Generalidades de Bacteriología PDF

Generalidades de bacteriología Bacterias: microorganismos procariontes Son organismos unicelulares, que se reproducen por fisión binaria. Contienen toda la maquinaria biosintética para el crecimiento y reproducción. Hay excepciones, como la chlamydia, que necesita parasitar otra célul...

Generalidades de bacteriología Bacterias: microorganismos procariontes Son organismos unicelulares, que se reproducen por fisión binaria. Contienen toda la maquinaria biosintética para el crecimiento y reproducción. Hay excepciones, como la chlamydia, que necesita parasitar otra célula Miden de 0,5 a 5 uM de longitud Tienen 3 formas básicas: cocos, bacilos y espirilos Se las denomina en base al género y la especie Se las divide en gram positivas y gram negativas en base a la coloración de Gram COLORACIÓN DE GRAM Es el color que toma la pared celular. Se colocan bacterias sobre un portaobjetos, fijadas por calor o secadas de algún modo y se tiñen con el colorante violeta de genciana o cristal violeta por 30 segundos. Luego, se lava con agua, el colorante ingresa a la bacteria y se tiñe. A continuación se va a añadir una solución yodada por 1 minuto, y se enjuaga. Después se realiza una decoloración con alcohol por 10 a 30 segundos, y se vuelve a enjuagar -> es para o decolorar las bacterias que poseen una capa delgada. El lit último paso consiste en un agregado de un segundo colorante que va a actuar como contraste, que va a ser la fosfina o safranina por 30 segundos y se enjuaga. Cuando se ue seca, se verá que las bacterias con paredes gruesas no van a perder el primer colorante luego de la decoloración, por lo que se van a visualizar de púrpura -> bacterias GRAM ig POSITIVAS; en cambio, las bacterias con pared fina van a perder ese primer colorante luego de la decoloración, y al colocar el segundo colorante va a ingresar dentro de la célula m y es lo que se visualiza de color rojo -> bacterias GRAM NEGATIVAS Hay bacterias exceptuadas de esta coloración: ➔ las micobacterias, porque su estructura de pared es diferente ➔ treponemas El ➔ micoplasmas ESTRUCTURA BACTERIANA Depende del grado de adherencia entre células hijas y el plano de división Cocos ➔ En racimos ➔ En cadenas ➔ Diplococos ➔ Tétradas ➔ En cubos @elmiguelito.apuntes 2 Bacilos ➔ Gram negativos ➔ Gram positivos ➔ Cocobacilos ➔ En cadena Espirilos ➔ Vibrios -> forma de bacilos o coma curvos con flagelo ➔ Espiroquetas -> células alargadas enrolladas helicoidalmente o CÉLULA BACTERIANA lit ue Desde el el exterior algunas presentan i) flagelo, lo que permite su movilidad, ii) fimbrias o pilis, para la adherencia, iii) cápsula, sólo algunas, iv) dentro de la cápsula está la pared celular, v) membrana ig celular, no presentan esteroles, y va a tener en áreas mesosomas -> invaginación de la m membrana hacia el citosol, es una zona donde se produce la replicación del material genético, vi) componentes del citosol: - ADN cromosómico -> una sola molécula El circular de doble cadena, que no está contenida en ninguna estructura como un núcleo, sino en una zona definida del citosol llamada nucleoide -> región fibrosa del citoplasma. Va a haber proteínas parecidas a las histonas, y una región granular donde contiene a los ribosomas bacterianos (proteínas + ARNr -> ribonucleoproteínas) La ausencia de la membrana nuclear permite el acoplamiento en los procesos de transcripción y traducción, por lo que los ribosomas se fijan al ARNm y sintetizan proteínas a medida que se están sintetizando el ARNm que todavía está unido al ADN. - ARN mensajero - Ribosomas - Metabolitos - Plásmido -> es un ADN doble cadena extra cromosómico y singularizado. Se lo encuentra generalmente en las bacterias gram-negativas. La presencia de plásmidos es una ventaja selectiva, porque entre otras cosas tienen genes para la resistencia a los antibióticos. @elmiguelito.apuntes 3  PARED CELULAR Membrana plasmática -> Espacio periplásmico (está en las bacterias gram-negativas, es virtual en las gram-positivas) -> Pared celular -> Pared externa en las gram negativas -> Cápsula (en algunos casos) La membrana plasmática contiene muchas proteínas, como de transporte, que permite captar metabolitos y liberarlos. Además es el sitio donde se va a sintetizar el ADN, que contiene al sistema de transporte de electrones (ya que es la o encargada de la producción de energía de las bacterias), va a tener receptores para quimiotaxis hacia los nutrientes presentes en el medio. lit La pared celular i) protege de la diferencia de presión osmótica entre la bacteria y el medio externo, ii) le va a dar rigidez, que le permite conformar o mantener su forma, iii) va a tener ue características distintivas, que mediante la coloración de gram nos permite reconocerlas. Gram POSITIVA Gram NEGATIVA - Es más gruesa, tiene varias capas - Es más delgada ig - Componentes fundamentales: - La cantidad de peptidoglicano es mucho menor ➔ peptidoglicano -> compuesta por mureína, - Entre la membrana plasmática y la pared está el genera una red espacio periplásmico -> hay un gel por arriba y m ➔ ácidos teicoicos (50% de la pared), los debajo de la pared, y está formado por agua, lipoteicoicos permiten el anclaje de la pared peptidoglicano, proteínas en solución por ejemplo celular a la membrana plasmática -> enzima que inactivan antibióticos mayores determinantes antigénicos - Tienen una membrana externa, compuesta por El ➔ cierta cantidad de hidratos de carbono una bicapa lipídica asimétrica: ➔ hacia el lado externo se encuentra el lipopolisacárido (LPS) -> endotoxina formada por tres secciones: lípido A, región central o core, y antígeno O. El lípido A es esencial para la viabilidad de la bacteria y es el responsable de la vida endotóxica de la LPS. La región central es un polisacárido ramificado con diferente composición de azúcares, y va a tener la mayor parte de esta región un anclaje de LPS y le da viabilidad a la bacteria. El antígeno O está unido a la región central; es polisacárido lineal, y se utiliza para diferenciar los diferentes serotipos bacterianos. Es muy importante en cuanto a la potencia que tiene para estimular la respuesta inmune. @elmiguelito.apuntes 4 Espacio periplásmico: sus funciones son i) amortiguar cambios de presión osmótica, ii) enzimas para el metabolismo como en los mesosomas FLAGELOS Y PILIS Los flagelos están formados por una polimerización de proteínas de flagelina, que además de movilidad, le permite ser reconocida por varios receptores del sistema inmune. Los pilis están compuestos por la pilina. Son sexuales, permiten el intercambio de material genético -> hacia el extremo, hay una adhesina que va a contactar con un receptor que estará en la otra célula para el intercambio. Las fimbrias son como los pilis, pero no sexuales. Sino que son más cortas, y permiten la adherencia a las bacterias -> hacia el extremo, hay una proteína, la leptina, la cual le permite interaccionar para el proceso de adherencia bacteriana. CÁPSULA Son hidrofílicas. Por lo general están compuestas por azúcares. Y darán una resistencia muy importante a las bacterias que la posean. Es un factor de virulencia. ESPOROS o Son estructuras que producen algunas bacterias cuando las condiciones de nutrición son desfavorables; pero no lo producen todas las bacterias, sólo gram positivas como Clostridium lit sp y Bacillus sp a través de un proceso de esporulación. La resistencia que se da por la generación de esta espora va a estar dada a que en el interior habrá poca cantidad de agua, y habrá dipicolinato de calcio. Resiste al calor. ue Ciclo de esporulación: ig m El @elmiguelito.apuntes 5 Comienza con la invaginación de la membrana celular, que incluye al nucleoide -> cuando esto sucede, se empiezan a generar varias capas y se va a ir perdiendo agua, y de esa manera se genera la espora. Hay pasos fundamentales: - replicación del cromosoma e invaginación de la membrana plasmática -> adn de la futura espora rodeado por la membrana - se va a ir perdiendo agua, y habrá depósitos de dipicolinato de calcio; se formarán capas que a su vez se van a ir depositando más capas, lo que generará que la bacteria termine muriendo y se libere la espora. La espora contiene en su interior parte de material genético (copia completa del cromosoma bacteriano) rodeado de varias capas de dipicolinato de calcio y muy poca cantidad de agua, que es lo que permite la resistencia bacteriana, también contiene concentraciones mínimas de ribosomas y proteínas esenciales. Esto es para que, si el medio es favorable nuevamente, la espora pueda ir rompiendo esas capas y pueda quedar útil su maquinaria para la producción de material genético y proteínas. FISIOLOGÍA BACTERIANA Toda bacteria va a ir creciendo, y para esto necesita fuente de energía y materia prima para o formar proteínas, estructuras y membranas que le van a dar la composición estructural y bioquímica. Lo mínimo que necesita para crecer es una fuente de carbono y de nitrógeno, lit una fuente de energía, agua y iones. Este crecimiento involucra al metabolismo, que hacen reacciones de abastecimiento, de biosíntesis, polimerización y ensamblado, la regulación de ue este metabolismo y también la división celular a través de la fisión binaria METABOLISMO ➔ Aeróbico estricto, ej. Mycobacterium tuberculosis y Pseudomonas aeruginosa ig Generan un metabolismo oxidativo ➔ Anaeróbico estricto, ej. Clostridium tetani Tienen un metabolismo fermentativo. Mueren en pequeñas concentraciones de m oxígeno, ya que no tienen las enzimas catalasa y superóxido dismutasa ➔ Anaerobio facultativo, la mayoría de las bacterias ej. Enterobacterias y Staphylococcus sp El Crecen con o sin oxígeno, tienen ambos metabolismos: oxidativo y fermentativo ➔ Microaerófilos Necesitan muy pequeñas cantidades de oxígeno. Utilizan un metabolismo fermentativo, aunque en algunos casos pueden llegar a oxidar intermediarios del oxígeno para sobrevivir. Por lo general no poseen catalasas, y pueden tener diferentes concentraciones de superóxido dismutasa. Las bacterias aeróbicas obtienen energía por respiración -> tienen dos enzimas muy importantes: superóxido dismutasa y la catalasa, van a degradar a especies reactivas de oxígeno para que no sean nocivas para las bacterias (NO cambia el pH). Las anaeróbicas por fermentación (cambia el pH). Fermentación: degradación de glúcidos en anaerobiosis Putrefacción: degradación de proteínas en anaerobiosis Efecto pasteur: en presencia de oxígeno, las bacterias tienden a respirar. @elmiguelito.apuntes 6  EXPRESIÓN GÉNICA ➔ Un solo cromosoma, ADN doble cadena circular superenrollado, con función de replicación, recombinación y expresión de genes. Se encuentra en una región citosólica -> nucleoide. El superenrollamiento del ADN le permite ser compacto, importante para la replicación, recombinación y transcripción de genes. Aumenta por la enzima ADN girasa y disminuye por la enzima topoisomerasa 1 El cromosoma bacteriano es una unidad de replicación autónoma -> replicón. En el inicio o proceso de transcripción tiene una secuencia que es el operón -> unidad de transcripción, compuesto por genes, promotor y operador (donde se van a unir las proteínas reguladoras) ➔ Ausencia de intrones ➔ Genes lineales, policistrónicos Policistrónicos son varios genes estructurales ➔ Islas de patogenicidad Los genes se van a ir agrupando para tener una función, o para condicionar el control de la replicación o ➔ Presencia de topoisomerasas y girasas ➔ Genes cromosómicos de resistencia a antibióticos lit ➔ Sitios de iniciación de la transcripción en -10 y -35 ➔ Transcripción y traducción simultáneas ue ➔ Presencia de factores sigma en vez de factores de transcripción El factor sigma es el que se une al promotor para iniciar su síntesis de ADN a ARNm ➔ Ausencia de glicosilación de proteínas ➔ Elementos móviles (plásmidos, transposones) ig Los transposones son segmentos de ADN con capacidad de movilizarse dentro del cromosoma o plásmido. Tienen genes estructurales, por ejemplo, que van a codificar m factores de virulencia, resistencia a los antibióticos. Además codifican la enzima transposasa necesaria para el propio movimiento de este segmento de ADN. Su función es mutar e integrarse a cromosomas y/o plásmidos. ➔ Transferencia de genes entre bacterias El ➔ Regulación por quorum sensing El quorum sensing es un mecanismo de control de expresiones genéticas dependiente de la densidad celular -> fenómeno que generan algunas bacterias responsable de que un conjunto de bacterias que están de forma independiente o separadas, a través de la generación de señales extracelulares, empieza a desarrollar comportamientos coordinados ➔ División celular amitótica TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO ENTRE BACTERIAS ➔ Transformacción ➔ Conjugación ➔ Transducción Transformación Las bacterias pueden adquirir bloques de ADN, que son las islas de patogenicidad. Van a portar genes que van a codificar factores de virulencia. Estas islas tienen un componente importante de hidratos de carbono, que es diferente del resto del genoma de la especie -> sirven para traspasar o mejorar especies bacterianas. @elmiguelito.apuntes 7 En este proceso, la bacteria va a capturar ADN libre a través de diferentes pasos: 1. Una bacteria recibe ADN libre, genera un cambio en su conformación para transformarse en bacteria competente -> capacitada para captar ese ADN libre. Lo que genera es una unión de ese ADN celular a la bacteria 2. Captura y procesamiento del ADN exógeno 3. Integración del ADN capturado al genoma de la bacteria que lo recibe para poder expresarlo Conjugación En este mecanismo va a haber una adquisición, una pérdida o un intercambio de plásmidos o transposones. Una bacteria va a generar un pili sexual, para interactuar con otra bacteria e intercambiar parte del plásmido o transposón. Para que haya transferencia del plásmido participa la proteína TRA, que cliva al ADN que está en el plásmido en un sitio determinado -> oriT La proteína permite que el plásmido cortado se movilice a través del canal o poro (pili sexual) para ingresar a la bacteria, la cual va a sintetizar la cadena complementaria de manera de generar un plásmido completo. En bacterias gram positivas el pasaje de plásmidos no se realiza a través de pilis, o sino de adhesinas proteicas. Transducción: bacteriófagos lit Este mecanismo se da a través de los bacteriófagos. Es la transferencia de información genética de una bacteria a otra a través de un bacteriófago. ue Bacteriófago o fagos: parásitos intracelulares obligados que se multiplican en el interior de una bacteria haciendo uso de parte o toda su maquinaria biosintética. Todos los bacteriófagos contienen ácidos nucleicos y proteínas ig -> según el fago puede contener ADN o ARN, pero no ambos. Está formado por una cabeza, que contiene material genético, un cuello, una cola y diferentes fibras que le permitirán quedar m inserto. REPRODUCCIÓN BACTERIANA El A través de fisión binaria. Se dividen y dan lugar a células hijas, que cada una de ellas va a heredar un cromosoma parcialmente replicado. Se da a 37° cada 20 minutos en la mayoría de las bacterias; las mycobacterium son de crecimiento lento y se da cada 12 hs. La bacteria primero extiende su pared, luego replica el cromosoma; uno de los cromosomas queda fijado a la membrana, uno de cada lado. La membrana se va a dividir en dos células hijas @elmiguelito.apuntes 8 Curva de crecimiento bacteriano Las bacterias en un principio se adaptan al medio -> período de latencia La fase de crecimiento exponencial se detiene en el momento en que los nutrientes del medio van a empezar a declinar, y el pH original se va a modificar desfavorable, y así pasar al estado estacionario, donde el crecimiento va a empezar a disminuir llegando a la última fase, la muerte. Las bacterias sobreviven por ejemplo, las que tienen movilidad con la quimiotaxis y la esporulación. o ESTERILIZACIÓN Y ANTISEPSIA Asepsia: carencia de gérmenes lit Antisepsia: eliminación de gérmenes sobre piel o tejidos vivos. Antisépticos: ue - agua oxigenada de 10 volúmenes - compuestos yodados - alcohol al 70% Esterilización: ig - autoclave: 121°, 20 min Esteriliza mediante el uso de calor húmedo. Funciona como si fuese una “olla a m presión”. Fases: Purgado: es la primera parte del proceso. Consiste en el aumento de la temperatura dentro del autoclave con la espita abierta (permite la salida de vapor = no aumenta la presión). Termina cuando se observa una salida El constante de vapor por la espita -> comienza a aumentar la presión Esterilización: espita cerrada se espera a que el manómetro marque 1 ATM. Al alcanzar la presión dentro del autoclave se esperan 20 minutos, a temperatura de 121°C - estufa de calor seco: 170°, 1-2 horas. Nunca poner tela. Desinfección: elimina microorganismos sobre superficies inertes. En la desinfección no se logra eliminar las esporas, pero en la esterilización sí. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS BACTERIAS 1. Toma de muestra (no nombrar como parte del diagnóstico) - Pruebas directas -> de un órgano o cavidad que va a estar infectada, que normalmente son sitios estériles - Pruebas indirectas -> esputo, orina; se recolectan de forma espontánea, que para poder recolectarla van a atravesar una región que tiene flora normal (puede contaminarse la muestra) - Muestras de sitios de flora normal -> intestino, faringe, piel; se busca presencia de bacterias que normalmente no están en las personas sanas. @elmiguelito.apuntes 9  Una vez tomada la muestra hay que transportarla en medio adecuado para asegurar que el agente sobreviva. 2. Microscopía (sólo en una bacteria se puede considerar como diagnóstico, solo es para ORIENTAR) Primero se la ve en fresco a la muestra, y luego teñida. 3. Aislamiento en cultivo del agente Los medios de cultivo pueden ser de dos tipos: - Sólidos -> agar. Utilizan ansas que se cargan con una cantidad de muestra, se utiliza una placa de petri y se pone a cultivar parte de la muestra. Las bacterias se van a multiplicar sobre la superficie del medio con agar, y forman colonias que son las que se van a poder ver - Líquidos o caldos de cultivo -> las bacterias crecen a determinada temperatura (37°), determinado ph (entre 6,5 y 7,5), y de acuerdo al tipo de bacteria ante determinadas concentraciones de oxígeno 4. Identificación a través de pruebas bioquímicas o serológicas - Prueba de la oxidasa: presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de electrones puede detectarse utilizando un aceptor de electrones artificial -> fenilendiamina Se utiliza para diferenciar pseudomonas que son oxidasa positivos dentro de las o enterobacterias, que son oxidasa negativas - Prueba de la catalasa: convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno lit molecular. Es positiva la prueba cuando se pone en contacto una bacteria con actividad catalasa y se producen burbujas de oxígeno. El género estafilococo es ue catalasa positivo, y el género streptococcus es catalasa negativo - Prueba de manitol - Prueba de ureasa: hidroliza la urea y origina amonio -> aumenta el pH del medio y a través de un indicador se puede observar ig - Prueba de la coagulasa - Prueba del indol: se realiza en especies bacterianas para determinar la posibilidad de que la bacteria pueda romper el indol del aa triptofano, eso va a generar un cambio de m color en el medio -> si es positivo rosado, si es negativo verde - Sistema API -> permite la identificación de cepas bacterianas gram positivas y gram negativas, y algunas levaduras El Coloraciones La Schaeffer-Fulton se usa para ver las esporas en el medio -> es lo verde La tinción de Ziehl-Neelsen permite ver las bacterias ácido-alcohol resistentes (resisten a la decoloración). Es para mycobacterium. - las ácido-alcohol resistentes se ven en rojo brillante - las ácido-alcohol sensibles se ven con azul de metileno (contraste) @elmiguelito.apuntes 10 Cultivos - Simples: medios sólidos para bacterias aerobias y anaerobias facultativas. Tienen nutrientes necesarios para bacterias que no sean demasiado exigentes - Enriquecidos: permiten el crecimiento de las especies bacterianas ‘fastidiosas’ -> requieren nutrientes específicos para crecer - Diferenciales: tienen suplementos que favorecen el desarrollo de determinadas bacterias, e inhiben el desarrollo de otras. Son medios que tendrán colorantes o determinados antibióticos. Ej. Mc. Conkey, Simmons, TSI -> dependiendo si es alcalino (rojo) o ácido (amarillo) el medio la bacteria va a metabolizar la glucosa - Selectivos - Aerobios o anaerobios Tipificación por secuenciación del gen codificante del ARN ribosómico 16S Sirve para tipificar las especies bacterianas en determinadas muestras. Se utiliza a través de o métodos de PCR. lit ue ig m El @elmiguelito.apuntes 11