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Vorlesung 3: Mikrobielles Wachstum Prof. Haike Antelmann Institut für Biologie -...

Vorlesung 3: Mikrobielles Wachstum Prof. Haike Antelmann Institut für Biologie - Mikrobiologie Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Mikrobielles Wachstum 1. Nährsto昀昀e für das Wachstum von Bakterien 2. Zellwachstum und bakterielle Zellteilung 3. Wachstum einer Popula琀椀on 4. Messung des mikrobiellen Wachstums 5. Umweltein昀氀üsse auf das mikrobielle Wachstum (Temperatur, Salz, pH, Sauersto昀昀) 6. Physikalische Kontrolle mikrobiellen Wachstums  Mikrobielles Wachstum 1. Nährsto昀昀e für das Wachstum von Bakterien und Kul琀椀vierung (Nährmedien) Stoffwechselprozesse für das Wachstum der Bakterien  Stoffwechsel Bausto昀昀wechsel (Anabolismus) Energiesto昀昀wechsel (Katabolismus) Intermediärsto昀昀wechsel (Amphibolismus) Katabolismus = Energiestoffwechsel Anabolismus = Baustoffwechsel  Vielfalt des Energiestoffwechsel Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Wachstum von E. coli Optimale Bedingungen: Verdopplungszeit 30min. nach 24h: 1x 1014 Zellen (1g) nach 48h: Masse 108 Tonnen Nährstoffe sind begrenzt ! Wenn Nährstoffe vorhanden, dann sehr schnelle Vermehrung möglich (Pathogene Bakterien) Was braucht E. coli zum Wachstum ? E. coli ist Chemo-organo-heterotroph  Was braucht E. coli zum Wachstum ? E. coli ist Chemo-organo-heterotroph C-quelle und Energiequelle: Glucose S琀椀cksto昀昀quelle: NH4+ Phosphatquelle: PO43- Schwefelquelle: SO42- Spurenelemente (Mg2+,Zn2+,Fe2+,Mn2+,K+,Na+,Ca2+,Cu2+) Vitamine Sauersto昀昀 als Elektronenakzeptor (Schü琀琀elkultur)  Kulturmedien für Bakterien Reiche Medien Definierte Medien Komplexmedium Minimalmedium Zusammensetzung, Zusammensetzung, Konzentrationen Konzentrationen exakt können variieren definiert Hefe Extrakt, teilweise Glucose, Na2HPO4, verdautes Fleisch KH2PO4, NH4Cl, MgSO4... Extrakt, Salz in exakter Menge z.B. Luria broth (LB) Tryptic soy broth (TSB)  Definierte und komplexe Kulturmedien Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson Kultivierung von Mikroorganismen  Kultivierung auf Agarnährboden: Kolonien mit >109 Bakterienzellen Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Shigella flexneri Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson Selektion auf Blutagar-Platten: Hämolyse-Nachweis Staphylococcus aureus a-Hämolysin ist ein poren- formendes Toxin, wird sekre琀椀ert von Staphylococcus aureus, lysiert Membran der Erythrozyten auf Blutagarpla琀琀en (Hämolyse)  Verdünnungsausstrich zur Isolierung von Einzelkolonien Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Mikrobielles Wachstum 2. Zellwachstum und bakterielle Zellteilung  Wie wachsen Bakterien? Binäre Teilung Genetisch identische Nachkommen Schnellste Wachstumsrate: 10min Verdopplungszeit in heißen Quellen Langsamste Wachstumsrate: 100 Jahre Verdopplungszeit, Sedimente der Tiefsee Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Min-Proteine steuern die FtsZ-Ring-Bildung im Zentrum - MinCD hemmt FtsZ-Ring - MinE verdrängt MinC - MinE steuert FtsZ und Divisom im Zentrum - FtsZ hydrolysiert GTP, Energie für FtsZ-Ring Polymerisierung und De- polymerisierung Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Der FtsZ Ring und das Divisom bei der Zellteilung Divisom Divisom für Zellwandsynthese während Zellteilung im Bereich des Septums FtsZ-Ring bei Zellteilung Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Zelluläre Zytoskelettproteine MreB und Cresentin Cresentin MreB Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Zellwandsynthese während der Zellteilung bei Kokken - Kokken kein MreB - Zellwandsynthese geht von einem Ort vom FtsZ-Ring aus Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Zellwandsynthese während der Zellteilung - Autolysine lysieren ß-1,4-glykosidische Bindung im Peptidoglykan an Wachstumszonen der ZW - Bactoprenol transportiert Glykan- tetrapeptide zu Wachstumszonen -Transglykosylase verknüpft Bausteine mit alter ZW (Zellwandband) Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13 th edition (2013), Pearson  Mikrobielles Wachstum 3. Wachstum einer Popula琀椀on (Verdopplungszeit, Wachstumskurven)  Wie wachsen Bakterien? Logarithmisches Wachstum Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Logarithmisches Wachstum n = Anzahl der Generationen g = Generationszeit (Verdopplungszeit) t = Zeit  Berechnung der Generationszeit Verdopplung der Zellen in einer bestimmten Zeiteinheit Aus einer Zelle werden zwei Zellen: 20  21 Aus zwei Zellen werden vier Zellen: 21  22 Aus vier Zellen werden acht Zellen: 22  23 Mathematische Beziehung zwischen ursprünglicher Zellzahl (N0) und Zellzahl nach exponentiellen Wachstum (N): NN0.2n (n = Anzahl der Generationen) Gleichung nach n auflösen: logN  logN0 + n log2  n  logN - logN0 / log2 n  3,3 (logN - logN0) Wachstumskonstante: k  n/t (Generationen/Zeiteinheit) Generationszeit: g  t/n  1/k  Beispiel 1 N2 fixierendes Bakt. besiedelt Wurzel. Nach 120h gibt es 10.000 N2 fixierende Bakterien. Wie lange ist die Verdopplungszeit ? n  3,3 (logN - logN0) Wachstumskonstante k  n/t Generationszeit: g  t/n  1/k  Beispiel 1 N2 fixierendes Bakt. besiedelt Wurzel. Nach 120h gibt es 10.000 N2 fixierende Bakterien. Wie lange ist die Verdopplungszeit ? n  3,3 (logN - logN0) Wachstumskonstante k  n/t Generationszeit: g  t/n  1/k N  10.000, N0 1  n  3,3 (log10000-log1)  13,2 Generationen t  120h Generationszeit: g  t/n  g= 120h/ 13,2 = 9 h g  9h d.h. Verdopplung der Zellzahl in 9h  Beispiel 2 Sie verspeisen 20 Salmonella enterica auf einem Keks. Alle Zellen gelangen in den Darm. Durchschnittl. Generationszeit: 2h, ab 106 Zellen fühlen Sie sich krank. Wie lange dauert es, bis Sie sich krank fühlen? N0  20, N  106, g2h  Beispiel 2 Sie verspeisen 20 Salmonella enterica auf einem Keks. Alle Zellen gelangen in den Darm. Durchschnittl. Generationszeit: 2h, ab 106 Zellen fühlen Sie sich krank. Wie lange dauert es, bis Sie sich krank fühlen? N0  20, N  106, g2h n  3,3 (logN - logN0)  n  15,51 Generationen bis zu 106 Zellen g  t/n, t  g x n, t  2h x 15,51 Generationen t 31h Es dauert 31h, bis sich die Zahl von Salmonella im Darm auf 106 Zellen vergrößert hat  Beispiel 3: SARS-CoV-2 Berlin In Berlin sind am 21.03.2020 insgesamt 868 Personen mit dem Coronavirus SARS-CoV-2 infiziert worden. Die Generationszeit beträgt derzeitig 2,5 Tage. Wie viele Infizierte sind in 1, 2 und 4 Wochen zu erwarten, wenn die Generationszeit weiter so bleibt, sich auf 2 Tage verkürzt oder auf 4 Tage verlängert ? N0  868, N  X, g 2,5 / 2 / 4 t= 7 / 14 / 28 Tage N  N0 x 2n n  3,3 (logN - logN0) g  t/n, t  g x n n= t/g n= 7/14/28:2,5 = 2,8 / 5,6 / 11,2 in 1 / 2 / 4 Wochen N = 868 x 22,8 = 6045 N = 868 x 25,6 = 42100 N = 868 x 211,2 = 2 Mio  N0  868, N  X, g 2,5 / 2 / 4 t= 7 / 14 / 28 Tage N  N0 x 2n n  3,3 (logN - logN0) g  t/n, t  g x n n= t/g n= 7/14/28:2,5 = 2,8 / 5,6 / 11,2 in 1 / 2 / 4 Wochen N = 868 x 22,8 = 6045 N = 868 x 25,6 = 42100 N = 868 x 211,2 = 2 Mio n= t/g n= 7/14/28:2 = 3,5 / 7 / 14 in 1 / 2 / 4 Wochen N = 868 x 23,5 = 9820 N = 868 x 27 = 111104 N = 868 x 214 = 14 Mio n= t/g n= 7/14/28:4 = 1,75 / 3,5 / 7 in 1 / 2 / 4 Wochen N = 868 x 21,75 = 2919 N = 868 x 23,5 = 9820 N = 868 x 27 = 111104  Wachstumskurve einer Bakterienkultur Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Die 4 Wachstumsphasen, Ursachen und Merkmale Wachstumsphasen Ursachen und Merkmale 1) Anlaufphase (lag-Phase) Anpassung an neue Bedingungen Induk琀椀on von Enzymen zur Verwertung von C- quellen o.a. Nährsto昀昀en konstante Zellzahl Sto昀昀wechsel ak琀椀viert RNA-Gehalt steigt Wachstumszunahme 2) Exponen琀椀elle Zellen nutzen op琀椀mal Nährsto昀昀e Wachstumsphase Konst. max Teilungsrate (log-Phase) Konst. Zellgröße Zelldichte steigt Substrate (C,N,P) verbraucht 3) Sta琀椀onäre Phase Verbrauch mind. eines Nährsto昀昀es (C,N,P) Anhäufung hemmender Sto昀昀wechselprodukte pH-Änderung (Alkalisierung) Resistenz gegen Umweltstress und An琀椀bio琀椀ka Konstante Zellzahl 4) Absterbephase Fehlende Energiequelle Toxisches Sto昀昀wechselprodukt Ly琀椀sche Enzyme induziert  Op琀椀sche Dichte (OD) bei 500nm Wachstumsrate (µ) und Teilungsdauer (td) InOD2 InOD2 – InOD1 µ[h-1]= td [h]= ln2/µ InOD1 Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Berechnung Wachstumsrate und Teilungsdauer anhand OD Wachstumsrate ist die Ratenkonstante für die Geschwindigkeit der Veränderung der Zellmasse (OD) Einheit für µ: 1/h µ [h-1]= InOD2 – InOD1 t2 – t1 Teilungsdauer ist das Zei琀椀ntervall für die Verdopplung der Zellmasse Einheit für td: h td [h]= ln2/µ  Mikrobielles Wachstum 4. Messung des mikrobiellen Wachstums (Gesamtzellzahl, Lebendzellzahl, OD)  Gesamtzellzahlbes琀椀mmung mit Zählkammer Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Gesamtzellzahlbes琀椀mmung mit Zählkammer Zählkammer nach Thoma 0,05 mm eingeschli昀昀enes Deckglas Deckglasstütze Bes琀椀mmung der Zellkonzentra琀椀on: Vq = 0,05 mm x 0,05 mm x 0,01 mm = 2,5 x 10-5 mm3 Vq = 2,5 x 10-8 ml Zellzahl in 40 Quadraten = vq x 40 = 10-6 ml Faktor zur Berechnung der Zellzahl/ml = 106  Bes琀椀mmung der Lebendzellzahl (Colony forming units=cfu) 2x108 Zellen/ml Gesamtzellzahl (Zählkammer) Verdünnungstufe: 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 100 µl 900 µl NaCl Zellzahl/ml: 2x107 2x106 2x105 2x104 2x103 2x102 Kolonien/Pla琀琀e: 2x106 2x105 2x104 2x103 2x102 2x101 (100 µl ausplattiert) 200 20 auszählbare Kolonien/ Pla琀琀e  Trübungsmessung mit dem Spektralphotometer Photozelle elektrisches Signal als Maß für das durchgehende Licht (Op琀椀sche Dichte) Lichtquelle einfarbiges Filter Licht wird an Blende trüber Probe gestreut Spektralphotometer zur Messung der op琀椀schen Dichte (OD) OD ist direkt proportional zur Zellzahl bei 500 or 540 nm (OD500 or OD540) Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Trübungsmessung mit dem Spektralphotometer Trübung wird als optische Dichte (OD) gemessen am Spekol under Nutzung von Licht bei einer Wellenlenge von 500 nm oder 540 nm (OD 500 or OD540) OD ist direkt proportional zur Zellzahl oder Masse in der Bakteriensuspension Extinktion = log (einfallende Strahlung / austretende Strahlung) Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Kontinuierliche Kultur: Chemostat (Fermenter) Populationsdichte durch Konzentration des wachstumsbegrenzenden Nährstoffs geregelt (konstant) Wachstumsrate durch Flussgeschwindigkeit konstant Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Kontinuierliche Kultur: Chemostat (Fermenter) Mit zunehmender Verdünnungsrate nimmt die Verdopplungszeit ab Wachstum kann bei hohen Verdünnungsraten nicht mehr ausgeglichen werden, auswaschen der Kultur Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Mikrobielles Wachstum 5. Umweltein昀氀üsse auf das mikrobielle Wachstum (Temperatur, Salz, pH, O2)  Der Ein昀氀uß der Temperatur auf das Wachstum Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Das Temperaturop琀椀mum von Mikroorganismen Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Hyperthermophile Bakterien und Archaea „Black smoker“ mit Ri昀琀ia tube worm “White smoker“ auf Heiße Quelle des Yellowstone Na琀椀onalpark auf Hydrothermalquellen Hydrothermalquellen (hyperthermophile Cyanobakterien) Thermus aqua琀椀cus Pyrolobus Ri昀琀ia symbionten Methanococcus jannaschii Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Anpassung Thermophiler und Hyperthermophiler Archaea Vorkommen in heißen Quellen, black smokern, Hydrothermalquellen Thermostabile Enzyme mehr hydrophobe Aminosäuren, mehr Ionenbrücken, stabiler und resistent gegen En琀昀altung Schutz-Sto昀昀e gegen Denaturierung: Thermus aqua琀椀cus Di-inositolphosphat, Di-glycerolphosphat, Mannosyglycerat Membran mehr gesä琀 gte Fe琀琀säuren und Lipid-Monoschicht aus Isoprenen mit Etherbindungen am Glycerol: Schutz vor dem Schmelzen der Membran Pyrolobus Thermosom als Proteinkomplex und Chaperone für Proteinfaltung Methanococcus Kalium schützt DNA vor Hydrolyse jannaschii Polyamine Putrescin und Spermidin schützen Ribosomen Reverse DNA Gyrase bewirkt posi琀椀ve Überspiralisierungen der DNA als Stabilisierung Taq-Polymerase aus Thermus aqua琀椀cus: thermostabiles Enzym für PCR-Reak琀椀onen Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Der Einfluß der Osmolarität auf das Wachstum Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Anpassung an hohe Osmolarität: Halophile Archaea Anpassung an Osmolarität in Bakterien  Accumulation of „Compatible solutes“ as osmoprotectants Strategy to counteract water efflux and shrinking of cells (plasmolysis) at high osmolarity Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Eigenscha昀琀en von „Compa琀椀ble solutes“ Structure stabilisa琀椀on of enzymes at high osmolarity Exclusion of compa琀椀ble solutes (blue circles) from the protein surface helps to maintain enzyme structure and increases cell volume Roy D Sleator & Colin Hill. (2002) FEMS Microbiology Reviews, Vol 26 (1): 49-71. https://doi.org/10.1016/S0168-6445(01)00071-7  Der Einfluß von sauren und alkalischen pH auf das Wachstum Alkaline pH perturbs the proton gradient across the membrane Alkaliphiles often use a Na+ gradient instead of a H+ gradient and Na+/H+ antiporter (H+ in, Na+ out) Acidic pH results in leakage of H+ into the cell, which disturbs enzymatic activities Acidophiles use H+- scavenging enzymes (e.g. glutamate decarboxylase) Logarithmische Skala ! pH- Veränderung um1 verändert Konzentration von H+ um Faktor 10 Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Aufrechterhaltung eines neutralen intrazellulären pH pH-Homöostase und Na+-Zirkula琀椀on bei Alkaliphilen  Einfluß von Sauerstoff auf das Wachstum Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Einfluß von Sauerstoff auf das Wachstum Obligat Obligat Fakulta琀椀v Micro- Aerob Anaerob Aerob aerophil Aerotolerant (a) Obligate aerob (cannot grow without oxygen) (b) Obligate anaerob (is killed by oxygen) (c) Facultative aerob (prefers to grow with oxygen if available, but can live without oxygen) (d) Microaerophilic (likes oxygen, but not too much) (e) Aerotolerant (can grow in the presence of oxygen, but cannot use it) Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Oxygen generates Reactive Oxygen Species (ROS) ROS entstehen durch stufenweise 1-Elektronenübertragung auf molekularen Sauerstoff e- e- e- e- O2 ⇒ O2 -⇒ H2O2 ⇒ HO ⇒ H2O -0.16 V +0.94 V +0.38 V +2.33 V Das hochreaktive Hydroxylradikal wird in der „Fenton“ Reaktion gebildet: Fe2+ + H2O2 + H+ ⇒ Fe3+ + HO + H2O ROS führen zu Schäden von Proteinen, DNA, Membranen Imlay JA. Annu Rev Biochem. 2008; 77:755-76.  ROS detoxification by antioxidant enzymes 2 O 2 - + 2 H + ⇒ H 2 O2 + O 2 Superoxiddismutase (Sod) 2 H 2 O2 ⇒ 2 H 2 O + O 2 Katalase (Kat) H2O2 + 2 GSH ⇒ GSSG + H2O Glutathion-Peroxidase (Gpx) R-OOH + 2 H+ ⇒ ROH + H2O Peroxiredoxine (OhrA, Prx, AhpCF) Catalase reaction of a bacterial cell suspension with a 30 % hydrogen peroxide solution Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson Mikrobielles Wachstum 3. Physikalische Kontrolle des mikrobiellen Wachstums Abtöten von Bakterien durch Hitze: Sterilisa琀椀on durch Autoklavieren Mikroorganismen werden im Autoklaven für 20min bei 134°C abgetötet.  Prinzip der dezimalen Reduk琀椀onszeit beim Autoklavieren Die dezimale Reduk琀椀onszeit (D) wurde für dasselbe mesophile Bakterium bei drei unterschiedlichen Temperaturen bes琀椀mmt. The higher the temperature - the shorter is the decimal reduction time. 15 min at 120oC is enough to eradicate even the most thermophilic or thermo- resistent bacterial cells or spores! Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson  Typisches Hitzepro昀椀l im Autoklaven Hitzepro昀椀l in einem Autoklaven und Vergleich der Temp. der autoklavierten Mikroorganismen und des Autoklaven. Mikroorganismen müssen im Autoklaven für 20min bei 120°C und 1bar autoklaviert werden zur vollständigen Sterilisa琀椀on (inklusive Sporen!) Aus: Michael T. Madigan, John M. Martinko u.a.; Brock Mikrobiologie,13th edition (2013), Pearson