Les Enzymes de Restriction PDF

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Université Frères Mentouri Constantine 01 L3 Bioinformatique Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Année universitaire 2024/2025 Département de Biologie Appliquée Présenté par Dr Méziani D.Y Chapitre IV : Techniques de génie génétique Rappel : les bactériophages Les bactériophages sont des virus qui infectent les bactéries. Ils sont composés d'un génome d'acide nucléique (ADN simple brin ou double brin ou ARN) entouré par une couverture protéique protectrice. Les bactériophages ne peuvent se multiplier qu'en utilisant la machinerie moléculaire de la bactérie qu'ils infectent. L'infection d'une cellule par un phage peut suivre une voie lytique ou lysogénique.  Infection lytique : le phage provoque la lyse de la cellule hôte après son injection. (exp phage T4).  Infection lysogénique : le phage ne provoque pas la lyse immédiatement mais après une longue période pendant laquelle il se développe en même temps que le génome bactérien. (exp phage lambda: λ). 1 Parfois, l'infection de la bactérie par le phage ne provoque ni la lyse de la cellule bactérienne ni la multiplication du phage. Ce constat expérimental peut résulter de deux phénomènes : la lysogénie ou la restriction. Dans le premier cas l’ADN du phage est intégré dans le DNA bactérien sous forme silencieuse, néanmoins susceptible d'être réveillée par une agression physique (UV, chauffage…). Dans le second cas l’ADN phagique est détruit dès son entrée dans la bactérie par un système de protection : restriction-méthylation 1. Les enzymes de restriction Les enzymes de restriction (ou endonucléases de restriction) sont des enzymes bactériennes qui protègent normalement l’ADN de la bactérie en détruisant l’ADN de phages après sa pénétration. Pour détruire l’ADN du parasite, la bactérie utilise le système de restriction- méthylation. Elles catalysent la coupure de l’ADN non méthylé à des endroits caractérisés par une séquence spécifique de nucléotides (site de restriction). Les produits de cette digestion sont les fragments de restriction, dont la longueur, toujours la même pour un ADN donné, ne dépend que de la séquence primaire de cet ADN. Les cellules protègent leur propre ADN de l’hydrolyse par les enzymes de restriction en méthylant l’ADN bactérien aux sites que ces enzymes reconnaissent. Cela se fait via une méthylase, codée par le gène de méthylation, cette modification des nucléotides de l’ADN bactérien (sur une adénine ou une cytosine) a pour but qu’ils ne soient plus reconnus par l’enzyme de restriction. L’ensemble du gène de restriction et du gène de méthylation constitue un système de défense de la bactérie vis-à-vis des phages. En effet, un ADN étranger n’est pas méthylé aux mêmes sites et le plus souvent, il est clivé par les enzymes de restriction de l’hôte qu’il a envahi. Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases, c’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiesters entre deux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique. Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’). 2  2. Les sites de restriction Les enzymes de restriction sont spécifiques. Chacune d’entre elles reconnaît spécifiquement une séquence de 4 à 10 nucléotides et coupe à l’intérieur de cette séquence, appelée site de restriction. Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement des séquences dites palindromiques. Ce sont des séquences où la succession des nucléotides lue dans le sens 5’→3’ (gauche-droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens 5’→3’). Ces séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4 ou 6 paires de bases. 3. Nomenclature des enzymes de restriction : Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur nomenclature est inspirée de la bactérie à partir de laquelle elles sont isolées. Leur nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4). La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite en majuscule, elle correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme. La seconde lettre et la troisième lettre (en minuscules) correspondent à l’espèce de la bactérie d’où l’enzyme est extraite. On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule correspondant à la souche bactérienne. 3  Pour terminer, un chiffre romain indique l’ordre de caractérisation de ces enzymes (ordre de découverte). 4. Types d’enzymes de restriction  Les enzymes de type I : ces enzymes coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance mais 1000 à 5000 paires de bases plus loin.  Les enzymes de type II : coupe l'ADN au niveau de la séquence reconnue (site palindromique) et sont les plus utilisées dans la manipulation de l’ADN (cartographie, clonage…etc.).  Les enzymes de type III : présentent également un site de reconnaissance mais coupent une vingtaine de nucléotides plus loin. 5. Types de coupure réalisées  Coupure à bouts francs : Certaines enzymes de restriction coupent l’ADN au milieu de la séquence palindromique, ce qui produit des extrémités dites non cohésives (franches). Par conséquent, il ne peut donc pas y avoir d'association spontanée entre les fragments résultant de la coupure.  Coupure à bouts collants (à extrémités adhésives) : correspond à une coupure qui se fait de part et d’autre du centre de symétrie. Après une coupure de ce type les parties simple-brin complémentaires peuvent s'apparier, ce qui génère des extrémités dites cohésives. 4 Par exemple, l’enzyme de restriction EcoRI reconnaît spécifiquement une séquence GAATTC et coupe l’ADN entre G et A. Ceci produit des fragments dans lesquels les extrémités 5’ portent un prolongement monocaténaire, il s’agit d’extrémités cohésives en 5’. Tableau : Caractéristiques de quelques enzymes de restriction. 6. Système de méthylation de l’ADN bactérien L’ADN bactérien présente des sites de restriction susceptibles d’être repérés par les enzymes de restriction que possède la bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de modification de l’ADN bactérien interviennent. Ces enzymes de modification sont des méthylases bactériennes (enzymes de méthylation). Leur nom est identique à celui de l'enzyme de restriction correspondante, précédé d'un M, à toutes les enzymes de restriction ne correspond pas une méthylase homologue. 5 La méthylation de la cytosine (sur le carbone 5) ou de l’adénine (sur l’azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à une inactivation de l’enzyme de restriction correspondante. Cette méthylation peut se réaliser sur une base ou sur plusieurs bases appartenant au site de restriction. Les méthylases bactériennes sont très spécifiques. 7. Isoschizomères et enzymes compatibles Les isoschizomères sont des enzymes de restriction qui proviennent de sources bactériennes différentes (qui portent donc des noms différents). Ils ont des constantes physiques différentes, mais ils coupent l’ADN au niveau d’un même site de restriction. 6 Exemple, MboI et Sau3A reconnaissent la même séquence de quatre nucléotides 5’-GATC-3’. La séquence est clivée sur les deux brins à la même position, du coté 5’ de G. BamHI n’est pas un isoschizomère de Sau3A, mais il reconnaît la séquence hexanucléotidique GGATCC. IL clive entre les deux G, produisant des extrémités 5’ cohésives qui peuvent s’apparier avec les fragments produits par Sau3A. On dit que BamHI et Sau3A sont des enzymes compatibles car, bien que ne reconnaissant pas le même site de restriction, elles génèrent des fragments à extrémités cohésives complémentaire 7