Protocol LP 1 - Biochimie Clinică - Universitatea Stefan cel Mare Suceava

Universitatea Stefan cel Mare Suceava Medicina si stiinte biologice BC III Biochimie clinica Protocol LP 1 Microscopia optica Prin microscopie optica pot fi urmarite cu usurinta bacteriile,fungii,parazitii e.t.c.Produsul patalogic este depus pe o lama de microscopie (sticla) si examinat la mic...

Universitatea Stefan cel Mare Suceava Medicina si stiinte biologice BC III Biochimie clinica Protocol LP 1 Microscopia optica Prin microscopie optica pot fi urmarite cu usurinta bacteriile,fungii,parazitii e.t.c.Produsul patalogic este depus pe o lama de microscopie (sticla) si examinat la microscop optic ca atare (preparat nativ) sau dupa prelucrare (coloratii). La preparatele microscopice se pot descrie marimea (apreciata in µm aproximativ),forma,dispozitia,mobilitatea si colorabilitatea. Microscopul optic functioneaza pe principiul controlului,cu ajuorul unor lentile de sticla,a unui fascicol luminos care strabate preparatul de pe lama.Lentilele din obiectiv si din ocular condenseaza lumina formand o imagine marita de mai multe ori. Obiectivele cele mai comune pot fi: - Uscate -- produc mariri ale imaginii de 10x,20x sau 40x.sunt cel mai usor de utilizat si sunt utile pentru evaluarea primara a preparatului. - Umed -- produce marire a imaginii de 100x,necesita ulei de imersie care realizeaza dispersia corespunzatoare a luminii,util pentru evidentierea bacteriilor si a detaliilor morfologice. **Examenul microscopic se executa fie direct din produsele patologice(examen microscopic direct),fie din culturi pure.** **Preparatele microscopice sunt de doua tipuri :** - **Preparat nativ,cu germeni vii** - **Frotiu sau preparat colorat,cu germeni omorati.** **Examinarea microscopica a preparatului nativ,presupune examinareadirecta intre lama si lamela a unei suspensii de germeni vii,intr-o picatura de ser fiziologic sau mediu de cultura lichid,precum si a produsului patologic(sange,sediment urinar,l.c.r.).Examinarea preparatului nativ are implicatii restranse si nu ofera informatii asupra tuturor proprietatilor morfologice a bacteriilor,de aceea el trebuie completat cu examinarea preparatului colorat.** ORGANIZAREA, COMPARTIMENTELE LABORATORULUI CLINIC Laboratorul clinic are o structură funcţională împărţită în unul sau mai multe compartimente şi r-.ume: a. biochimie clinică b) hematologie (determinare hemoleucograme; morfologie; -hemostază; imunohematologie) c) serologie d) imunologie e) microbiologie f) toxicologie g) genetică. In domeniul medical (biologi, biochimişti şi chimişti) precum şi de personal mediu sanitar cu specializare în laborator clinic. Laboratorul de analize medicale trebuie să fie astfel structurat şi dotat încât să prevină riscul. contaminării accidentale şi să poată funcţiona în mod fluent. Principiile care stau la baza indeplinirii acestui obiectiv sunt următoarele: 1. 2. 3. separarea activităţilor în timp şi spaţiu; 4. **PROCEDURI DE COLECTARE A SÂNGELUI** Analizele hematologice sunt foarte variate si utilizează sânge capilar sau sânge venos. Sângele capilar este preferat pentru tabloul sangvin periferic.Acesta se obţine prin puncţionarea 1. la nivelul lobului urechii, pulpa degetului inelar sau mijlociu, 2. faţa plantară a degetului mare de a picior sau călcâiul la sugar sau copil mic, 3. pulpa degetului la copilul peste un an Inainte de puncţionare se dezinfectează cu alcool 70% pulpa degetului. Se aşteaptă puţin (pentru evaporarea alcoolului) şi cu ajutorul unei lantete sterile, se puncţioneză aproximativ 2-3 mn adâncime. Prima picătură de sânge capilar este indepărtată (conţine detritusuri celulare) cu hârtie de filtru sau cu un tampon sterii, după care picătura următoare se colecteză pe o lamă sticlă sau intr-un microtub special. Nu este indicat să se stoarcă regiunea înţepată pentn obţinerea picăturii, deoarece sângele se diluează cu limfa.La sfarsit se aplica pe regiunea înţepată un tampon cu vată cu alcool. Sângele venos se obţine prin puncţionarea venei (venopuncţie),cel mai frecvent la nivelul venei antecubitale,iar în caz că aceasta e greu decelabilă se alege orice venă uşor abordabilă Tehnica de recoltare necesită realizarea unei staze venoase cu ajutorul garoului deasupra regiunii ce urmează să fie puncţionate. Pacientul este rugat să strângă şi să desfacă pumnul de câteva ori. Se dezinfectează pielea cu alcool 70%. apoi se efectuează puncţia. Se poate folosi in loc de alcool şi Betadină (conţine iod " însă după aplicare trebuie aşteptat până se evaporă aproximativ 2 minute. Vena se puncţioneza cu un ac steril de serigă sau cu ac fixat la un sistem de colectare a sângelui în vacutainere. Mărimea acului trebuie să aibă calibrul de 1 mm şi diametrul exterior de 1.5 mm, si să fie steril. Dacă se folosesc ace mai înguste (tip intramuscular) există riscul hemolizei. Legislaţia sanitară actuală indică obligativitatea recoltării a sângelui în sisteme închise numite vacutainere. Sistemul de recoltare presupune un vacutainer (tub închis cu vacuum), un holder (pentru recoltări multiple) şi un ac ataşat la holder. Astfel, se pot utiliza mai multe vacutainere ce vor aspira exact volumul de sânge scris pe tub. Este de la sine înţeles faptul că aceste tuburi nu trebuie să fie deschise înainte de utilizare. Nu se recoltează niciodată de pe sondele pe care s- administrează iv medicamente, fluide sau sânge! După recoltare se dezinfecteză cu alcool sau Betadină şi se apasă scurt pe zona puncţionată. Numeroase analize pentru numărarea elementelor figurate sau bilanţul hemostazei utilizeaza anticoagulanţi specifici. Neconcordanţele legate de tipul de anticoagulant şi proporţia eronată anticoagulantului faţă de sânge pot duce la erori majore de diagnostic. Pentru a se evita contaminarea posibilă cu anticoagulant/ aditiv din vacutainere, ordinea recomandată pentru utilizarea vacutainerelor la recoltarea de sânge venos la acelaşi pacient este: 1. flaconul pentru hemocultură 2. vacutainere pentru coagulare (dop albastru) 3. vacutainer pentru ser (dop roşu) 4. vacutainer cu heparină (dop verde) 5. vacutainer cu EDTA pentru hemogramă (dop mov) 6. vacutainer pentru VSH (dop negru) Pentru examenul citologic al frotiului sangvin, recoltarea de sânge se face din pulpa degetul, sau frotiul poate fi întins din sângele recoltat pe EDTA, din aceeaşi zi. +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | **Culoare** | **Aditiv** | **Determinări** | | | | | | **Vacutainer** | | | +=======================+=======================+=======================+ | Violet, mov, lavandă | K ; EDTA pudră | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Albastru deschis | 3.2%citratdeNa 3.8% | Bilanţ heniostază- | | | cifrat de Na CTAD | PT, APTT. TT. factori | | | (cifrat, teofilinâ. | de coagulare, | | | adenozinâ. | fibrinogen, etc. | | | dipiridamol) | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Negru | Cifrat trisodic | VSH | | | lichid | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | **Culoare** | **Aditiv** | **Determinări** | | | | | | **vaeutainer** | | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Galben | Activator coagulare | Biochimie, Imunologie | | | Gel pentru separarea | - determinâri din ser | | | serului | Asigură coagularea | | | | sângelui în 30 | | | | minute. | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Verde | Heparinat de Li sau | Biochimie, imunologie | | | Na | - determinări din | | | | plasmă Plasma | | | | prezintă avantajul de | | | | a fi lucrată rapid, | | | | nu conţine fibrină. | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Roşu | Fără aditiv (sticlă) | Biochimie. Imunologie | | | sau Cu activator | - determinări din ser | | | coagulare (plastic) | Asigurăcoagulareasâng | | | | elui | | | | în 60 min (tară | | | | aditiv, din sticlă). | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Gri | Florură de Na = | Pentru determinarea | | | inhibitor al | glicemiei. După | | | glicolizei. | recoltare glucoza | | | | scade cu 7% pe oră în | | | | proba prelevată. | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ Pregătirea probelor de sânge Pentru analizele care se determină din ser. se recoltează sânge venos în vacutainere fără aditivi sau cu acceleratori de coagulare şi după 30 minute se centrifughează la 3 000 RPM timp de 10 minute. Dacă probele nu se pot prelucra imediat după centrifugare, se pot păstra un anumit interval de timp, in condiţii de temperatură precizate in standarde, pentru fiecare test. Astfel, stabilitatea analiţilor uzual dozaţi este păstraiă dacă probele se păstrează la 4-8°C maxim 3 zile (cu unele excepţii), la -20^C^C pentru o lună şi la minus 80°C sau în azot lichid pentru ani de zile Sunt de evitat ciclurile repetate de congelare-decongelare. Pentru a evita hemoliza, nu se congelează sânge integral. FACTORI CARE POT INFLUENŢA REZULTATELE ANALIZELOR Ciclul de testare al laboratorului începe şi se finalizează cu pacientul şi include următoarele etape: 1.etapa preanalitică (indicarea testelor, recoltarea, conservarea şi transportul probelor) 2\. etapa analitică (efectuarea analizelor) 3\. etapa postanalitică (validarea, transmiterea şi interpretarea rezultatelor). In toate aceste etape pot interveni factori care influenţează rezultatele testelor de laborator. Avand în vedere că în decizia clinică rezultatele de laborator au o pondere de 70%. aceşti factori trebuie cunoscuţi şi luaţi in considerare in cazul unui rezultat discordant cu celelalte rezultate sau cu contextul clinic al pacientului. 1. **Factori pre-analitici care pot influenţa rezultatele analizelor.** Aceştia pot fi **legaţi** de a. Starea de nutriţie : - - b. medicaţia (antiinflamatoarele nonsteroidiene duc la creşterea transaminazelor. statinele pot produce creşterea enzimelor - CPK. ASAT. barbituricele şi unele antibiotice produc creşterea GGT. etc). c. efortul fizic, fumatul, stresul (toate trei antrenează descărcările de catecolamine determinând creşterea glicemiei şi a numărului de leucocite), d. consumul cronic de alcool (creşteri ale acidul uric, trigliceridelor, amilazei, IgA, GGT, volumul eritrocitar mediu - VEM) etc; e. factori legaţi de corectitudinea recoltării, transportului, identificării şi conservării probelor. 2. **Etapa analitică** (7-13% din totalul erorilor). Erorile legate de factorii analitici se referă la prelucrarea eronată a probelor în laborator: defecţiuni ale echipamentelor, interferenţe (exogene sau endogene), eşec nedetectat în controlul calităţii. 3. **Etapa post-analitică** (38-66% din totalul erorilor): validare eronată a datelor, raportare deficitară/eronată a rezultatelor, interpretarea necorespunzătoare a datelor de către clinician. **Metode de laborator uzuale folosite in compartimentul de biochimie din laboratorul clinic** Principiu:Cuprinde un domeniu larg de metode fizico-chimice utilizate pentru a separa şi a doza amestecuri complexe de compuşi. Componentele ce urmează a fi separate se distribuie între doua faze: staţionară şi mobilă, aflate în interacţiune. Rezultatul analizei constă într-o cromatograma. Tipuri de cromatografie: gazoasă, în fază lichida, schimbătoare de ioni, de afinitate. Sensibilitate: pmol/L Compuşi determinaţi: Aminoacizi. Peptide,antigeni. imungiobuline specifice, ş.a.. **TURBIDIMETR1A** Principiu: Turbiditatea este opacitatea sau lipsa de transparenţă a unei soluţii, provocată de particule foarte fine, care nu pot fi observate cu ochiul liber şi care aflate în suspensie în lichid, difuzează şi reflectă radiaţia luminoasă. Metoda măsoară dispersia luminii după ce aceasta a strabatut o soluţie cu particule în suspensie. Masurarea turbidităţii, numită *turbidimetrie* este o metodă de analiză ce constă în măsurarea concentraţiei unei emulsii, comparându-i transparenţa cu un preparat etalon. Este o metodă de analiza pentru determinarea concentraţiei unui component dintr-o soluţie, prin adăugarea unui reactiv.Acesta poate conţine anticorpi specifici faţă de analitul de interes- Ag, complexele imune rezultate fiind cele care conferă un grad de turbiditate soluţiei. Sensibilitate: g/1 Compuşi determinaţi: fibrinogen. complement C3. IgG, Ig.A. IgM. alta-1 antitripsina. antitrombina III. proteina C reactivă (PCR). apolipoproteina A,B Nefelometria se bazează pe măsurarea intensităţii luminoase difuzate printr-un mediu neomogen. Este o metodă de analiză folosită pentru determinarea concentraţiei unei suspensii utilizand intensitatea opalescentei, cu ajutorul luminii difuzate lateral in unghi de 90° de particule aflate in suspensie. O solutie complet limpede nu disperseaza lumina. Detecteaza portiuni din radiatiile luminoase care au fost dispersate in unghi sau reflectate catre un detector,dupa ce au strabatut o solutie tulbure.este o solutie mai sensibila in comparatie cu cea turbidimetrica. Sensibilitate: mg/l Compuşi determinaţi: Antitrombina III,PCR,fibrinogen,imunoglobuline,alfa 1 antitripsina,complement C3 **DOZARE IONI PRIN METODA POTENŢIOMETRICĂ ISE** Principiu[:]{.smallcaps} măsurări directe prin intermediul electrozilor selectivi de ioni (ISE). Un sistem ISE este format dintr-un senzor care transformă activitatea unui anumit ion dintr-o soluţie, într-un potential electric măsurabil de către un voltmetru sau pH-metru. Diferenţa de potenţial rezultă din masurarea fata de un electrod de referinţă cu potenţial constant. Activitatea ionului solutie este proporţională cu concentraţia ionului respectiv, permiţând cuantificarea lui cantitativa. Interferente analitice: prezenţa unor alţi ioni cu proprietăţi similare ionului de testat, temperatura şl ph-ul Sensibilitate: mmol/l **Ioni determinaţi: Ca2+, Na +, K+ , CI-, Li+** **SPECTROFOTOMETRIE** Principiu: Spectrofotometria este o ramură a spectroscopiei care se ocupă cu măsurarea cantitativa a proprietăţilor de reflexie sau de transmisie ale unui analit dintr-o soluţie. în funcţie de lungimea de undă cu care interacţionează.Masoara cu ajutorul unui instrument (spectrofotometru/ fotometru) concentraţia unei substanţe dintr-o soluţie incoloră/ colorată, prin compararea intensităţii de culoare cu ale standardelo substanţei ce se delermina. Sensibilitate: mg/dl **Loni determinaţi: enzime,proteine,lipide,glucoza** **ELECTROFOREZA** Principiu: Migrarea diferenţială a particulelor urnii amestec (soluţie, ser) aplicat pe un suport semisolid (gel agaroză. Acetat de celuloză, hartie), conectat la un câmp electric continuu. Proteinele prezintă grupări ionizabile. astfel incat in soluţii tampon cu un anumit pH. unele molecule voi fi încărcate electric cationi (t) şi anioni (-) şi vor migra spre polul opus încărcării lor electrice. Separarea acestor particule într-un câmp electric este proporţională cu mărimea şi incarcarea (sarcina) electrică a particulei. In urma separării proteinelor serice rezultă proteinograma, iar al lipidelor serice lipidograma. Sensibilitate: g/I Compusi separaţi: proteine serice şi urinare, lipoproteine. imunoglobuline, hemoglobina, izoenzime.