Methods of Separation and Multidimensional Analysis 2024/25 PDF

2º Ciclo em Química - 2024/25 Departamento de Química e Bioquímica CURSO: 2º Ciclo em Química DISCIPLINA: Métodos Avançados de Análise Métodos de Separação e Multidimensionais Prog...

2º Ciclo em Química - 2024/25 Departamento de Química e Bioquímica CURSO: 2º Ciclo em Química DISCIPLINA: Métodos Avançados de Análise Métodos de Separação e Multidimensionais Programa 1. Introdução 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos 3. Conceitos Teóricos Fundamentais 4. Cromatografia em Fase Gasosa (GC) 4.1 GC Rápida 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna (HPLC) 5.1 UPLC 6. Cromatografia Quiral (ChC) 7. Processamento de Dados 8. Cromatografia Multidimensional 8.1 Cromatografia bidimensional (GC-GC e LC-LC) 8.2 Cromatografia bidimensional abrangente (GC×GC e LC×LC) 8.3 Acoplamento LC-GC 9. Eletroforese Capilar 9.1 Modos de desenvolvimento 9.2 Lab-on-a-chip MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 2 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 1 2º Ciclo em Química - 2024/25 Bibliografia  D. Skoog, F. Holler, T. Nieman, "Principles of Instrumental Analysis”, Saunders Coll. Pub., 5th Ed., 1998, 673-795.  D.C. Harris, ”Quantitative Chemical Analysis”, W.H. Freeman and Company, 6th Ed., USA, 2003, 548-719. o J.V. Hinshaw, L.S. Ettre, Introduction to Open-Tubular Column Gas Chromatography, Advanstar, USA, 1994. o V.R. Meyer, Practical High-performance Liquid Chromatography, Wiley, 2nd Ed., New York, USA,1994. o L. Mondello, A.C. Lewis, K.D. Bartle, Multidimensional Chromatography, John Wiley & Sons, Chichester, 2002. o N.A. Guzman, Capillary Electrophoresis Technology, Marcel Dekker, Inc., NY, 1993.  Diversos portais na internet, artigos de investigação científica e de divulgação MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 3 1. Introdução Definição da IUPAC  “Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary while the other moves in a definite direction.” MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 4 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 2 2º Ciclo em Química - 2024/25 1. Introdução Cromatografia: Evolução Histórica Mikhail S. Tswett (1903) Separou pigmentos de plantas (clorofilas e xantófilas) em colunas de carbonato de cálcio, tendo observado bandas coradas éter de petróleo mistura de A. Martin e R. Synge (1952) pigmentos Desenvolveram a cromatografia gasosa de partição tendo ganho o Prémio Nobel Marcel Golay (1957) CaCO3 pigmentos Pioneiro das colunas capilares - Alta resolução (GC) separados Csaba Horváth (1966) Desenvolveu e construiu o primeiro aparelho de HPLC Entre 1937 e 1972 foram atribuídos “doze Prémios Nobel” onde a cromatografia teve um papel central nas desenvolvimentos científicos efectuados CROMA GRAFIA “cor” “escrita” MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 5 1. Introdução Generalidades Métodos cromatográficos são um importante grupo de técnicas analíticas que permitem separar componentes afins em misturas complexas que outras técnicas ou meios se tornam impossíveis Em todas as separações cromatográficas as amostras são dissolvidas ou arrastadas pela fase móvel que pode ser um gás, um líquido ou um fluído supercrítico A fase móvel é seguidamente forçada através de uma fase estacionária imiscível que está fixa numa coluna ou superfície, podendo ser um sólido, um líquido ou um gel De acordo com os tipos de fases móveis e estacionárias, os componentes da amostra distribuem-se entre ambas as fases Os componentes que são fortemente retidos ou apresentam maior afinidade para a fase estacionária, movem- se mais lentamente e os que são ligeiramente retidos, movem-se mais rapidamente Estas diferenças de mobilidade apresentam como consequência a separação dos diferentes componentes em bandas ou zonas discretas que podem ser analisadas quer qualitativamente quer quantitativamente MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 6 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 3 2º Ciclo em Química - 2024/25 1. Introdução O Processo Cromatográfico Exemplo da separação de uma mistura binária por cromatografia de eluição em coluna MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 7 1. Introdução Âmbito da Cromatografia Análise (< mg; ex. amostras ambientais (ppb))  Separar para identificar e/ou quantificar compostos Preparativa (> mg; ex. indústria farmacêutica (%))  Separar para isolar e/ou purificar compostos (mais vulgar em LC) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 8 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 4 2º Ciclo em Química - 2024/25 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Modos de Sistematização Natureza física da fase móvel Suporte da fase estacionária Mecanismo do processo de distribuição o Introdução da amostra (eluição a mais vulgar) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 9 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Natureza Física da Fase Móvel Fase Móvel Fase Designação Abreviatura Estacionária Gás Líquido GLC GC Sólido GSC Líquido Líquido/Gel LLC LC Sólido LSC Fluído Líquido SFLC SFC Supercrítico Sólido SFSC Abreviaturas: Adoção de nomenclatura anglicizada: ex. GLC: Gas-Liquid Chromatography LLC: Liquid-Liquid Chromatography MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 10 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 5 2º Ciclo em Química - 2024/25 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Suporte da Fase Estacionária  Cromatografia em coluna - A fase móvel pode ser um gás, um líquido ou um fluído, podendo a mobilidade ser efetuada por: Gravidade “Clássica ou instrumental” Pressão  Cromatografia planar - A fase móvel só pode ser líquida, podendo a mobilidade ser efetuada por: Capilaridade MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 11 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Suporte da Fase Estacionária Cromatografia Gasosa - Sempre em coluna (empacotadas ou capilares) e instrumental Cromatografia Líquida - Planar (camada fina ou papel) ou em coluna (clássica ou instrumental) Clássica: - Colunas com diâmetro interno entre 1-2 cm (Não instrumental) - Gravidade impulsiona o fluxo de eluente - Análise lenta Instrumental: - Colunas com diâmetro interno entre 4-6 mm (HPLC) - Bomba impulsiona o fluxo de eluente a grande velocidade - Análise rápida Clássica LPLC vs HPLC Instrumental MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 12 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 6 2º Ciclo em Química - 2024/25 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Mecanismos do Processo de Distribuição  Cromatografia de partição  Cromatografia de adsorção  Cromatografia de permuta iónica  Cromatografia de afinidade  Cromatografia de exclusão molecular MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 13 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Cromatografia de Partição  A retenção do analito é determinada pela diferença de solubilidade que apresenta entre a fase estacionária líquida e a fase móvel que também é líquida, ou pela diferença de volatilidade ou solubilidade (na fase estacionária líquida), se a fase móvel for gasosa Fluxo Fase Estacionária Fase Móvel MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 14 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 7 2º Ciclo em Química - 2024/25 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Cromatografia de Adsorção  A retenção do analito decorre pela afinidade adsorvente das moléculas do analito à superfície da fase sólida estacionária, dependendo das interações com os respetivos centros ativos Fluxo Fase Estacionária Fase Móvel MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 15 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Cromatografia de Permuta Iónica  A retenção do analito ocorre através da permuta iónica entre os iões constituintes do analito e os iões fixos da fase estacionária orgânica através de atrações eletrostáticas Fluxo Fase Estacionária Fase Móvel Não aplicável ao GC MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 16 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 8 2º Ciclo em Química - 2024/25 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Cromatografia de Afinidade  A retenção do analito baseia-se na ocorrência de reações químicas entre as moléculas do analito e grupos funcionais ou ligandos específicos imobilizados na fase estacionária Não aplicável ao GC MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 17 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Cromatografia de Exclusão Molecular  A retenção do analito resulta da ação mecânica de exclusão ou crivagem do suporte estacionário, inerte e poroso, sobre as moléculas, sendo a distribuição efetuada por tamanhos moleculares Fluxo Fase Estacionária Fase Móvel Não aplicável ao GC MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 18 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 9 2º Ciclo em Química - 2024/25 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Resumo Processo de Fase Fase Suporte da fase Tipo de Abreviatura Distribuição Móvel Estacionária estacionária cromatografia Gás Líquido Coluna Cromatografia Gás-Líquido GLC Partiç Partição Líquido Líquido Coluna Cromatografia Líquido-Líquido / LLC / HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Líquido Líquido Planar Cromatografia em Papel PC Gás Sólido Coluna Cromatografia Gás-Sólido GSC Adsorç Adsorção Líquido Sólido Coluna Cromatografia Líquido-Sólido / LSC / HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Líquido Sólido Planar Cromatografia em Camada Fina TLC Troca Líquido Líquido/Gel Coluna Cromatografia de Troca Iónica / IEC / HPLC Iónica Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Afinidade Líquido Líquido/Gel Coluna Cromatografia de Afinidade / AC / HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Exclusão Líquido Líquido/Gel Coluna Cromatografia de Exclusão Molecular / SEC / HPLC Molecular Cromatografia Líquida de Alta Eficiência HPLC - Instrumental MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 19 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Escolha do Tipo de Cromatografia  Cromatografia em Fase Gasosa Amostras contendo compostos voláteis (p.e. < 200ºC), semi-voláteis ou facilmente volatilizáveis e não termolábeis ex. compostos apolares (n-alcanos, álcoois, esteres, etc.)  Cromatografia em Fase Líquida Amostras contendo compostos não-voláteis e termolábeis ex. compostos polares (iónicos, elevada massa molecular, etc.) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 20 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 10 2º Ciclo em Química - 2024/25 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Polaridade vs. Volatilidade log KO/W < 3 log KO/W ≥ 3 MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 21 2. Classificação dos Métodos Cromatográficos Aplicações  Atualmente, as técnicas cromatográficas são poderosas ferramentas analítica abrangentes e transversais a todas as áreas científicas: o Bioquímica (ex. análise de esteróides) GC  Petroquímica (ex. análise de gasolinas) o Indústria (ex. controlo da qualidade) o Biologia (ex. separação de metabolitos diversos) o Forense (ex. controlo de drogas de abuso) HPLC  Farmacêutica (ex. separação de enantiómeros) o Biomédica (ex. identificação de aminoácidos) MELHORIA DA QUALIDADE DE VIDA o Ambiente (ex. impacto de pesticidas) o Alimentar (ex. doseamento de ácidos gordos) o Produtos naturais (ex. aromas e fragrâncias) o Património (ex. arqueologia) etc. MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 22 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 11 2º Ciclo em Química - 2024/25 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Teoria da Separação Cromatográfica O MODELO TERMODINÂMICO relaciona-se com as interações entre os analitos e as fases envolvidas condicionadas pelo mecanismo de distribuição em questão (partição, adsorção, troca-iónica, afinidade e exclusão molecular) e diversas condições experimentais (tipo de fase estacionária, temperatura, razão de fase, tipo de fase móvel, etc.) O MODELO CINÉTICO relaciona-se com a dinâmica de transferência de massa dos analitos dentro da coluna, associado ao seu comprimento e diâmetro interno, bem como ao tipo e velocidade da fase móvel Quando estes dois modelos estão completamente otimizados para uma amostra em particular, obtemos a separação completa ou resolução dos analitos e o OBJETIVO É ALCANÇADO MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 23 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Teoria da Separação Cromatográfica Modelo termodinâmico: explica a seletividade em termos dos parâmetros de retenção - Tempo de retenção - Fator de capacidade Modelo cinético: explica a eficiência em termos da transferência de massa - Teoria dos pratos teóricos (“Plate theory”) “Martin & Synge” - Teoria das velocidades (“Rate theory”) “Van Deemter”  O “grau de separação ou resolução” entre componentes de uma amostra, pode assim ser explicado através dos seguintes conceitos: Seletividade (modelo termodinâmico) Resolução Eficiência (modelo cinético) “em tempo analítico aceitável” MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 24 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 12 2º Ciclo em Química - 2024/25 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Tempo de Retenção (tR) Parâmetro termodinâmico t R  t 'R  t M tR - tempo que o analito demora tR a percorrer a coluna desde o injetor até ao detetor Sinal do Detector tR’ - tempo de retenção ajustado tM tR’' ou tempo na fase estacionária tM - tempo morto ou tempo na fase móvel tempo / min MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 25 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Fator de Capacidade (k') Parâmetro termodinâmico  t 'R  k '     tM  5 < k' < 10 k’ - relaciona o tempo que o analito Para tempo de análise permanece na fase estacionária aceitável em relação à fase móvel tR  r  β    tM  2  df  : razão de fase - relaciona o volume da fase móvel e da fase estacionária, condicionando k’ Se    k'  Relaciona-se com as condições experimentais r: raio da coluna; df: espessura de filme MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 26 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 13 2º Ciclo em Química - 2024/25 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Seletividade () Parâmetro termodinâmico  k '2   '  Relaciona-se com a fase estacionária  k1    2 2 2 1 1 1 1 =1 >1  >> 1 aumento da seletividade  afastamento entre picos adjacentes MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 27 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Eficiência (N) - Conceito A migração um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da banda TEMPO EFICIÊNCIA de uma coluna é a capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 28 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 14 2º Ciclo em Química - 2024/25 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Eficiência (N) - Teoria dos Pratos Teóricos  Modelo desenvolvido pela dupla Martin e Synge 2 t  N  16   R  W MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 29 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Eficiência (N) - Teoria das Velocidades B H=HA +HB +HC =A+ +C×u u L L H=    u  Van Deemter N tM H=f  u  O gráfico de “H” em função de “u” é uma hipérbole Se H   N  MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 30 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 15 2º Ciclo em Química - 2024/25 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Resolução (RS)  Resolução (RS) traduz o nível de separação entre duas bandas adjacentes em tempo analítico aceitável  A medida de RS permite afirmar se dois componentes adjacentes são ou não completamente separados por uma coluna cromatográfica e depende de três fatores independentes, nomeadamente, fator de separação (), fator de capacidade (kB') e a eficiência (N). Para duas bandas adjacentes (A e B), RS calcula-se através das expressões: N (α  1) k '2 RS    ' 4 α (k 2  1) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 31 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Resolução (RS) N (α  1) k '2 RS    ' RS  1,5 4 α (k 2  1) 2 2 1 1 RS < 1,5 RS  1,5 MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 32 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 16 2º Ciclo em Química - 2024/25 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Exercício  , k’, RS, N ? MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 33 3. Conceitos Teóricos Fundamentais Rs - Vídeo #1 MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 34 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 17 2º Ciclo em Química - 2024/25 3. Conceitos Teóricos Fundamentais No Interior da Coluna Cromatográfica Analito Fluxo COLUNA Fase Móvel MODELO TERMODINÂMICO Fase Estacionária 𝐶𝑆 𝐾= 𝐶𝑀 MODELO CINÉTICO L tR = tR′ + tM N= H AMBOS OS MODELOS CONDICIONAM A tR 2 tR′ N = 16 × RESOLUÇÃO k′ = L W tM u= tR k2′ RS = × × α= k1′ H = H A + HB + HC = A + B / u + C × u MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 35 4. Cromatografia em Fase Gasosa Generalidades Apenas 10-20 % de todos os compostos podem ser analisados por GC, sendo uma técnica usada para amostras que contenham compostos orgânicos gasosos, voláteis ou semi-voláteis e simultaneamente sejam não termolábeis Amostra vaporizada Separação Deteção (injetor) (coluna) (detetor) Cromatografia gás-líquido (GLC) (maior aplicação) Cromatografia gás-sólido (GSC) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 36 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 18 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa O Cromatógrafo Gasoso Um cromatógrafo gasoso é constituído fundamentalmente por um injetor, forno (coluna), detetor e um PC com “software” adequado MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 37 4. Cromatografia em Fase Gasosa Gases de Transporte Fase móvel  Hidrogénio  Hélio  Azoto INERTE - Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento PURO - Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária A fase móvel em GC NÃO interage com a amostra - apenas a transporta através da coluna, sendo usualmente referida como GÁS de ARRASTE ou ARRASTAMENTO MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 38 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 19 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Fluxo de Arrastamento Máxima eficiência Curvas de Van Deemter  H2 (50-80 cm/sec)  He (30-40 cm/sec)  N2 (10-15 cm/sec) L(cm) u óptima  u  t M (sec) L H= Hmínimo  Nmáximo N Fluxo em colunas capilares : 0,5 - 15 mL/min Pressão à cabeça da coluna Fluxo em colunas de empacotamento : 10 - 60 mL/min MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 39 4. Cromatografia em Fase Gasosa Tipo de Injetores o Injetores (“inlets”) manuais ou automáticos (“autosamplers”)  Injetores seletivos  Injetores universais (microseringas) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 40 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 20 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Microseringas Microseringa de 1  L (seção ampliada) Microseringa de 10 L corpo agulha êmbolo agulha (inox 316) guia êmbolo (fio de aço corpo (pirex) soldado ao guia) Microseringas para amostras líquidas apresentam capacidades típicas de 1 L, 5 L e 10 L MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 41 4. Cromatografia em Fase Gasosa Injetores Universais  Quentes T = cte (+ vulgar)  vaporização isotérmica injeção direta com repartição de fluxo (S) Colunas capilares sem repartição de fluxo (SL) T  cte  vaporização com temperatura programada (PTV)  Frios  “on-column” Colunas capilares MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 42 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 21 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Injetor de Vaporização MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 43 4. Cromatografia em Fase Gasosa Split/Splitless - Modos de Operação Análise convencional Análise vestigial MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 44 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 22 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa “Split vs. “Splitless” - Exemplo MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 45 4. Cromatografia em Fase Gasosa Condições Genéricas da Injeção Quente (S/SL) Quantidade injetada representativa da amostra original Vaporização rápida com banda estreita e sem saturar a coluna Assegurar que a técnica de injeção não discrimina Assegurar que não ocorre “carry-over” (efeitos de memória)  Tinj > 50ºC acima da ebulição do componente menos volátil Uso de microseringa para amostras líquidas ou gasosa O volume injetado deve de ser pequeno e depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra Colunas Amostras Líquidas Amostras Gasosas Empacotada :  = 3,2 mm 0,2 L... 20 L 0,1 mL... 50 mL Capilar:  = 0,25 mm 0,01 L... 3 L 0,001 mL... 0,1 mL MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 46 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 23 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Injetor Automático Aumento da reprodutibilidade da injeção MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 47 4. Cromatografia em Fase Gasosa Tecnologia de Colunas Fase estacionária  A coluna é o coração do processo de separação cromatográfica  Os tipos de colunas mais usuais são: Colunas de empacotamento (GC) (packed columns) Colunas capilares (CGC; HRGC) (capillary ou open tubular columns) (+ vulgares na atualidade) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 48 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 24 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Tipo de Colunas Coluna de empacotamento Coluna capilar MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 49 4. Cromatografia em Fase Gasosa Constituição das Colunas Aço inoxidável, vidro ou sílica fundida Nas colunas de empacotamento, o enchimento é geralmente "terra de diatomáceas" revestida pela fase estacionária As colunas capilares, a fase estacionária reveste a parede interna da coluna (FSOT; WCOT; SCOT; PLOT) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 50 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 25 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Características das Colunas MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 51 4. Cromatografia em Fase Gasosa Colunas de Empacotamento vs. Capilares GC de baixa resolução (LRGC) vs. GC de alta resolução (HRGC) Análise de uma mistura de esteróides derivatisados LRGC HRGC Actualmente ainda são frequentemente usadas colunas de empacotamento quando não é necessária alta resolução ou em GSC MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 52 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 26 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Colunas Capilares Desenvolvidas por Marcel Golay MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 53 4. Cromatografia em Fase Gasosa Colunas Capilares - Fase Móvel MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 54 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 27 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Comprimento e Diâmetro da Coluna Aumento de L  Aumento da eficiência (N) Diminuição de ID  Aumento da resolução (Rs) (~ 4000 pratos teóricos/m)  Aumento da resolução (Rs) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 55 4. Cromatografia em Fase Gasosa Colunas Capilares - Fase Estacionária MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 56 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 28 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Fases Estacionárias (GLC) Mecanismo: Partição Polaridade da fase (polímero)  sensíveis à humidade e oxidação Polisiloxanos (silicones) Polietileno glicois MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 57 4. Cromatografia em Fase Gasosa Polaridade dos Solutos MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 58 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 29 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Interação Analito/Fase Estacionária Dispersiva: Sempre presentes e surgem em todas as interações moleculares Dipolo-dipolo induzido: Ocorrem entre moléculas com dipolos permanentes e moléculas polarizáveis Dipolo-dipolo: Interações fortes ocorrendo entre moléculas contendo dipolos permanentes Ligações de hidrogénio: Muito fortes ocorrendo entre partes moleculares capazes deste tipo de interação (ex. grupos hidroxilo) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 59 4. Cromatografia em Fase Gasosa Escolha da Fase Adequada  A fase estacionária para ser seletiva e interagir diferencialmente com os analitos em estudo deve possuir características de polaridade o mais idênticas tanto quanto possível Compostos apolares fase estacionária à base de polidimetil siloxano (100 %) ex. análise de n-alcanos Compostos de intermédia polaridade fase estacionária mista, à base de fenil, cianopropil e trifluoropropil polisiloxano (5-50 %) ex. análise de alcoóis Compostos polares fase estacionária à base de polietilenoglicol ou cianopropil (polidimetil silosano) (100 %) ex. análise de aromáticos MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 60 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 30 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Seletividade da Fase Estacionária a) 100 % Polidimetil siloxano b) 5 % (Fenilmetil) (dimetil) polisiloxano c) 50 % (Fenilmetil) (dimetil) polisiloxano d) 50 % (Trifluoropropil) (dimetil) polisiloxano) e) 100 % Polietileno glicol f) 50 % (Cianopropil) (dimetil) polisiloxano) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 61 4. Cromatografia em Fase Gasosa Escolha da Fase Adequada a) Polidimetil siloxano (apolar) b) Polietileno glicol (polar) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 62 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 31 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Fases Estacionárias (GSC) Características Gerais Mecanismo: Adsorção Sólidos finamente granulados (105 µm < dp < 420 µm) Grandes áreas superficiais (até 102 m2/g) Mais usados Polímeros Porosos (PLOT) - Porapak (copolímero estireno-divinilbenzeno), Tenax (polydiphenylene oxide) Inorganic Solids (Packed) - Carboplot, Carboxen (carvões ativados grafitizados), Alumina, Redes Moleculares (argilas microporosas), Zeólitos - Separação de gases Principais Aplicações - Compostos leves - Séries homólogas Indicadas para compostos gasosos MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 63 4. Cromatografia em Fase Gasosa Fases Estacionárias (GSC) ex. Análise dos voláteis de cerveja MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 64 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 32 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Forno - Modos de Operação Isotérmica (T = cte.) Indicada para compostos com retenção, polaridade e/ou volatilidade semelhante Bandas alargam com o aumento da retenção Rampa de temperatura (T  cte.) Indicada para compostos com polaridade e/ou volatilidade muito diferente Existe uma relação entre a retenção e a temperatura Necessidade de tempo para estabilização entre análises MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 65 4. Cromatografia em Fase Gasosa Isotérmica vs. Rampa de Temperatura Mistura de hidrocarbonetos: C6 - C21 MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 66 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 33 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Detetores Convencionais Detetor de ionização de chama (FID) Detetor de condutividade térmica (TCD) Detetor de captura eletrónica (ECD) Detetor de azoto-fósforo (NPD) Outros Hifenados (GC-MS e Tandem) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 67 4. Cromatografia em Fase Gasosa Detetor de Ionização de Chama (FID) Universal (exceções: NH3, CS2, NOx, CO, CO2, O2, H2O, N2, etc.) Gases de combustão: H2/ar Iões gerados pela pirólise das cadeias carbonadas (ex. hidrocarbonetos) 200ºC < T < 300ºC Terminal / fluxo de massa Sensibilidade: 0,1-10 ng Gama linearidade: 107 Muito usado em GLC Queima de substâncias com CH + O CHO+ + e- ligações C-H 1 íão formado por cada ~ 105 átomos de carbono queimados MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 68 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 34 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa FID - Exemplo de Compostos Detetados O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 não existem íões, não há condução da corrente elétrica Quando um composto orgânico elui é também queimado. Como na sua queima são formados íões, a chama passa a conduzir corrente elétrica MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 69 4. Cromatografia em Fase Gasosa Detetor de Condutividade Térmica (TCD) Universal (complementar ao FID) Variação da condutividade térmica do gás de arraste (ex. gás natural) 150ºC < T < 250ºC Não terminal / concentração Sensibilidade: 5-20 ng Gama linearidade: 105-106 Muito usado em GSC Usado particularmente para a separação e quantificação de compostos que não geram sinal em outros detetores (gases nobres, gases permanentes, etc.) Por ser um detetor não-destrutivo, pode ser usado em GC preparativa ou em deteção sequencial com dois detetores em linha (“Tandem”) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 70 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 35 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa TCD - Exemplo de Compostos Detetados MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 71 4. Cromatografia em Fase Gasosa Detetor de Captura Eletrónica (ECD) Seletivo Emissor  (63Ni; (β-, 0,06 MeV) Supressão de corrente causada pela captura de eletrões por eluatos muito eletrofílicos (elementos de elevada afinidade eletrónica) (ex. pesticidas organoclorados) 300ºC < T < 400ºC Não terminal / concentração Sensibilidade: 0,1-10 pg - Grande durabilidade Gama linearidade: 103-104 63Ni preferido em - Maior estabilidade térmica (~400ºC) equipamentos modernos - Boa linearidade Muito usado em GLC - Menor risco de uso (radioatividade) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 72 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 36 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa ECD - Exemplo de Compostos Detetados Um fluxo contínuo de eletrões lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte radioativa β-emissora) e um cátodo Na passagem de uma substância eletrofílica alguns eletrões são captados, resultando uma supressão de corrente elétrica MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 73 4. Cromatografia em Fase Gasosa Detetor de Azoto-Fósforo (NPD) Detetor Termoiónico (TID) Seletivo Gases de combustão: H2/ar Emissão de eletrões termoiónicos de uma fonte alcalina (Silicato de Rb) Responde a compostos orgânicos com N e P (ex. pesticidas azotados) 250ºC < T < 300ºC Terminal / fluxo de massa Sensibilidade: 1-10 pg Gama linearidade: 103-104 Muito usado em GLC Modificação do FID, altamente seletivo para compostos orgânicos azotados e fosforados MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 74 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 37 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa NPD - Exemplo de Compostos Detetados Pérola de sal de metal alcalino RbCl (mais comum), KCl A seletividade para fosforados ou nitrogenados é 10.000 a 100.000  em relação a hidrocarbonetos similares MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 75 4. Cromatografia em Fase Gasosa Sensibilidades e Gamas Lineares MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 76 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 38 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa GC-FID/SCD - Comparação Detetores Amostra de gás natural FID - Universal SCD - Seletivo MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 77 4. Cromatografia em Fase Gasosa Aquisição, Processamento e Análise de Dados Atualmente recorre-se a “ChemStations” que possibilitam: o O controlo de toda a instrumentação de GC ou conjuntamente com outros aparelhos em caso de hifenação (ex. GC-MS) o A aquisição de dados (cromatogramas) o Processamento dos dados analíticos através de análise qualitativa (identificação) e quantitativa (cálculo da concentração) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 78 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 39 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Controlo e Aquisição de Dados ChemStation MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 79 4. Cromatografia em Fase Gasosa GC - Vídeo #2 MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 80 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 40 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Áreas de Aplicação  A GC é uma poderosa ferramenta analítica muito útil nas seguintes áreas científicas: Bioquímica (ex. análise de esteróides) Petroquímica (ex. análise de gasolinas) Indústria (ex. controlo de qualidade em geral) Biologia (ex. separação de metabolitos diversos) Forense (ex. controlo de drogas de abuso) Farmacêutica (ex. separação de enantiómeros) Biomédica (ex. identificação de aminoácidos) Ambiente (ex. impato de pesticidas) Alimentar (ex. doseamento de ácidos gordos) Produtos naturais (ex. aromas e fragrâncias) Arqueologia (ex. componentes de óleos de pintura) etc. Amostras : gasosas, líquidas e sólidas Analitos : gasosos, voláteis e semi-voláteis Análise : direta ou vestigial MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 81 4. Cromatografia em Fase Gasosa Diesel : GC(SL)-FID MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 82 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 41 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa FAME : GC(S)-FID MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 83 4. Cromatografia em Fase Gasosa Gases Comuns : GSC(S)-TCD MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 84 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 42 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa Pesticidas Organoclorados : GC(SL)-ECD MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 85 4. Cromatografia em Fase Gasosa Pesticidas Organofosforados : GC(SL)-NPD MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 86 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 43 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa GC Rápida (“Fast GC”)  Indicada para amostras complexas (dezenas compostos) que exijam tempos de análise elevados Análise de FAME (ex. petroquímica) Colunas capilares de dimensões reduzidas: 2 - 10 m  0,1 mm ID Aumento do fluxo de gás de arraste (1200 mL/min) Aumento da velocidade de aquecimento da coluna (1200ºC/min) Volume de injeção reduzido (< 0,5 µL) Detetores de resposta rápida (ex. FID) o Fast GC: análises entre 5-10 min. o Ultra-fast GC: análises entre 1-2 min.  Importante em GC multidimensional abrangente MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 87 4. Cromatografia em Fase Gasosa GC vs. GC Rápida - Exemplo Análise de Querosene MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 88 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 44 2º Ciclo em Química - 2024/25 4. Cromatografia em Fase Gasosa GC Rápida - Vídeo #3 MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 89 4. Cromatografia em Fase Gasosa GC-on-a-Chip Canal ID   H   N  MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 90 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 45 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Generalidades A HPLC é uma técnica usada para amostras que contenham compostos não voláteis e/ou termolábeis Amostra introduzida Separação Deteção (injetor) (coluna) (detetor) Cromatografia líquido-líquido (LLC; reversa) (maior aplicação, > 90 %) Cromatografia líquido-sólido (LSC; normal) Cromatografia permuta iónica (IEC) Cromatografia de afinidade (AC) Cromatografia de exclusão molecular (SEC; GPC; GFC) Cromatografia líquida quiral (ChC) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 91 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Escolha do tipo de LC  Caraterística dos analitos envolvidos o Polaridade o Massa molecular  Análise ou preparativa MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 92 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 46 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna O Cromatógrafo Líquido Um cromatógrafo líquido é constituído fundamentalmente por reservatórios de solventes, bomba, injetor, forno (coluna), detetor e registador/integrador ou PC com “software” adequado MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 93 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Eluentes Fase móvel Tipo de solvente: Apolar: n-hexano,diclorometano, THF, etc. Polar: água, metanol, acetonitrilo, etc. Força do solvente: º (% modificador) pH: 2-10 ou < 8 Tipo do tampão: fosfato, acetato, etc. Força iónica: sais, tampão, etc.  Solventes para HPLC e filtrados (0,2 μm)  Desgaseificados (He e vácuo em ultra-sons) (automático)  Colocados em reservatórios de vidro MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 94 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 47 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Série Eluotrópica (Adsorção em sílica) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 95 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Força do Eluente (º)  Composição de diferentes solventes contendo a mesma força de eluente MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 96 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 48 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Seleção da Composição do Eluente MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 97 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Velocidade do Fluxo Curvas de Van Máxima eficiência Deemter  Diminuição do tamanho de partícula L(cm) u óptima  u  t M (sec) L H= Hmínimo  Nmáximo N ×r 2 (cm)×L(cm) F= tM (min) Fluxo normal : 0,5 - 2,0 mL/min MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 98 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 49 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Bombas Recíprocas Desenvolvidas por Csaba Horváth (1966) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 99 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Modos de Eluição Se a composição é fixa - eluição isocrática ex. H2O/MeOH (25 %/75 %) Indicada para compostos com retenção e/ou polaridade semelhante Bandas alargam com o aumento da retenção Se a composição é variável - eluição por gradiente ex. H2O/MeOH (90 %/10 %) MeOH (100 %; 5 min) (10 %/min) Indicada para compostos com polaridade muito diferenciada O tempo de análise é reduzido Necessidade de tempo para estabilização entre análises MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 100 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 50 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Eluição Isocrática Solvente A - Tampão aquoso Solvente B - ACN 1 mL/min MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 101 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Eluição Isocrática Solvente A - Tampão aquoso Solvente B - ACN 1 mL/min MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 102 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 51 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Eluição por Gradiente (“Linear”) Solvente A - Tampão aquoso Solvente B - ACN 1 mL/min MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 103 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Eluição por Gradiente (“Patamares”) Solvente A - Tampão aquoso Solvente B - ACN 1 mL/min MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 104 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 52 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Injetores Manuais/automáticos  A microseringa enche o "loop" (5-500L)  Após o "loop" estar cheio, liga-se o mesmo ao fluxo de eluente no sentido da coluna MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 105 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Microseringas Microseringa de 100 L êmbolo agulha (inox 316) corpo (pirex) Microseringas para amostras líquidas apresentam capacidades típicas de 100 L MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 106 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 53 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Posições “Load” e “Inject” MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 107 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Colunas Fase Estacionária O suporte da coluna é em geral de aço inoxidável e o enchimento depende do tipo de fase estacionária e portanto da cromatografia em questão (partição, adsorção, permuta iónica ou exclusão molecular) São geralmente usadas pré-colunas ou colunas guarda para reter substâncias indesejáveis que possam diminuir o tempo de vida das colunas analíticas As colunas analíticas para HPLC apresentam genericamente as seguintes características: 10 cm < L < 30 cm 4 mm < ID < 10 mm 3 m < dp 10 m 40.000 < N < 60.000 MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 108 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 54 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Colunas - Exemplos MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 109 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Fase Estacionária A fase estacionária para ser seletiva e interagir diferencialmente com os analitos em estudo o mecanismo de separação deve de ser criteriosamente selecionado Os mecanismos de separação mais usados são a fase reversa, fase normal, permuta iónica, afinidade, exclusão molecular e quiral A fase estacionária pode estar ou não ligada a um suporte MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 110 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 55 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Tipos de Fase Estacionária MODO FASE ESTACIONÁRIA FASE MÓVEL INTERAÇÃO EX. APLICAÇÃO NORMAL Sílica-gel Orgânica Adsorção Compostos (apolar) hidrofóbicos REVERSA Sílica-ODS Aquosa Partição Compostos (polar) orgânicos TROCA IÓNICA Gel de permuta Tampão aquoso Eletrostática Iões iónica AFINIDADE Empacotamento com Tampão aquoso Afinidade Biomoléculas ligandos EXCLUSÃO Gel ou polímero poroso Orgânica (GPC) Permeação MM MOLECULAR Aquosa (GFC) elevadas MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 111 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Cromatografia de Fase Normal  Nesta cromatografia a fase estacionária é um sólido, sendo a alumina e a sílica os materiais mais usados Fase estacionária polar e eluente apolar (ex. n-hexano, éter de petróleo, etc.) Tempo de retenção: hidrocarbonetos < éteres < álcoois < ácidos carboxílicos, devido ao aumento acentuado da polaridade Muito importante selecionar a correta fase móvel, como na cromatografia líquida de partição, uma vez ser a única variável que podermos alterar no jogo de polaridade  Aplicações Análise de compostos apolares (hidrofóbicos) com MM < 5000 Da Análise de amostras solúveis em solventes apolares Muito eficaz na separação de isómeros, etc. MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 112 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 56 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Partículas de Sílica Microporosa Protonada a 2 < pH < 3 MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 113 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Colunas de Sílica Monolítica Permite maiores fluxos MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 114 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 57 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Cromatografia de Fase Reversa  É a mais usada das cromatografias líquidas e há duas formas de disposição da fase estacionária: Na cromatografia líquido-líquido a fase estacionária está adsorvida no suporte Na cromatografia de fase ligada a fase estacionária está ligada quimicamente ao suporte, sendo atualmente a mais usada uma vez apresentar menores perdas durante as análises Cromatografia de fase ligada ou de partição Suportes: Sílica (+ usada) Derivados de sílica Sólidos uniformes Sólidos porosos Fases estacionárias : Octadecil, octil, metil (+ vulgar) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 115 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Outras Abordagens  Cromatografia do par-iónico (Fase Reversa)  Cromatografia quiral - Separação de misturas racémicas Fase estacionária: ciclodextrinas (Fase Normal ou Fase Reversa) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 116 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 58 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Fase Reversa - Aplicações MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 117 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Cromatografia de Permuta Iónica (IEC)  Resinas de permuta iónica nesta cromatografia a fase estacionária é um sólido, sendo os mais usados a alumina e a sílica Resinas de permuta iónica desenvolvidas a partir de 1970 para troca aniónica e catiónica O equilíbrio de permuta iónica é baseado na troca entre iões de uma solução e iões situados num sólido de elevado peso molecular Tipos de permutadores:  Naturais (ex. zeólitos e argilas)  Sintéticos (desenvolvidos em 1930 para purificar águas) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 118 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 59 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna IEC - Grupos Catiónicos e Aniónicos  Na fase estacionária o empacotamento é geralmente à base de estireno- divinil benzeno com grupos funcionais, a revestir vidro, sílica, etc. MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 119 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna IEC - Equilíbrios Envolvidos  Sítios ativos mais comuns:  Catiónicas : -SO3- H+ (ác. forte) -COO- H+ (ác. fraco) x RSO3- H+ (s.) + Mx+ (aq.)  RSO3-x Mx+ (s.) + x H+ (aq.)  Aniónicas : -N(CH3 )3+ OH- (base forte; aminas quaternárias) -NH3+ OH- (base fraca; aminas primárias) x N(CH3 )3+ OH- (s.) + Ax- (aq.)  N(CH3 )3+x Ax- (s.) + x OH- (aq.) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 120 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 60 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna IEC - Propriedades Eletrostáticas  Geralmente a atração eletrostática aumenta com o aumento da carga e/ou tamanho do ião (raio iónico), ou seja: Catiões: La3+ > Ce3+ > Al3+ >> Ba2+ > Pb2+ > Ni2+ >> Ag+ > K+ > H+ Aniões: PO43- >> SO42- > C2O42- >> I- > NO3- > OH- > F-  Esta ordem depende igualmente do tipo de resina e das condições experimentais impostas MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 121 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Cromatografia de Exclusão Molecular  Aplicável a espécies com elevada massa molecular SEC Exclusão molecular :  Filtração em gel (fase móvel é aquosa)  Permeação em gel (fase móvel é orgânica) “A separação é baseada nos diferentes tamanhos moleculares dos analitos. Quanto maiores forem mais excluídos são da rede constituinte da fase estacionária” “Não há interação física e química entre o analito e a fase estacionária” MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 122 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 61 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna SEC - Tipos de Fases Estacionárias  Empacotamento (+ vulgar)  Rígidos (redes): sílica (propriedades vantajosas), vidro (40-2500 Å)  Moles (géis): poliestireno-divinilbenzeno (polímeros) No caso dos géis, o tamanho do poro está associado às ligações cruzadas da malha polimérica Géis :  hidrofílico (divinilbenzeno sulfonado)  hidrofóbico (divinilbenzeno) Eluentes  Diversos eluentes são usados, desde a água ao tetrahidrofurano (THF) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 123 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna SEC - Exemplo de Fases Estacionárias MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 124 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 62 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna SEC - Aplicações Açúcares Oligómeros (dímeros, trímeros e tetrâmeros) Peptídeos Enzimas Polímeros naturais e sintéticos Biomoléculas “Separação de compostos com elevado peso molecular” MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 125 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Detetores Convencionais Detetor de ultravioleta/visível (UV/vis) (70 % análises) Detetor de rede de díodos (DAD) Detetor de fluorescência (FLD) Detetor de índice de refração (RID) Detetor de condutividade eletrolítica (ELCD) Detetor eletroquímico (ELD) Detetor de dispersão de luz (LSD) Outros Hifenados (LC-MS e Tandem) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 126 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 63 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Detetor de Ultravioleta e Visível (UV/vis) Comprimento de onda () variável / múltiplo Seletivo (moléculas cromóforas) Absorção (sinal espetroscópico) Lei de Lambert-Beer (A = log (Io/I) = εlc) Não terminal Muito sensível para o máximo  (ng) (ex. 190-900 nm) MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 127 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Moléculas Cromóforas Aumento do percurso ótico do detetor (b) promove aumento da sensibilidade MAA Métodos de Separação e Multidimensionais 128 MAA - Métodos de Separação e Multidimensionais 64 2º Ciclo em Química - 2024/25 5. Cromatografia em Fase Líquida em Coluna Seleção do Comprimento de Onda () Antraceno MAA