Méthodes d'étude de la cellule - Biologie cellulaire - PDF

Biologie cellulaire Module : Biologie cellulaire, moléculaire et génétique Deux éléments : 1/ Biologie cellulaire 2/ Biologie moléculaire et génétique La biologie cellulaire est une science qui étudie les cellules, de leur structure à leur fonctionnement biochimique....

Biologie cellulaire Module : Biologie cellulaire, moléculaire et génétique Deux éléments : 1/ Biologie cellulaire 2/ Biologie moléculaire et génétique La biologie cellulaire est une science qui étudie les cellules, de leur structure à leur fonctionnement biochimique. 1  Biologie cellulaire Principales méthodes d’étude de la cellule qui sont le point de départ du progrès des connaissances dans le domaine. Membrane plasmique : Structure, Composition biochimique (Les lipides, Les protéines, Les glucides), Modèle de la mosaïque fluide, Mécanismes des rôles physiologiques de la MP (Echanges membranaires, Signalisation cellulaire, Interactions cellulaires) Noyau : Noyau interphasique, Cycle cellulaire, Chromosomes, Mitose, Méiose Constituants du cytoplasme et leurs rôles : Inclusions inertes, Organites cellulaires, Système endomembranaire (Réticulum endoplasmique, Appareil de Golgi, Lysosomes, Endosomes ) Peroxysome, Mitochondrie Cytosquelette : Rôles du cytosquelette : Microtubules, Microfilaments, Filaments intermédiaires 2  METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE Enseignant Intervenant : Pr Rhrich-Haddout Module : Biologie cellulaire, moléculaire et génétique Elément du module : Biologie cellulaire Chapitre : Méthodes d’étude de la cellule Semestre : S1 www.um6ss.ma Plan du cours : I.METHODES D’ETUDE DE LA STRUCTURE 1. Observation au microscope optique ou photonique 2. Observation au microscope électronique II. METHODES D’ETUDE DE LA CONSTITUTION CHIMIQUE 1. Cytochimie 2. Fractionnement cellulaire 3. Electrophorèse 4. Chromatographie III. METHODES D’ETUDE DU FONCTIONNEMENT 1. Culture de cellules 2. Autoradiographie 4  Objectifs pédagogiques: Cet enseignement doit permettre aux étudiants de connaitre : Connaitre les méthodes d’étude de la structure de la cellule :  connaitre la méthode de préparation des échantillons pour les observer au microscope optique  Connaitre les différents types de microscopes optiques et leur application  connaitre la méthode de préparation des échantillons pour les observer au microscope électronique (MET) (MEB) Connaitre les méthodes d’étude de la constitution chimique de la cellule (cytochimie). Connaitre les méthodes d’étude du fonctionnement de la cellule. Connaitre le but et le principe de chaque méthode. 5 I/ Méthodes d’étude de la structure de la cellule 1. Introduction 2. Observation au microscope optique ou photonique 2.1. Principe de fonctionnement 2.2. Différents types de prélèvements 2.2.1. Prélèvements tissulaires 2.2.2. Prélèvements cytologiques 2.3. Coupe en congélation 2.4. Différents microscopes optiques 3. Observation au microscope électronique 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) 3.2. Microscope électronique à balayage (MEB) 6  Méthodes d’étude de la structure de la cellule 1- Introduction : L’observation des cellules est délicate du fait de leurs très petites tailles, L’observation des cellules nécessite un certain nombre d’appareillages dont les microscopes. On distingue deux grands types de microscopes suivant leur résolution :  les microscopes optiques (MP) (MO)  les microscopes électroniques (ME) : MET et MEB  L’examen au µscope impose cependant certaines contraintes, il faut que :  les objets soient minces ,  leurs constituants présentent un certain contraste. 7 Préparations histologiques 8  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2- Observation au microscope optique MO (ou photonique MP) 2.1. Principe de fonctionnement :  Utilise des photons comme source d’énergie  microscope photonique (Le nom photon vient du grec et signifie « lumière » )  Fournit une image agrandie grâce à des combinaisons de lentilles optiques : 1/ l’oculaire côté œil (2 à 10X) 2/ l’objectif côté objet (2,5 à 100X) La multiplication du grossissement de l’objectif par celui de l’oculaire permet d’obtenir le grossissement du microscope. Par exemple oculaire de 10 X, objectif de 40 = grossissement de 400. 9 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 10 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2- Observation au microscope optique ou photonique 2.2. Différents types de prélèvements : Prélèvements (exemples): - Tissulaires :  biopsie (fragment de tissus/être vivant)  biopsie-exérèse : prélèvement de la TOTALITE de la lésion  ponction-biopsie : prélèvement d’une «carotte» tissulaire (aiguille/trocart) - Cytologiques :  par grattage, brossage, ponction à l’aiguille, recueil de liquide de lavage,  recueil de produits de sécrétion/écoulement,  apposition sur une lame de microscope d’un prélèvement frais 11  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2- Observation au microscope optique ou photonique 2.2. Différents types de prélèvements : 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Etapes de préparation des prélèvements tissulaires pour coupe au microtome à paraffine : Prélèvement Fixation Décalcification (tissus durs : acide nitrique, EDTA = acide éthylène diamine tétra-acétique) Déshydratation du prélèvement Eclaircissement du prélèvement Imprégnation du prélèvement Inclusion du prélèvement Coupes Collage des coupes sur les lames histologiques (en verre) Déparaffinage des coupes Réhydratation des coupes Coloration des coupes Déshydratation des coupes Montage des coupes (entre lame et lamelle : Eukitt, Baume de canada) Observation au MO 12  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Fixation :  Préserve la structure de la ¢ morte  Fixateurs : tuent la ¢ en gardant en place ses constituants  Créent des liaisons chimiques très stables entre les molécules de la ¢.  Ex. Formaldéhyde, formol, Bouin… Décalcification : pour les tissus durs  Tissus imprégnés de sels de calcium (os, dents)  ont une rigidité qui les rend impropres à la coupe au microtome.  Décalcification = procédé utilisé pour enlever de ces tissus les sels de calcium.  Utilisation : acide nitrique, EDTA = acide éthylène diamine tétra-acétique) 13  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Déshydratation du prélèvement :  Préparer les tissus à l’inclusion car la paraffine n’est pas miscible à l’eau  Bains d’alcool de plus en plus concentrés (70°, 95°, 100°) 14  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Eclaircissement du prélèvement :  Eclaircissement : passage dans un solvant organique (toluène ou xylène) Imprégnation du prélèvement :  Imprégnation : par la paraffine pure liquide à l’étuve (56 – 60°C) = passage dans 3 bains 15  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Inclusion du prélèvement :  Rigidifie le tissu pour faciliter sa coupe et éviter la déformation des cellules lors de la coupe  Paraffine ou paraplast 56 – 60°C  Barres en « L », moules en plastique, moules en métal 16  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Coupes : MICROTOMIE  microtome (2-7µm) 17  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Collage des coupes sur les lames :   S’effectue sur une platine chauffante  Lames sans prétraitement : eau gélatineuse ou eau albumineuse  Lames prétraitées avec le silane : collage avec l’eau 18 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Déparaffinage des coupes :  A l’aide d’un solvant de la paraffine : toluène, xylène.. Réhydratation des coupes :  Etape indispensable, préalable à la coloration car la plupart des colorants sont hydrophiles  Bains d’alcool à titre décroissant  remplacement progressif de la paraffine par l’eau 100°, 95°, 70° 19  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Coloration des coupes :  Moyen dont on dispose pour distinguer les diverses structures du tissu.  Faire ressortir les différences dans la composition chimique des structures tissulaires  chaque composant tissulaire a un comportement particulier face aux colorants.  Augmente le contraste entre les structures cellulaires. 20  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : - Déshydratation des coupes :  Bains d’alcool de plus en plus concentrés (70°, 95°, 100°) - Montage des coupes (entre lame et lamelle : Eukitt, Baume de canada) - Observation au MO 21  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Un colorant  = réactif capable de teindre une substance ou un ensemble de substances de manière durable.  doit présenter 2 propriétés :  Posséder des groupements qui lui confèrent une couleur: chromophores,  Posséder des groupements qui assurent sa fixation permanente sur la structure à teindre : auxochromes. La charge des auxochromes permet de distinguer :  Les colorants acides (colorants cytoplasmiques )  les colorants basiques (colorants nucléaires) 22 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Deux grandes catégories de colorations : 1/ Colorations topographiques (de base)  Mettre en évidence : noyau, cytoplasme  Donner une idée sur la topographie générale du tissu  Exemple : Hématoxyline-éosine (H&E) (H&E+ safran → noyau, cytoplasme fibres de collagène) Hématoxyline : L'hématéine est un colorant basique -Violet à noir selon l’épaisseur de la coupe et la concentration du colorant - coloration des substances acides des noyaux cellulaires Éosine : L'éosine est un colorant acide - Rouge à rose pâle selon l’épaisseur de la coupe et la concentration du colorant - coloration des composants basiques du cytoplasme 23 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : 24 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : 25 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : 26 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : 27 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : 28  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : 2/ colorations spéciales : Fibres conjonctives : Méthode de Van Gieson (collagène en rouge) Trichrome de Masson (fibres de collagène en bleu, vert) Méthode de Gomori (fibres de réticuline en noir) Substances glucidiques : - PAS (rose à rouge poupre, rouge-violet) - Rouge congo ( rose à orange) - Bleu Alcian (substances polysaccaridiques sécrétées par certaines cellules épithéliales) Substances lipidiques : Méthode à l’huile rouge O (rouge) Noir soudan (noir) Protéines: Méthode de gram-weigert (bleu-noir) 29 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : Trichrome de Masson (fibres de collagène) 30 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : PAS Bleu Alcian (mucus sécrété par les ¢ caliciformes, flèche) 31 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.1. Prélèvements tissulaires : H&E Noir soudan : substances lipidiques 32  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.2. Prélèvements cytologiques :  Exemple 1: le frottis sanguin : coloration spéciale des cellules sanguines  May-Grünwald-Giemsa (MGG) Principe : Le frottis sanguin consiste en la réalisation d'un étalement monocellulaire des éléments sanguins. Matériel : - 2 lames, - une aiguille stérilisée. Mode opératoire : -À l’aide d’une aiguille stérilisée, piquez le bout d’un doigt. Placez une goutte de sang (3 mm de ) à l'extrémité d'une lame (lame porte-objet) - Avec la deuxième lame tenue à 45 degrés par rapport à la première, toucher la goutte de sang puis l'étaler d'un mouvement bref sur la première lame pour obtenir un étalement fin. - Sécher aussitôt en agitant la lame. 33 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.2. Prélèvements cytologiques :  Exemple 1: le frottis sanguin : 34  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.2. Prélèvements cytologiques :  Exemple 1: le frottis sanguin : Coloration au May-Grünwald-Giemsa (MGG)  Placer la lame du frottis sur un support horizontal  Verser sur la lame 15 gouttes de colorant May-Grünwald de façon à recouvrir complètement le frottis. Laisser agir 3 min.  Rejeter le colorant par un jet d’eau neutre.  Colorer avec la solution Giemsa pendant 10 min  Rincer sous un jet d’eau neutre.  Laisser sécher la lame à l’air, en position inclinée, après avoir essuyé la face inférieure de la lame avec du papier filtre.  Attendre au moins 5 min avant l’examen microscopique du frottis. 35 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.2. Prélèvements cytologiques : 36  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.2. Prélèvements cytologiques : Exemple 2 : le frottis buccal (cytologie exfoliatrice) (La cytologie exfoliatrice étudie les cellules qui se détachent naturellement d’un épithélium : frottis vaginaux, frottis buccaux, cellules de la muqueuse bronchique dans les crachats, etc...) Avantages - méthode non agressive, - facile à réaliser dans la bouche, - donne des résultats rapides, - utilisée pour le diagnostic de différentes affections buccales, en particulier afin d’identifier certaines affections spécifiques de la muqueuse buccale. Inconvénients Ne permet pas souvent l’établissement d’un diagnostic définitif. 37 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.2. Prélèvements cytologiques : Exemple 2 : le frottis buccal (cytologie exfoliatrice) Matériel - une lame histologique propre, stérile - une solution fixatrice : alcool/éther ou éthylène/glycol - un abaisse-langue Mode opératoire -Passer une compresse humide au niveau du site lésé (élimination des mucosités) - Gratter plusieurs fois la surface de la lésion au moyen d’un abaisse-langue ou d’une spatule en métal (ou autre) -Etaler le produit de raclage sur lame - Fixer immédiatement 38 - coloration (H&E, Papanocolaou, bleu de méthylène) Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.2.2. Prélèvements cytologiques : Exemple 2 : le frottis buccal (cytologie exfoliatrice) Cellules d'épithelium buccal ; coloration bleu de méthylène 39 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.3. Coupe en congélation (cryotomie) :  Principe de la congélation : = c’est le durcissement du tissu grâce à la congélation de l’eau qu’il contient. 40  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.3. Coupe en congélation (cryotomie) :  Il est indiqué de procéder à la cryotomie dans les situations suivantes :  Le chirurgien a besoin, en cours d’opération, d’avoir la confirmation du diagnostic : la rapidité de la méthode est alors mise à profit (examens extemporanés (gain de temps));  Certaines des étapes préparatoires à l’inclusion à la paraffine sont susceptibles de nuire à la préservation des substances qu’il faut mettre en évidence. Exemple: Techniques d’histoenzymologie (enzymes) ;  certaines techniques immunohistochimique ;  lipides 41  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.3. Coupe en congélation (cryotomie) :  La pièce à couper est introduite dans l’isopentane (= cryoprotecteur) préalablement refroidi (-160°C) dans l’azote liquide.  Remarque : l’azote liquide a une température de l’ordre de (-196°C) 42  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.3. Coupe en congélation (cryotomie) :  Les coupes sont réalisées à l’aide CRYOSTAT= enceinte réfrigérée entre (– 18°C et – 20°C) contenant le microtome. 43  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.4. Les différents microscopes optiques :  Microscope à fond clair : Il s’agit d’un microscope normal (microscope droit) utilisé en transmission. Applications :  Histologie  Hématologie  Parasitologie Bactériologie 44  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.4. Les différents microscopes optiques :  Microscope à Contraste de phase : Applications : - Permet l’observation des préparations « ayant un relief », non fixées, non colorées : étalement de cellules, cultures de ¢, ¢ vivantes. une cellule d’embryon de souris visualisée en contraste de phase. Les contours sont entourés d’une ligne blanche. 45  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.4. Les différents microscopes optiques :  Microscope à Contraste de phase : Observation au microscope photonique à contraste de phase : coupe obtenue par ponçage (coupe par usure), pas de coloration E: émail D : dentine P : pulpe O : fragments osseux C : cément 46  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.4. Les différents microscopes optiques :  Microscope à fluorescence :  Permet de visualiser des molécules fluorescentes endogènes ou (surtout) exogènes  La source lumineuse est déportée sur le côté et est constituée par une lampe offrant un spectre de longueur d’onde étendu vers les UV. Un filtre d’excitation permet de sélectionner une bande de longueur d’onde adaptée au fluorochrome à visualiser 47  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.4. Les différents microscopes optiques :  Microscope confocale L'intérêt de la microscopie confocale :  par rapport à la microscopie conventionnelle, est d'améliorer la résolution des images et de faire du découpage optique, c'est-à-dire qu’on va observer l’image « tranche par tranche » ou plutôt plan par plan.  On peut ensuite rassembler les plans successifs et reconstituer une image en 3D. 48  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.4. Les différents microscopes optiques :  Microscope à fond noir : Applications :  Bactériologie 49  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MO 2.4. Les différents microscopes optiques :  Microscope à lumière polarisée : (très peu utilisé en biologie) Permet d’observer - des tranches fines de roches, - dents et os non décalcifiés  Microscope à réflexion : on l’utilise dans le cas d’échantillon opaque où l’on observe la lumière qui est réfléchie à la surface. (microstructure des matériaux après polissage de l’échantillon et attaque chimique) 50  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : ME Observation au microscope électronique Deux types principaux : - À transmission - À balayage  Principe : concentrer un faisceau d’électrons sur le spécimen biologique. 51  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  utilise des électrons qui se déplacent dans un tube où règne un vide très poussé.  le flux d’électrons est fourni par une cathode = filament de tungstène chauffé par un courant électrique.  les électrons sont ensuite accélérés par une anode qui permet d’établir une différence de potentiel de 50 000 à 100 000 volt pour µscope normal, de 2 à 3 millions de volts pour µscope à haut voltage. 52  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  les électrons sont + ou – diffractés par les structures cellulaires,  Les électrons non diffractés sont dirigés sur un écran par des lentilles objectifs et une lentille projecteur  zone claire  Les électrons diffractés (qui changent de direction) n’atteignent pas l’écran  zone sombre sur l’écran  pouvoir séparateur : voisin du nanomètre  agrandissement varie entre X1500 et X600 000  Observation des ultrastructures cellulaires.. 53  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : En raison du faible pouvoir séparateur des électrons, les coupes doivent être très fines de 40 à 60 nm d’épaisseur.  Cela impose des contraintes de préparation beaucoup plus importantes que celles du microscope optique, entre autre, une fixation plus exigeante et une inclusion en milieu plus dur :  Fixation : glutaraldéhyde  Post-fixation : acide osmique  Inclusion : araldite (Epon) = résines polymérisables (à 37°C pendant 24h puis 48h à 56°C) La polymérisation désigne une réaction chimique, fonction du temps et de la température, conduisant la matrice ou la résine à se solidifier de manière irréversible (valable uniquement pour les thermodurcissables). 54  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  Les coupes ultrafines sont réalisées à l’aide d’un ultramicrotome et sont recueillies sur des grilles. 55 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : 56 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : 57 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : Les coupes sont récupérées sur des grilles en métal. On dispose de deux types de grille : 1/ sous forme de grillage 2/ présentant un trou au milieu = mono-trou 58  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : Pour les mono-trous, avant le dépôt des coupes sur ces dernières, il est nécessaire de préparer la grille de manière à obturer les trous par une matière laissant passer les électrons. Pour cela, on utilise une solution de collodion : 59  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  Pour augmenter le contraste des constituants cellulaires, on utilise des sels de métaux lourds (acétate d’uranyle et citrate de plomb) : 60 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : 61 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : 62  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : Coloration négative C’est un excellent moyen pour étudier les structures très fines (molécules, virus). Exemples de molécules : ribosome, myosine, tubules… Cette technique permet de contraster non pas la structure cellulaire mais l’espace qui l’entoure. 63  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : Coloration négative : Technique : 1/ Isolement des substances à étudier, 2/ les mettre en solution avec l’acide phosphotüngstique qu’elles n’absorbent pas., 3/ on dépose cette solution sur la grille à membrane de collodion (monotrou), 4/ on laisse sécher la grille. Après séchage, acide phosphotüngstique délimite de 1 : ADN manière précise les structures à étudier. Partout où il 2 : Nucléosome = un se trouve, les électrons ne peuvent traverser. En complexe de protéines (rôle: compaction de l'ADN double revanches les électrons traversent les structures que brin) l’on veut observer. On obtient donc des images en 64 négatif.  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  Coloration négative Adénovirus virus Acide phosphotüngstique 65  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  Coloration négative Coloration négative MET : Actine 66 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : 67 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  Technique de cryofracture (répliques) En raison de la faible épaisseur des coupes, le MET ne permet pas l’étude directe de la surface des cellules. On peut cependant avoir une certaine idée des reliefs de la surface d’un organite ou même de la constitution interne d’une mb biologique en confectionnant des répliques (technique de cryofracture). 68 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  Technique de cryofracture (répliques) Cette technique permet : - d'obtenir une empreinte, appelée réplique, de la surface fracturée sous vide d'un échantillon cryofixé. - une visualisation tridimensionnelle d'organites intracellulaires 69  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) : Technique de cryofracture (répliques) 1 : tissu placé sur un support 2 : congélation 3 : le tissu est placé dans une cloche sous vide 4 : le tissu congelé est fracturé (sous vide) 5 : surface du tissu 6 : ombrage de la surface libérée (45°: platine et carbone; 90° : platine ou carbone 7 : réplique de la surface isolée par digestion enzymatique du tissu 8 : photographie de la réplique montrant l’enveloppe du noyau et ses pores 70 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  Technique de cryofracture (répliques) Préparation par cryodécapage, MET Sur cette préparation, le plan de clivage a intéressé une partie de l’enveloppe nucléaire et les pores nucléaires PN sont alors bien visible. On observe également le contour de la membrane plasmique MP et des mitochondries. 71  Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MET 3.1. Microscope électronique à transmission (MET) :  Technique de cryofracture (répliques) Préparation par cryodécapage, MET Cellule de racine d’oignon La partie supérieure de la figure correspond au noyau (N) et montre les complexes des pores nucléaires (np) et l’enveloppe nucléaire (ne). Dans le cytoplasme on peut observer l’appareil de Golgi (G) et une grosse vacuole (V), (pc), paroi cellulaire 72 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MEB 3.2. Microscope électronique à balayage (MEB) : Le microscope Electronique à Balayage (MEB en français ou SEM en anglais pour Scanning Electron Microscope) :  Permet l’observation de la surface de l’échantillon,  Les électrons émis par la cathode vont balayer la surface de l’échantillon  La surface de l’objet à balayer est préalablement recouverte d’une couche métallique  Vue en 3D du spécimen 73 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MEB 3.2. Microscope électronique à balayage (MEB) : Préparation des échantillons biologiques (MEB) : 1/ Fixation 2/ Déshydratation 3/ Coupe (tranches épaisses) 4/ Collage sur un support métalliques ( = plot) 5/ Métallisation des échantillons : Pour rendre conducteurs les échantillons, il est nécessaire de les recouvrir d'une couche fine de métal (or). 74 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MEB 3.2. Microscope électronique à balayage (MEB) : 75 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MEB 3.2. Microscope électronique à balayage (MEB) : Globules rouge (érythrocytes, hématies) en forme biconcave 76 Méthodes d’étude de la structure de la cellule : MEB 3.2. Microscope électronique à balayage (MEB) : MEB: Tissu musculaire (strié squelettique) 77 II/ Méthodes d’étude de la constitution chimique 1/ Identification de tes substances :  CYTOCHIMIE 2/ Séparation des constituants cellulaires :  FRACTIONNEMENT CELLULAIRE, ELECTROPHORESE,  CHROMATOGRAPHIE 78 Méthodes d’étude de la constitution chimique Les techniques cytochimiques permettent de mettre en évidence, in situ (= dans son milieu naturel), les constituants chimiques (= molécules) de la ¢ : 1/ Colorations cytochimiques 2/ Digestion enzymatique 3/ Immunochimie 79 Méthodes d’étude de la constitution chimique 1- Cytochimie : 1/ Colorations cytochimiques Utilisation de réactions chimiques qui vont permettre la mise en évidence de molécules particulières dans la cellule. Exemples : Colorations spéciales : Mise en évidence de l’ADN par la Exemple : Mise en évidence de réaction de FEULGEN substances polysaccharides 80 Méthodes d’étude de la constitution chimique 1- Cytochimie : 2/ Digestion enzymatique 81 Méthodes d’étude de la constitution chimique 2- Cytochimie : 3/ Immunochimie But : révéler une molécule biologique présente sur une ¢ ou un tissu avec des anticorps spécifiques. Immunohistochimie : l'échantillon est une coupe de tissu Immunocytochimie : l'échantillon est une préparation cytologique Principe :  Détection de protéines ou autres molécules (antigène).  Sondes utilisées : anticorps dirigés contre la protéine recherchée  Deux méthodes : directe et indirecte 82 Méthodes d’étude de la constitution chimique 1- Cytochimie : 3/ Immunochimie 83  Méthodes d’étude de la constitution chimique 1- Cytochimie : 3/ Immunochimie 2/ Méthode indirecte : Deux façons 1/ Première façon :  Anticorps primaire  reconnaissance de la molécule  Anticorps secondaire dirigé contre l’anticorps primaire est couplé à : Une molécule fluorescente, Une enzyme détectée après incubation avec un substrat incolore qui se colore après réaction, Une particule opaque aux électrons (pour MET) ex: or colloïdal Une molécule radioactive détectée par autoradiographie, 2/ Deuxième façon (amplification) : Anticorps primaire  Anticorps secondaire dirigé contre l’anticorps primaire et en plus il est biotinylé  Complexe 84 Méthodes d’étude de la constitution chimique 1- Cytochimie : 3/ Immunochimie Méthode indirecte sans amplification 85 Méthodes d’étude de la constitution chimique 1- Cytochimie : 3/ Immunochimie Méthode indirecte avec amplification Remarque : - A la place de l’Avidine on peut utiliser la streptAvidine - A la place de HRP on peut utiliser PAL (phosphatase alcaline) 86  Méthodes d’étude de la constitution chimique 1- Cytochimie : 3/ Immunochimie : MO kératine marquée au Immunofluorescence : Anticorps monoclonal anti- niveau de l’épithélium Cytosquelette d'Actine et de TLR3 détecte la présence (MO) Smooth Muscle Actin de de TLR3 dans les cellules Anticorps secondaire fibroblastes de souris tumorale de cancer du sein couplé à la peroxydase « nouveau né » en culture 87 Méthodes d’étude de la constitution chimique 1- Cytochimie : 3/ Immunochimie : MET Emploi de particules opaques aux électrons (pour MET) ex: or colloïdal) 88 Méthodes d’étude de la constitution chimique 2/ Séparation des constituants cellulaires :  FRACTIONNEMENT CELLULAIRE : obtenir des fractions pures d’organites ou de macromolécules. Deux étapes 1/ Préparation de l’homogénat cellulaire 2/ La séparation des organites (centrifugation)  ELECTROPHORESE : séparation de molécules biologiques (protéines, acides nucléiques…) en fonction de leur poids moléculaire ou de leur charge électrique nette.  CHROMATOGRAPHIE : plusieurs types exemple Chromatographie sur couche mince  Séparation des molécules biologiques, par exemple des protéines, en fonction de leur solubilité ds des solvants organiques. 89 III/ Méthodes d’étude du fonctionnement Pour étudier le fonctionnement, les techniques peuvent être réalisées soit : -in vitro, sur des ¢ ou des fragments de tissus maintenus vivants en culture.  cultures cellulaires - in vivo, sur l’animal vivant.  autoradiographie 90 Méthodes d’étude du fonctionnement  cultures cellulaires - enceintes stériles - cultures en suspension effectuées sous agitation lente -cultures en tapis dans des flacons ou boîtes en plastique permettant l’adhésion cellulaire (Agar ou gélose, collagène par exemple) - milieux de culture : * solutions salines, tamponnées * aa, glucose, vitamines * sérum (facteurs de croissance) * pH neutre * T° physiologique (37°)  Etuve 91 Méthodes d’étude du fonctionnement  cultures cellulaires 92 Méthodes d’étude du fonctionnement  cultures cellulaires Culture de fibroblastes 93  Méthodes d’étude du fonctionnement  Autoradiographie But :  Etude d’un processus métabolique grâce à l’utilisation de traceurs radioactifs.  Par exemple : déterminer le site de synthèse d’une macromolécule et sa migration éventuelle ds  compartiments ¢res (on peut alors parler d’histoautoradiographie)  mise en évidence des macromolécules marquées par autoradiographie. 94 Méthodes d’étude du fonctionnement  Autoradiographie Principe :  Détection d’une source radioactive sur des coupes de tissus,  Dépôt d’un fin film photographique (constitué de sels d’AgBr) sur la coupe,  La radioactivité produit un dépôt de grains d’argent superposé à la source radioactive,  Le tritium (3H), le soufre 35 (35S) et le phosphore 32 (32P) sont les isotopes les plus couramment utilisés, 95  A retenir : Comparer la préparation d’un échantillon inclus dans la paraffine pour l’observer au MO et la préparation d’un échantillon pour l’observer au MET. MO MET - - - - - - - - - - 96 Bibliographie: - Histologie fonctionnelle - 2e édition Broché – 2000 Whater - Histologie. LES TISSUS – 3e édition Broché – 2006 Poitié, Catala, André 97