratamiento en el laboratorio, muchas veces se está poniendo el tratamiento antes de inducir el infarto en el animal (pero en los pacientes primero ocurre el ictus y después se suministra el tratamiento). Heterogeneidad de los pacientes — muchos tienen edad avanzada lo q implica q ademas tienen patologías y tratamientos múltiples q dificultan la efectividad Dosis terapéuticas — en animales de experimentación se pueden usar dosis elevadas q en ocasiones pueden llegar a exceder la dosis de seguridad en humanos y no se sabe q va a pasar a largo plazo Se han propuesto nuevas estrategias terapéuticas: Profilaxis — para impedir la patología lo mas posible Empleo de antagonista de receptores NMDA q actúan solo en la zona infartada — e.g. ifenprodil es un antagonista no competitivo q es activo a pH acido (pH bajo) y inactivo a pH normal => solo actúa en las zonas infartadas. Esto se debe a q en estas regiones se produce acido láctico, con consecuencia de la glicolisis anaerobia q llevan a cabo las neuronas para obtener toda la energía posible, en ausencia de oxigeno. Reducción de Glu plasmático — para asegurarse q la [Glu] sea siempre baja, mediante diálisis peritoneal (dializando el Glu plasmático) Cuando hay un ictus, esos edemas (esas inflamaciones) alteran la permeabilidad de la BHE (barrera hematoencefalica). REDUCCION DE GLU EN SANGRE (EXTRAELULAR) *ENSAYO CLINICO: En sangre, la [Glu] se encuentra en torno a 60-10 mM, pero no se produce su paso al parénquima dónde se mantente con [ ] baja. Esto es gracias a la BBB q presenta transportadores concentrativos q transportan el Glu y lo concentran en las células endoteliales. En la membrana luminal hay un transportador q funciona a favor de gradiente. Cuando se produce un daño, las células liberan el Glu y hay q evitar su llegada al tejido sano para q no se produzca su muerte. => es necesario disminuir el Glu en la sangre con una diálisis peritoneal. 58 de 70 TRANSMISION SINAPTICA INHIBITORIA: GABA es ampliamente distribuido en SNC La Gly esta en el tronco cerebral, medula espinal, retina, núcleos caudales Las neuronas integran las señales procedentes de todas las aferencias q reciben. Las aferencias inhibitoria producen la apertura de canales de Cl q son los receptores de GABA y Gly y su entrada provoca la híper-polarización de la membrana. => aumenta la carga negativa en el interior y eso dificulta la des-polarización y la generación del PA. => necesitamos muchos mas estimulos para superar el umbral y generar el PA. Para conseguir la des-polarización se debe superar el umbral de activación de los canales de Na dep. de voltaje (en torno a -55mV). En consecuencia, en una neurona q recibe múltiples aferencias, tanto inhibitorias como excitatorias, para conseguir la formación del PA el conjunto de los estimulos excitatorios debe ser lo suficientemente intenso. Si no se supera el umbral, la neurona queda inhibida. Sin embargo, en las primeras etapas del desarrollo GABA y Gly actúan como NTs excitatorios, debido a q el potencial de equilibrio del Cl es mucho mas positivo. Esto se debe a q en las neuronas jóvenes no se expresan los co-transportadores Cl/Na q expulsan ambos iones al exterior celular => la [Cl] en el interior es mayor q en el caso de neuronas adultas. Eso sitúa el potencial de equilibrio del Cl mucho mas positivo => cuando GABA y Gly se unen a los receptores y activan los canales de Cl, el Cl sale de la neurona y la membrana se des-polariza. Para calcular el potencial de equilibrio se tiene en cuenta la [ ] intra- y extra- celular a la q el flujo neto es 0. Si el potencial es positivo, hay salida de Cl, mientras q si es negativo se produce su entrada. El potencial de equilibrio de Cl es -70mV (a este mV no hay movimiento neto de Cl). Cuando tenemos poténciales mas positivos, el Cl vas a entrar. Pero si fijamos el potencial de membrana en potenciales mas negativo, cuando los canales se abren el Cl vas a salir. SINAPSIS GABAERGICAS: GABA se obtiene a partir de la des-carboxilación del carbonio alpha de Glu. Se conocen 2 isoformas de la enzima acido glutámico des-carboxilasa (GAD) con ≠ afinidad por el fosfato piridoxal. En la pre-sinapsis, GAD transforma Glu en GABA y GAD depende de su co-enzima, el fosfato piridoxal. TRANSPORTADORES DE GABA: GABA es transportado al interior de las vesículas sinápticas mediante el transportador vesicular de a.a inhibitorios (VIAAT) q es común para GABA y Gly (=> hay competencia). Para ello utiliza tanto la corriente química como eléctrica del gradiente de protones generado por la ATPasa para permitir a GABA de acumularse dentro de las vesículas. GABA es liberado en la hendidura sináptica y se une a receptores ionotrópicos (GABAa) y metabotrópicos (GABAb). Tras ser liberado y después de activar sus receptores, GABA es retirado de la hendidura sináptica mediante sistemas de transporte electrogénicos dependientes de 2Na y Cl. Existen 3 transportadles fundamentales: 1. GAT1 — localización neuronal (mas abundante) 2. GAT2 — localización endotelial 3. GAT3 — localización glial Todos los 3 se han encontrado en neuronas pero están mas frecuentas en estas localizaciones Cada transportador transporta 1 carga + hacia el interior (GABA= neutro, Cl- y 2NA+) 59 de 70 Al ser recaptado en las neuronas, GABA se recicla para volver a ser introducido en las vesículas. Por otro lado, en los astrictos se metaliza de forma paralela al TCA. Primero, el GABA sufre una trans_aminación con alpha-keto_glutarato (alpha-kg), dando lugar a Glu y a un semi_aldheído succínico (se transfiere el grupo amino de GABA a alpha- kg). Este ultimo se oxida posteriormente a succinate e ingresa de nuevo en el TCA. Por lo general, el Glu formado sale de nuevo al torrente y es captado por las neuronas tanto glutamatérgica como GABAérgicas. RECEPTORES DE GABA: Receptores ionotrópico GABAa (GABAc también es ionotrópico): Desde el punto de vista farmacológico, los GABAa son de los más complejos. Los receptores funcionales están formados por estructuras pentamericas, similares al receptor de AcCh. Se conocen varias subunidades pero la mayoritaria es la alpha dado q presenta el sitio de union a GABA. En el sitio de union para GABA se situa la subunidad alpha y la interfaz con las betas y se unen ≠ moléculas a eso receptor. Cada subunidad presenta varias isoformas: e.g. de alpha se conocen 6 isoformas ≠, cada una con expresión diferencial en una región cerebral concreta (alpha6 se encuentra solo en el cerebelo). (En la retina existen subunidades exclusivas (pi)) Las subunidades q forman el receptor afectan a la afinidad por GABA, antagonistas y múltiples activadores. La combinación mas frecuente es (alpha1)2(beta2)2gamma2. Cada subunidad presenta 4 segmentos TM con ambos extremos N- y C- terminales hacia el exterior (N- muy grande, C- más pequeño). El segmento TM2 forma el poro a través del q transita Cl. Agonistas: GABA, muscimol (farmacologico) Antagonistas (eliminan la corriente de Cl => eliminan la acción inhibitoria de GABA => se potencia la transmisión excitatoria y esto se traduce en convulsiones epilépticas): bicuculina (competitivo), picrotoxina (no competitivo — bloquea el canal de Cl) Activadores se unen a los receptores y potencian la acción inhibitoria de GABA. Algunos aumentan el tiempo de apertura, otros modifican el tiempo de inactivación… pero en todos los casos se observa una mayor entrada de Cl. Tienen efectos tranquilizantes, ansiolíticos, anti-convulsionantes y sedantes. Entre ellos se encuentran: Benzo_diacepinas — aumentan el tiempo en el q el receptor está abierto diazepam (Valium), clordiaze_póxido (Librium), alprazolam (Xanax) Barbitúricos—aumentan la probabilidad q el receptor se abra => aumentan corriente Cl Esteroides —potencian el acción de GABA => la corriente de Cl. La des-compensación de la transmisión GABAérgica produce convulsiones epilépticas. Durante el ciclo menstrual, la sintomalogía se agrava en mujeres con epilepsia (epilepsia catamenial) debido a la disminución de la progesterona q dejan de unirse a GABAa y eso se traduce en un aumento de convulsiones. => se produce como consecuencia de la perdida de la acción potenciada q los esteroides ejercen sobre GABAa Etanol — es altamente peligroso Inhibidor: Zn 60 de 70 Receptores metabotrópico GABAb: Son receptores muy voluminosos con 2 glóbulos en N-terminal y en C-terminal están unidos intra-celularmente. Son GPCRs con 7 dominios TM, un extremo N-terminal extracelular y residuos de Cys conservados. El receptor funcional es un hetero-dímero formado por 2 subunidades ≠ q dimerizan a través del extremo C-terminal. Los extremos C-terminales son necesario para q el receptor se encuentre activo (dímero) y interaccionan con ≠ proteínas intracelulares. GABAb1 — presenta el sitio de union a GABA. Se conocen 2 isoformas debidas a splicing alternativo (a, b) con localización subcelular y funciones ≠. GABAb1a incluye 2 repeticiones en el N-terminal, denominados dominios sushi y se encuentra en axones (pre-sinapsis). GABAb1b se localiza en dendritas (post-sinapsis). GABAb2 — se localizan en pre-sinapsis y están acoplado a proteínas G-alpha-i/0, por lo q actúan inhibiendo a la adenilato ciclasa (AC), bloquean los canales de Ca (subunidad beta y gamma se unen a canales Ca y los inhiben) y activan los canales de K tipo GIRK (r.r.) q se activan por proteínas G => llevan a la inhibición de la neuro-transmisión. GABAb2 es necesaria para q GABAb1 se localice sobre la membrana y para interaccionar con otras proteínas. GABAb1 es la q interacciona con el ligado/agonistas Tienen mas afinidad a GABA los q tienen dominios sushi => q tienen GABAb1a Agonistas: GABA y bactofen Antagonista: faclofen Evidencias experimentales de la dimerizacion del GPCR: GABAb1 y GABAb2 se clonaron simultáneamente y se observo q, al expresar solo GABAb1, el receptor quedaba retenido en el RE y no señalizaba. Cuando se expresaba solo GABAb2 sí se producía la union a las proteínas G, pero tampoco se activaba la señalización. Esto solo ocurría cuando se co-expresaban ambos receptores => la dimerizacion es necesaria para la funcionalidad y el trafico de los receptores a la superficie. 61 de 70 SINAPSIS GLICINÉRGICAS: Se distribuyen en todo SNC pero se concentran mas en medula espinal, tronco del cerebro (núcleos caudales) y retina. TRANSPORTADORES DE Gly: Gly se almacena en las vesículas sinápticas a través del VIAAT. Cuando Gly es liberada se une únicamente a receptores ionotrópicos y abre canales de Cl => Cl entra y híper- polariza la membrana. Durante el desarrollo Gly es excitatorio pq hay un potencial de equilibrio de Cl mas positivo ([Cl] en interior mayor q en neuronas adultas) => Cl sale de neurona y la des- polariza. En neuronas adultas hay el co-transportador Cl/K o Cl/Na (Cl sale y K/Na entra) disminuye [Cl] al interior => el potencial de equilibrio de Cl se vuelve mas negativo => cuando lo receptores se activan y abren canales de Cl, Cl entra. En su eliminación de la hendidura sináptica intervienen transportadores de Gly dep. de Na y Cl (GlyT) formados por 12 segmentos TM muy glicosilados, 1 loop extracelular glicosilado entre dominio 3 y 4 y los extremos N- y C- terminales hacia la cara intracelular (50% de homologa entre GlyT1 y T2). Difieren en la estiquiometria (ademas GlyT2 tiene N- terminal mas largo): GlyT1 — se encuentra en terminales glutamatérgicas y en células gliales (astrocitos). Co- transporta Gly con 2Na y 1Cl. Presenta 5 isoformas ≠, 3 de ellas debidas a splicing alternativo de N-terminal (1a, 1b, 1c) y 2 de C-terminal (1d y 1e). GlyT2 — tienen localización neuronal, en las terminales glicinérgicas. Co-transporta Gly con 3Na y 1Cl por lo q permite acumular mayor cantidad de Gly, dado q genera mas energía con el gradiente. Presenta 2 isoformas ≠ en N-terminal. GlyT2 tiene un sitio de fosforilación por PKC entre dominio 4 y 5 (loop intracelular) q cuando es fosforilado, disminuye la capacidad de transporte. Dependiendo de la [Cl] los transportadores GlyT1 pueden revertirse (no ocurre en GlyT2). Por tanto, pueden contribuir a la liberación de Gly de forma Ca-independiente => no exocitótica. Por tanto, podemos tener la liberación de Gly tanto en sinapsis como en astrocitos por el transportador GlyT1 y tanto hacia el interior como hacia el exterior. Eso no ocurre en GlyT2 pq se encuentra menos próximo al equilibrio de Gly, dado q produce un orden de magnitud mayor en gradiente (3 NA+ + 1Cl- = 2 cargas + al exterior). Dado q GlyT2 transportan [Gly] mayor se pesaba q era esto el responsable para el aclaramiento de Gly. Pero en ratones KO por GlyT1 se ve q la corriente de Gly es potenciada, lo q implica q Gly permanece mas en la hendidura sináptica => es GlyT1 el responsable para el aclaramiento de Gly. El KO para GlyT2 produce una disminución de la transmisión glicinérgica pq Gly no es transportado en pre-sinapsis => no entra en vesiculas => no es liberado. Ambos KO producen la muerte de ratones en pocas semanas. RECEPTORES DE Gly: Gly activa receptores ionotrópicos con estructura pentamerica de forma hetero-merica. Solo en estadio Peri-natal hay pentameros de forma homo-merica pq solo se expresa la subunidad alpha2, y estos no se encuentran en zona sináptica. Existen 2 tipos de combinaciones posibles: Alpha3-beta2 o 3 alpha + 2 beta Alpha2-beta3 (mayoritaria) o 2 alpha + 3 beta Alpha1 se expresa en medula espinal y tronco cerebral Alpha3 se expresa en medula espinal y tronco cerebral y núcleos caudales Alpha2 en embrion Alpha4 en pollo ?? El dominio 2 actua como sensor => a.a. positivos 62 de 70 La union de Gly a los receptores produce la entrada de Cl, de forma q se hiper-polariza la membrana y se impide la formación del PA. A su vez, las subunidades beta están unidas a gefrina, una proteína q interacciona con coli_bistina, implicada en la polimerización de actina. => Gefrina regula la interacción del receptor con el citosqueleto. Cuando hay una des-polimerización de microtubulos, disminuye el n° de receptores de Gly. También la gefrina interacciona con Raft1, relacionada con la síntesis de proteínas. La gefrina puede formas estructuras dimericas y trimericas, dando lugar a mallas a las q se anclan los receptores. La des-polarización de la membrana produce la perdida de la interacción con gefrina y también se pierde la localización del cluster de receptores en la densidad post-sináptica. Por otro lado, la union de Gly a los receptores NMDA facilita la respuesta a Glu, pues Gly puede actuar como NT excitatorio en las sinapsis glutamatérgicas. Receptores NMDA son activados por Glu q se une a subunidad NR2. Gly es un co- activador de estos receptores, uniéndose a subunidad NR1, potenciando las actividad de esos receptores. En algunas sinapsis se han observado receptores NMDA formados solo por subunidades NR1 y NR3 (sin NR2 => insensible a Glu). Esto implica q Gly actua como activador (= NT excitatorio) y no co-activador. Aun no se conoce bien la función q tienen. El Zn tiene acción dual en GlyR: A bajas [ ] actúa como efector alosterico positivo — mediante estudios con canal único se ha visto q aumenta el tiempo en el q esta abierto el canal y la frecuencia de apertura, lo cual se traduce en una mayor entrada de Cl a las células => mayor inhibición de la sinapsis. A elevadas [ ] actúa como inhibidor => bloquea los receptores de Gly. Los esteroides regulan los receptores de Gly, potenciándolos y inhibiéndolos (mientras q solo potencian los receptores de GABA) El alcohol potencia los receptores de Gly (como los receptores de GABA) Antagonista = estigmina q puede producir muerte Agonista = taurina y alanina actúan como efectores alostericos positivos de los GlyR pero la afinidad de estos depende de las subunidades q lo formen en ausencia de Zn, la taurina es un agonista parcial pq nunca llega a la estimulación máxima de los receptores en presencia de Zn, la taurina es una gonista completo, llegando a la estimulación máxima de los receptores. ALTERACIONES EN LA TRANSMISION GLICINERGICA: Hiperplexia — se debe principalmente a mutaciones puntuales (1 solo a.a.) en las subunidades alpha1 del GlyR, aunque también se han visto en los sistemas de transporte y en las subunidades beta. Se produce una disminución de la afinidad de los receptores a Gly => disminuye la respuesta inhibitoria glicinérgica, q conlleva una respuesta exagerada ante cualquier estimulo. Ratón espasmódico — se debe a una mutación en la subunidad alpha1 q resulta en una disminución de la afinidad del receptor por Gly. Se producen espasmos. 63 de 70 TEMA 10: MECANISMOS DE APRENDIZAJE Y MEMORIA Aprendizaje: adquisición de conocimientos, experiencias…q se almacenan e estructuras celébrales. Si posteriormente somos capaces de traer ese aprendizaje almacenado, entonces se habrá convertido en memoria. Para q se produzca el aprendizaje, las conexiones sinápticas deben ser plásticas. Esto implica q unas se refuerzan y otras se pierden. No se puede memorizar algo q no se entiende => mecanismo de aprendizaje y memoria van de la mano (junto) HISTORIA: La regionalización funcional del cerebro permitió entender q ciertas regiones concretas del cerebro están implicadas en procesos determinados. Area de Broca — fue identificada por P.P.Broca. Se sitúa en el lobulo frontal izquierdo del cerebro y está relacionada con la capacidad de aprendizaje y expresión del lenguaje. La afección de esta área impide la emisión de frases gramaticalmente correctas, no por falta de conocimiento, sino pq los pacientes no consiguen expresar lo q desean. Esto se conoce como afasia de Broca. Lobulo temporal — W. Penfield observó q, al estimular el lobulo temporal en un paciente despierto, este recordaba una experiencia previa. W. Penfield era un cirujano q trataba pacientes epilépticos q no responden a fármacos, por lo q la única manera de tratarlos era de resecar zonas del celebro dañadas por atados epilépticos. Gracias a esto se identificaron las regiones cerebrales implicadas en los procesos de aprendizaje y memoria. Posteriormente, B.Milner observó q un paciente de 27 años al q se le tuvo q resecar el lobulo temporal desarrolló una amnesia anterógrada => era incapaz de recordar un hecho mas allá de algunos segundos (la memoria a corto plaza era imposible de recuperar). El paciente ademas desarrolló cierta amnesia retrograda, por lo q tampoco era capaz de recordar lo q le había sucedido en los 2 años anteriores a la intervención, aunque sí lo q pasó tiempo mas atrás (con lagunas). Sin embargo, las habilidades motoras estaban intactas (e.g. continuaba a ser capaz de ir en bicicleta). (Se pueden operar pacientes despiertos pq no hay receptores de dolor en cerebro) Esto permitió hablar de 2 tipos de memoria: Memoria explicita o declarativa —> memoria de los hechos, acontecimientos, aprendizajes semánticos, personas, lugares, experiencia de vida, estudios… Este tipo de memoria requiere voluntad, pensamiento, razonamiento… => es un proceso activo q requiere atención. Implica al lobulo temporal, al hipocampo y a la parte de la corteza cerebral proxima al hipocampo. Memoria implícita, motora o no declarativa —> memoria relacionada con procedimientos y habilidades motoras, implica a la amigadla, al cerebelo y al estriado. 64 de 70 MECANISMO DE APREDIZAJE EN INVERTEBRADOS: Para estudiar estos procesos es necesario recurrir a modelos sencillos, como los invertebrados. Kandel utilizó como modelo experimental el caracol marino gracias a su característico movimiento reflejo (memoria implícita) q produce el encogimiento de la agalla al rozar su sifón (estimulo) “produce il restringimento della guglia sfiorando il sifone”. Su sistema nervioso consta de 20 000 neuronas fácilmente identificables entonces se saben los circuitos nervioso. El sifón está conectado por neuronas sensoriales q hacen sinapsis con una motoneurona q inerva la agalla. La cola está inervada por muchas neuronas, entre ellas neuronas sertoninérgicas q hacen sinapsis con la neurona sensorial (q contacta también con el sifón) y con interneuronas inhibitoria y excitatoria q conectan la motoneurona. La cola está inervada también por neuronas L29 y SCP, pero estas no tienen un papel relevante en este mecanismo de aprendizaje. El caracol marino es capaz de aprender mediante 2 procesos: 1. Mecanismo de habituación — se produce como consecuencia de una disminución en la respuesta, debido a un estimulo inocuo repetido varias veces. El caracol aprende a no retirar la agalla, puesto q el estimulo recibido no es nocivo. Lo q ocurre en este proceso es q ciertas neuronas dejan de liberar NTs o liberan menos, de forma q cada vez el estimulo genera un PA de menor tamaño. 2. Mecanismo de sensibilización — al combinar un estimulo no nocivo con otro nocivo (fuerte) se produce una respuesta potenciada (retracción de agalla mas fuerte). Lo q ocurre es un aumento en la liberación de NTs (las neuronas sertoninérgicas liberan serotonina q estimula la neurona sensorial de manera mas fuerte así q libera mas NTs => la motoneurona es mas estimulada => la contracción de la agalla es mas fuerte). Ademas las interneuronas inhibitoria y excitatoria regulan esta contracción pq también conectan con motoneurona. La sensibilización puede eliminar los efectos de la habituación, proceso q se denomina des- habituación. CIRCUITO DE REFLEJO DE RETIRADA DE LA AGALLA EN APLYSIA (Caracol marino) El sifón está inervado por neuronas sensoriales, q hacen sinapsis con las neuronas motoras, estas controlan la contracción/relajación de la agalla. Por otro lado, la cola está inervada por varias neuronas: Neuronas serotonérgicas — conectan con las neuronas sensoriales del sifón, con las neuronas motoras y con las interneuronas inhibitorias y excitatorias. El aumento de la respuesta se produce por la liberación de serotonina, q estimula a las neuronas q inerva y aumenta la excitación al coincidir el estimulo en la cola con el del sifón. => La serotonina es la responsable de la sensibilización. Interneuronas moduladoras (SCP y L29) 65 de 70 MECANISMO DE SENSIBILIZACIÓN A CORTO Y LARGO PLAZO: Se puede hablar de sensibilización a corto plazo (minutos) y a largo plazo (días, semanas). Si en vez de tener un único estimulo nocivo tenemos varios estimulos repetidos se produce una sensibilización mas duradera (a largo plazo). Esto es lo q subyace a los mecanismos de aprendizaje. A corto plazo — la serotonina se une a sus receptores metabotrópicos acoplados a proteínas Gs q estimula a adenilato ciclasa (AC). En consecuencia, aumenta [cAMP] y se activa PKA q fosforila los canales de K y Ca. Los canales de K fosforilados están cerrados => PA dura mas tiempo => entre mas Ca => se liberan mas NTs. A largo plazo — se altera la expresión génica lo q puede estar acompañado de un aumento del n° de aferencias q llegan a la motoneurona. Por tanto, se incrementa el n° de sitios de liberación de NTs. En este caso, la PKA está activa de manera persistente pq se hidrolizan las subunidades reguladoras así q las subunidades catalíticas sean mas activa y reclutan a MAPK y ambas quinasas se translocan al núcleo: - PKA fosforila y activa a CREB1 q se une al DNA y q está muy implicado en los procesos de memoria. - MAPK fosforila y inhibe a CREB2, reforzando la activación de CREB1 (pq CREB2 —| 1). En Aplysia se han identificado hasta 10 genes implicados en los procesos de sensibilización a largo plazo, relacionas con cambios morfológicos: Disminución de la expresión de moléculas de adhesión celular, análogas a NCAM. Posibilita cambios en el árbol axónico, de forma q las neuronas sensoriales pueden establecer conexiones adicionales con la célula post-sinápticas. Expresión de una Zn proteasa q activa al factor TGF-beta. Esta señaliza via MAPK y refuerza sus efectos. Expresión de una ubiquitina hidrolasa q aumenta la degradación de la subunidad reguladora de la PKA, por lo q favorece su activación durante mas tiempo. Hay un dialogo estrecho entre genes y sinapsis mediante la activación de los receptores metabotrópicos de serotonina. En muchas ocasiones, estos mecanismos llevan a la aparición de nuevas dendritas y terminales aferentes. Glu activa receptores ionotropicos => respuesta rapida (ms) Serotonina activa receptores metabotropicos => respuesta mas duradera (min, horas) y si hay una activación repetida hay un cambio en expresión génica q puede durar días o semanas. Por tanto, mientras q en el proceso de habituación disminuye el n° de contactos entre las neuronas sensoriales y las motoras, en la sensibilización se forman nuevos. Ambos son procesos de aprendizaje e implican cambios estructurales en la neurona sensorial. El aprendizaje implica en algunos casos la debilitación de un contacto sináptico y, en muchos otros, su refuerzo no solo a nivel de la pre-sinapsis sino también de la post-sinapsis, pues la espinas dendriticas adquieren mayor tamaño y albergan un mayor n° de receptores. 66 de 70 MECANISMO DE APREDIZAJE EN VERTEBRADOS: En los años 70 e describieron en el hipocampo las Place Cells (PC) = celulas q se disparan selectivamente cuando el animal entra en un espacio determinado, permitiendo identificar donde se encuentra. Estas celulas guardan al recuerdo de la orientación espacial y se vio q su activación se producía cuando el animal exploraba el territorio desconocido. Al mismo tiempo, se describieron los procesos de plasticidad en el hipocampo, lo q actualmente se conoce como la potenciación a largo placo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD). En LTP se van a reforzar las transmisiones sinápticas => aumenta liberación NTs En LTD se van a disminuir las transmisiones sinápticas => disminuye liberación NTs El hipocampo está directamente implicado en el aprendizaje de muchos tipos, puesto q sus neuronas emiten proyecciones bien establecidas en 3 vías: Vía desde la corteza a las neuronas granulares del giro dentado. Vía musgosa, desde las neuronas granulares a las fibras musgosas q hacen sinapsis con las neuronas piramidales de la capa CA3. Vía desde las neuronas piramidales de capa CA3 a las piramidales de la capa CA1. Todas son sinapsis glutamatérgicas, por lo q ante un tren de PA de alta frecuencia, todas las sinapsis se ven potenciadas a largo plazo. Todas las 3 son plásticas y pueden experimentar LTP. LTP y LTD EN EL HIPOCAMPO: Las LTPs tienen unas características q fueron definidas por Hebb para las LTPs actualmente denominadas gerianas, pues hoy se sabe q no todas son así. Estas característica incluyen: Estado dependiente — la membrana post-sináptica debe estar suficientemente des-polarizada para propiciar la LTP, teniendo en cuenta los estimulos procedentes de las ≠ aferencias. Por tanto, se requiere la participación de la pre-sinapsis (q tienen q liberar suficientes NTs para q post-sinapsis sea suficientemente des-polarizada). Esto no ocurre así en el caso de la vía musgosa. Especificidad — solo se induce la LTP en la sinapsis ya activa, no las de alrededor. Cooperatividad — el conjunto de estimulos simultáneos puede provocar la suficiente des- polarización para producir la LTP. Asociativa — cuando un impulso débil q nunca produciría una LTP se combina con uno fuerte, el impulso débil se ve potenciado y los 2 pueden inducir LTP. Estas características reflejan las de los receptores NMDA, ya q una pequeña liberación de Glu no es capaz de activar a los receptores NMDA si no se ha producido la des-polarización suficiente dependiente de la activación previa de los receptores AMPA, puesto q el Mg seguiría bloqueando el canal a pesar de q se une al Glu. Esto implica q, en el caso de las sinapsis de hipocampo, los receptores NMDA post-sinápticos median tanto la LTP como la LTD, a traves de la entrada de Ca: - LTD se genera cuando hay trenes de estimulación de baja frecuencia (1Hz por 10 min) — el siguiente estimulo va a producir una respuesta menor en post-sinapsis pq la sinapsis se queda deprimida. - LTP se genera cuando hay trenes de estimulación de alta frecuencia (2 estimulos de 100Hz) — el siguiente estimulo va a producir una respuesta mayor en post-sinapsis pq la sinapsis se queda potenciada. 67 de 70 A frecuencia baja se libera poco Glu q es suficiente para activar receptores AMPA pero no NMDA. Cuando se activan receptores AMPA hay la des-polarización y se activan los receptores NMDA => entra Ca q activa PP2B la cual des-fosforila receptores AMPA. Cuando AMPA están des-fosforilado se unen a proteínas de endocitosis y el receptor se invagina en vesiculas => LTD. Si se utilizan inhibidores de endocitosis, no se produce LTD A frecuencia alta se libera mas Glu q activa receptores AMPA y NMDA y eso lleva a un aumento de Ca mucho mayor, el cual activa CAMKII q fosforila receptores AMPA. Cuando AMPA están fosforilado se localizan en superficie post-sináptica mediante exocitosis y no son endocitados => aumenta n° receptores AMPA en superficie => LTP Si se utilizan inhibidores de exocitosis (complejo SNARE), no se produce LTP !!! NO todas las LTPs y LTDs son dependiente de activación de receptores NMDA, pero sí es el caso de las sinapsis de hipocampo q han sido la mas estudiadas. Por este motivo se asumió q así ocurría en todos los casos. Fases de la LTP: 1. Establecimiento de la LTP — inicialmente se produce una importante entrada de Ca y la exocitosis de receptores AMPA mediada por ≠ proteínas. Se observa q al decepcionar distintas TyrK y la PLC se afecta la LTP en estas sinapsis. 2. Mantenimiento de la LTP — se necesita un cambio en la expresión génica. Interviene una AC independiente de Ca, q sintetiza cAMP y q por tanto activa a CREB1, vía PKA, CAMKIV y MAPK. ALTERACIONES ESTRUCTURALES ASOCIADAS A LA LTP: Se han realizado experimentos con Glu quelado con un compuesto fotosensible, así q al dar pulsos de luz se permite su liberación y se observa la aparición de la LTP. Al analizar las imágenes de las espinas dendriticas bajo el efecto del Glu, se detecta q la cantidad de Ca q entra aumenta con el tiempo y q, al reforzar la sinapsis, la dendrita adquiere forma de champiñón. => Se produce la remodelación estructural de la espina dendritica y, con ello, un aumento de la superficie de la densidad post-sináptica y del n° de receptores expresados. 68 de 70 LTP EN LA VIA DE LAS FIBRAS MUSGOSAS: Las sinapsis establecidas entre las neuronas musgosas y las neuronas piramidales de la región CA3 también tienen plasticidad sináptica => igualmente se pueden potenciar. Sin embargo, el mecanismo es totalmente independiente de los receptores NMDA y de la entrada de Ca en la post-sinapsis. En este caso la LTP es dependiente de los canales de Ca tipo R localizados en la pre-sinapsis, fuera de la zona activa. (La via musgosa es la única con LTP pre-sinaptica, todas las otras vías en hipocampo producen LTP en post-sinapsis pq son dependientes de receptores NMDA) Ademas del Ca q era por los canales de tipo R, también intervienen los canales de tipo P/Q y N, todos ellos de alto umbral. El Ca promueve la activación de una AC dependiente de Ca, q sintetiza cAMP y activa a la PKA. Esta fosforila a RING q permite le transporte de las vesiculas a la membrana y su exocitosis. También se ha visto la activación de EPAK, una proteina GEFs q interviene en una ruta no canónica q resulta en el aumento del n° de sitios de liberación. Los GEFs son proteínas q activan pequeñas proteínas G (como las de la familia Rho, Rac o Ras) promoviendo el intercambio de GDP inactivo, por GTP q es la forma activa de estas proteínas. 2 tipos de mecanismos de LTPs en hipocampo: CA3-CA1 —> dependiente de receptores NMDA. Mecanismo post-sináptico producido por la exocitosis de receptores AMPA. Fibras musgosas.neuronas piramidales de CA3 —> independiente de receptores NMDA. Mecanismo pre-sináptico mediado por canales de Ca tipo R. RECEPTORES NMDA Y APRENDIZAJE ESPACIAL: Los conocimientos sobre las LTPs en hipocampo permitieron realizar estudios de aprendizaje espacial de ratones, para demostrar experimentalmente q estos procesos mediaban el aprendizaje. En ratones se realizan 2 tipos de pruebas, q se basan en la detección de pistas espaciales q les permiten discriminar: Test de la rata nadadora — la rata aprende a nadar, pero lo importante es q consigue encontrar espacialmente las plataformas en las q está a salvo. Test de los multiples brazos — la rata debe encontrar la recompensa en uno de los brazos. Inicialmente, mediante inyección de un agonista de receptores NMDA se observó q las ratas eran incapaces de establecer los esquemas espaciales, de manera q se demostró q las LTPs mediaban el aprendizaje. Con el avance de las técnica, hoy en día se pueden tener modelos animales en los q se suprima la expresión de los receptores NMDA en poblaciones celulares concretas, mediante el sistema Cre/LoxP. Al hacer el KO en las neuronas del giro dentado se observó q el test de la rata matadora era normal => las ratas eran capaces de formar su mapa mental pero sí presentaban dificultades de aprendizaje en el test de los multiples brazos. Mediante experimentos de este tipo con KOs para ≠ proteínas se esta intentando construir un mapa mas exacto de las sinapsis implicadas en las LTPs. 69 de 70 IMPLICACION DE LTP-LTD EN LA MEMORIA: El aumento del n° de receptores AMPA en la superficie producido por una LTP implica un cambio en la relación AMPA/NMDA. e.g. miedo condicionado aprendido — los ratones aprenden a reaccionar de la misma forma cuando solo reciben el sonido q cuando reciben la descarga eléctrica. Antes de ello, se les enseña a apretar la palanca para conseguir el premio. El miedo hace q los ratones se queden paralizados y dejen de apretar la palanca cuando escuchan el sonido y/o reciben la descarga. Esto mismo se ha comprobado q ocurre al expresar ciertas proteínas fotosensibles en determinadas neuronas y estimularlas con un pulso de luz. Con estos paradigmas experimentales, se puede ver q estos procesos plásticos están detrás de ciertos aprendizajes. ALMACENAMIENTO DE LA MEMORIA: Se han establecido eneagramas o “huellas” q se consideran la parte física de la memoria. Mediante experimentos in vivo y con optogenética, se ha determinado q en el proceso de aprendizaje hay una serie de grupos de neuronas q se inter-conectan y establecen conexiones q se refuerzan, sin ser necesario q se encuentren en la misma región cerebral. Se forman los circuitos neuronales o eneagramas, q se activan de nuevo al reforzar lo aprendido. Dependiendo del grado de adquisición, las conexiones serán mas o menos fuertes. Mediante marcaje de genes de aparición temprana se pueden ver las neuronas q se están activando y crear los mapas. Al dejar de estimula la conexión, se produce una atenuación en el marcaje, pero al traer de nuevo el recuerdo se observa q se activan los mismos grupos de neuronas q se estimularon durante la fase de adquisición. Estos eneagramas son los q permiten almacenar lo aprendido. e.g. cuando se introduce el animal en la caja de experimentación, este aprende a recibir los estimulos (si pasamos una corriente, el animal asocia la caja a miedo). Al regresar a la caja de origen, los eneagramas establecidos dejan de estar tan activos. Finalmente, al re-introducir el rotor en el espacio, sin necesidad de someterlo al estimulo, las neuronas se activan de nuevo, pesto q recuerda el espacio. e.g. cuando estudiamos, cada vez q leemos la mismo información, se van a reforzar las sinapsis q se establecieron la primera vez q hemos leído aquella parte de información. Una forma de reforzamiento de las sinapsis es un aumento del n° de sinapsis entre las mismas neuronas 70 de 70 MEMORIA Y SUEÑO: Las primeras evidencia de la importancia del sueño/descancio en el proceso de aprendizaje se observaron con las moscas de vinagre. Estos animales eran constantemente estimulados para evitar q se pararan en una superficie para descansar (=> siempre volando). Se observan al final mucha mas conexiones pero mucho mas pequeñas. El sueño es necesario para filtrar la información q ha recibido el cerebro durante el día, desechando la información irrelevante y quedándose con lo importante. El cerebro es capaz de discernir gracias a q mantiene las conexiones de aquellas sinapsis mas reforzadas y elimina las mas débiles => después de sueño/descanso, disminuye el n° de sinapsis. Durante el sueño se distinguen varias fases: 1. NREM1 — periodo de transición 2. NREM2 — se produce bajada de la temperatura corporal y se generan ondas cerebrales características de las primeras fases del sueño. La actividad cerebral no es muy elevada + AcCh ↓, cortisol ↓ y noradrenalina/serotonina se quedan normal 3. NREM3 — se relaja la musculatura, disminuye la presión sanguínea, la respiración se vuelve mas pausada… Al final de esta fase se produce un sueño mas profundo y se detectan unas ondas lentas. Llegar a esta fase es esencial para el filtrado de la información, puesto q es entonces cuando el hipocampo procesa la información y la manda a la corteza. En la corteza se filtra y selecciona aquella q el cerebro va a retener, mediante eliminación de sinapsis débiles. La memoria consolidada se almacena en la corteza. 4. REM — es la fase en la q se producen los sueños. Hay una gran actividad cerebral, aumenta la frecuencia cardiaca, la respiración, el movimientos de los ojos… El cerebro mezcla ≠ informaciones y muchas veces recuerdos, pudiendo generar incluso memoria artificial. En el hipocampo se producen unas ondas características q se pueden registrar, ↑ AcCh, ↑cortisol y ↓noradrenalina/serotonina. Se ha visto q la deprivación del sueño dificulta notablemente el aprendizaje, ya q el descanso permite eliminar muchas sinapsis no reforzadas lo cual es esencial para disminuir la actividad sináptica. El hipocampo es el primer sitio en el q se almacenen las información q hemos aprendido. Durante la fase NREM2 el hipocampo pasa la info a la corteza donde hay la selección de sinapsis.

Tema 8: Estructura de la Unión Neuromuscular (PDF)

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