Lab 4_FL I-C-dot detect Hg2+_67-edit.pdf

04201332 Laboratory in Instrumental Analysis ปฏิบัติการที่ 4 Fluorescence spectroscopy I การวิเคราะห์ปริมาณ Hg2+ โดยอาศัยการลดลงของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ ของคาร์บอนควอนตัมดอทในน...

04201332 Laboratory in Instrumental Analysis ปฏิบัติการที่ 4 Fluorescence spectroscopy I การวิเคราะห์ปริมาณ Hg2+ โดยอาศัยการลดลงของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ ของคาร์บอนควอนตัมดอทในน้า วัตถุประสงค์ 1. เพื่อศึกษาหาความยาวคลื่นในการกระตุ้น (ex) และการคายแสงฟลูออเรสเซนต์ (em) ของคาร์บอน ควอนตัมดอท 2. ประยุกต์คาร์บอนควอนตัมดอทเป็นฟลูออเรสเซนส์เซนเซอร์ในการตรวจวัดปริมาณ Hg2+ ในน้า บทน้า ฟลูออเรสเซนต์สเปกโตรสโคปี (Fluorescence spectroscopy) เป็นเทคนิคที่ใช้วิเคราะห์คุณสมบัติ ของสารโดยการอาศัยการดูดกลืนรังสียูวีที่ส่งผลให้โมเลกุลถูกกระตุ้นและมีการสั่นภายในโมเลกุลจากระดับขัน พลังงานสถานะพืน (ground state) ไปสู่ระดับขันพลังงานที่สูงขึน (excited state) เรียกว่า การดูดพลังงาน (excite energy) โมเลกุล ที่มีการเคลื่อนที่ไปอยู่ในระดับของชันพลังงานที่สู งจะไม่มีความเสถียร จึงมีการ ปลดปล่อยพลังงานและตกลงมาในชันระดับพลังงานที่ต่้ากว่า พลังงานที่โมเลกุลปลดปล่ อยจากระดั บชัน พลังงานกระตุ้นชันที่หนึ่งสู่ระดับชันพลังงานสถานะพืนที่จะท้าให้เกิดการคายโฟตอน (emission of photon) ท้าให้เกิดสเปกตรัมในช่วงฟลูออเรสเซนต์ ณ ค่าพลังงานที่กระตุ้นที่จ้าเพาะของสารแต่ละชนิด ข้อดีของเทคนิคนีคือให้ขีดต่้าสุดในการวัด (detection limit) ดีกว่าเทคนิคยูวี-วิสิเบิลสเปกโทรโฟโต มิทรี และยังมีความจ้าเพาะเจาะจง (selectivity) ต่อโมเลกุลที่จะวิเคราะห์มากกว่าอีกด้วย อย่างไรก็ตาม ใน ด้านหลักการของเครื่องมือนัน เครื่องสเปกโทรฟลูออโรมิเตอร์ (spectrofluorometer) จะมีความซับซ้อน มากกว่าเครื่องยูวี-วิสิเบิล สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (UV-Vis spectrophotometer) โมเลกุลส่วนใหญ่สามารถวัด ด้วยเทคนิค UV-Vis spectrophotometry ได้ แต่บางโมเลกุลเท่านันที่จะแสดงสมบัติการเกิดฟลูออเรสเซนต์ ดังนันเทคนิค fluorescence spectrometry จะเหมาะต่อการวิเคราะห์โมเลกุลบางประเภทเท่านัน แต่จะมี ความจ้าเพาะต่อโมเลกุลที่วิเคราะห์มาก เพราะเทคนิคนีต้องมีการเลือกทัง ความยาวคลื่นในการกระตุ้น (ex) อิเล็กตรอน และความยาวคลื่น ในการคายแสงฟลูออเรสเซนต์ (em) ของแต่ละโมเลกุลให้เหมาะสม ดังนัน โมเลกุลอื่นที่ถูกเร้าและเกิดฟลูออเรสเซนต์ที่คนละความยาวคลื่นก็จะไม่รบกวน องค์ประกอบภายในเครื่องสเปกโทรฟลูออโรมิเตอร์ แสดงดังรูปที่ 1 รูปที่ 1 ส่วนประกอบของเครื่อง Spectrofluorometer 12 04201332 Laboratory in Instrumental Analysis 1. แหล่งก้าเนิดแสง (light source) แหล่งก้าเนิดแสงภายในเครื่องสเปกโทรฟลูออโรมิเตอร์จะต้องมีความเข้มแสงสูงเนื่องจากความเข้ม ของแสงมีผลต่อการกระตุ้นจ้านวนโมเลกุลให้ขึนไปที่สภาวะเร้าในปัจจุบันแหล่งก้าเนิดแสงที่นิยมใช้ในเครื่อง สเปกโทรฟลูออโรมิเตอร์จะเป็นเลเซอร์ซึ่งสามารถให้ความยาวคลื่นแสงได้ตังแต่ 300-600 nm 2. ส่วนแยกความยาวคลื่น (excitation and emission monochromator) ส่วนแยกความยาวคลื่นที่ใช้ในการกระตุ้น (Excitation monochromator) มีหน้าที่เลือก ความยาว คลื่นที่เราต้องการใช้ส้าหรับการกระตุ้นโมเลกุลให้ขึนไปอยู่ในสภาวะเร้า ส่ ว นแยกความยาวคลื่ น แสงฟลู อ อเรสเซนต์ ที่ โ มเลกุ ล ของสารคายแสงออกมา (Emission monochromator) มีหน้าที่เลือกเฉพาะความยาวคลื่นแสงฟลูออเรสเซนต์ที่เราต้องการจะวัด 3. ภาชนะใส่สารละลาย (cell หรือ cuvette) เป็นคิวเวตที่ท้าจากควอตซ์และมีด้านใสทังสี่ด้าน เพื่อให้แสงกระตุ้นผ่านเข้ามาแล้ววัดแสงฟลู ออเรส เซนต์ที่ออกมาในแนวตังฉาก เนื่องจากแสงฟลูออเรสเซนต์ที่ออกมาที่มุม 90oC มีค่าสูงสุด 4. ตัวตรวจวัดหรือดีเทคเตอร์ (detector) แสงฟลูออเรสเซนต์ที่โมเลกุลของสารคายออกมาจะอยู่ในช่วงอัลตราไวโอเลตหรือช่วงแสงที่เห็นได้อยู่ แล้วดังนันตัวตรวจวัดจึงใช้แบบเดียวกับในเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ได้เลยแต่แสงฟลูออเรสเซนต์จะมีความ เข้มต่้ามาก ดังนันจ้าเป็นต้องมีตัวขยายสัญญาณ (Amplifier) จ้านวนมาก 5. ตัวบันทึกสัญญาณ (recorder) ท้าหน้าที่แปรผลสัญญาณอิเล็กทรอนิกส์ให้ออกมาอยู่ในรูปตัวเลขหรือดิจิทัล ลักษณะทั่วไปของคาร์บอนควอนตัมดอท คาร์บอนควอนตัมดอท เป็นอนุภาคนาโนที่มีรูปร่างค่อนข้างเป็นทรงกลมโดยโครงสร้างภายในแกนกลาง อาจมีรูปร่างเป็น ได้ตังแต่อะมอร์ ฟัส ไปจนถึงผลึ กของ graphitic หรือ turbostratic carbon (sp2 carbon) หรือแกรฟีนและแผ่นแกรฟีนออกไซด์หลอมโดยมีโครงสร้างคล้ายเพชรจากการไฮบริไดเซชันแบบ sp3 ของ คาร์บอนดังรูปที่ 2 จากรูปจะเห็นได้ว่าพืนผิวของคาร์บอนดอทจะมีหมู่คาร์บอกซิลเป็นจ้านวนมาก ซึ่งทังนีก็ ขึนกับ วิธีการสั งเคราะห์ โดยปกติป ริ มาณออกซิเจนในคาร์บอนดอทจะมีอยู่ในช่ว ง 5-50% (โดยน้าหนัก) นอกจากนียังพบว่าในโครงสร้างของคาร์บอนดอทมีหมู่คาร์บอกซิล จ้านวนมากซึ่งหมู่นีเป็นส่วนส้าคัญที่ท้าให้ คาร์บอนดอทละลายน้าได้และสามารถที่จะปรับแต่งพืนผิวของคาร์บอนดอทให้มีหมู่ฟังก์ชันที่หลากหลายได้ และขณะเดียวกันก็สามารถที่จะปรับพืนผิวคาร์บอนดอทให้มีหมู่อื่นได้ เช่น สารอินทรีย์ โพลิเมอร์ สารอนินท รีย์หรือวัสดุชีวภาพ ซึ่งการปรับพืนผิวด้วยโมเลกุลต่างๆ เหล่านีสามารถท้าให้ประสิทธิภาพในการคายแสง ฟลูออเรสเซนส์เพิ่มขึน รูปที่ 2 โครงสร้างของคาร์บอนควอนตัมดอท 13 04201332 Laboratory in Instrumental Analysis คุณสมบัติเชิงแสงฟลูออเรสเซนส์ของคาร์บอนคอนตัมดอท ปัจจุบันคาร์บอนดอทได้รับความสนใจเนื่องจากเป็น อนุภาคนาโนที่มีคุณสมบัติการวาวแสง ท้า ให้มี การศึกษาสมบัติเชิงแสงเพื่อใช้ในการอธิบายกลไกการวาวแสงที่เกิดขึนของคาร์บอนดอท ในปี ค.ศ. 2015 Zhu และคณะ ได้อธิบายไว้ว่าการวาวแสงของคาร์บอนดอทนันเกิดจาก กลไก 4 แบบ ดังนี 1. ปรากฏการณ์ควอนตัมคอนไฟน์เมนต์ (the quantum confinement) เป็นปรากฏการณ์ที่การวาว แสงถูกก้าหนดโดยขนาดของคาร์บอนดอท เมื่อขนาด อนุภาคยิ่งเล็กลง แบนด์แก็พ (band gap) จะยิ่งขยาย กว้าง มากขึน ท้าให้ส่งผลต่อความยาวคลื่นการกระตุ้นและการ วาวแสงของคาร์บอนดอต 2. ปรากฏการณ์สถานะบนพืนผิว (the surface state) เป็นปรากฏการณ์ที่การวาวแสงถูกก้าหนด โดยหมู่ฟังก์ชันหรือธาตุบนพืนผิวของคาร์บอนดอท เนื่องจากหมู่ฟังก์ชันจะส่งผลให้การวาวแสงเปลี่ยนไป ท้า ให้สามารถควบคุมคุณสมบัติของคาร์บอนดอตด้วยการดัดแปลงพืนผิวอนุภาคได้ 3. ปรากฏการณ์สถานะโมเลกุล (the molecule state) เป็นปรากฏการณ์ที่การวาวแสงถูกก้าหนด โดย โมเลกุลทีเ่ ชื่อมต่ออยู่บนพืนผิวหรือภายในคาร์บอนดอท เนื่องจากมีการอธิบายไว้ว่าเพียงแค่หมู่ฟังก์ชันบน พืนผิวไม่น่าจะมีการวาวแสงที่เข้มและเป็นเอกลักษณ์ได้อย่างเพียงพอ 4. ปรากฏการณ์จากการคายพลังงานเมื่อเกิดการเชื่อมขวาง (the crosslink-enhanced emission; CEE) เป็ น ปรากฏการณ์ที่การวาวแสงถูกก้าหนดโดยการเชื่อมกันของพอลิ เมอร์ที่ใช้เป็นสารตังต้นในการ สั ง เคราะห์ ค าร์ บ อนดอท ซึ่ ง ส่ ว นใหญ่ จ ะพบในคาร์ บ อนดอทประเภทพอลิ เ มอร์ ด อท เช่ น PEI (Polyethylenimine) โดยลักษณะสเปกตรัมการคายแสงที่ได้ของคาร์บอนดอทแสดงดังรูปที่ 3 รูปที่ 3 แสดงสเปกตรัมการดูดกลืนแสง () และสเปกตรัมการกระตุ้นแสง () และการคายแสง ฟลูออเรสเซนส์ () ของคาร์บอนดอท และมุมขวา รูปถ่ายของคาร์บอนดอทภายใต้แสงยูวี ในการทดลองนี จึงได้ท้าการศึกษาสมบัติการคายแสงฟลูออเรสเซนส์ของคาร์บอนควอนตัมดอท และ ประยุกต์ใช้คาร์บอนควอนตัมดอทเป็นฟลูออเรสเซนเซอร์ในการตรวจวัด Hg2+ ในน้า โดยเมื่อท้าการเติม Hg2+ ลงไปในสารละลายคาร์บอนควอนตัมดอท จะท้าให้ความเข้มแสงฟลูออเรสเซนส์ลดลง ความเข้มแสงฟลูออเรส เซนส์ที่ลดลงจะแปรผันกับความเข้มข้นของ Hg2+ ดังแสดงในรูปที่ 4 14 04201332 Laboratory in Instrumental Analysis Hg2+ Concentration of Hg2+ (mM) รูปที่ 4 แสดงความเข้มแสงฟลูออเรสเซนส์ที่ลดลงจะแปรผันตรงกับความเข้มข้นของ Hg2+ สร้างกราฟมาตรฐานระหว่าง F (แกน y) กับความเข้มข้นของ quencher [Hg2+] (แกน x) เมื่อวัด สัญญาณการคายแสงฟลู ออเรสเซนส์ ของคาร์บอนควอนตัมดอท ที่มีตัวอย่าง Hg2+ น้าไปเทียบกับสมการ เส้นตรงแล้วน้าไปค้านวณหาความเข้มข้นของ Hg2+ ในตัวอย่างได้ สารเคมีและอุปกรณ์ 1. สารละลายคาร์บอนดอท (สังเคราะห์ไว้แล้ว) 2. HgCl2 (MW 271.496 g/mol) 3. ขวดวัดปริมาตรขนาด 10 mL จ้านวน 20 ใบ 4. ขวดฉีดน้ากลั่น จ้านวน 1 ขวด 5. บีกเกอร์ขนาด 250 mL จ้านวน 3 ใบ 6. บีกเกอร์ขนาด 100 mL จ้านวน 2 ใบ 7. บีกเกอร์ขนาด 50 mL จ้านวน 2 ใบ 8. ขวด vial ขนาด 10 mL จ้านวน 3 ขวด 9. หลอดหยดสาร จ้านวน 2 อัน 10. ช้อนตักสาร จ้านวน 1 อัน 11. ไมโครปิเปต ขนาด 20-200 L จ้านวน 1 อัน 12. Tip ส้าหรับไมโครปิเปต ขนาด 20-200 L 13. น้า RO 14. เครื่อง Fluorescence spectrometer พร้อม cuvette วิธีทดลอง ตอนที่ 1 เตรียมสารละลาย stock Hg2+ 10 mM ในน้า RO ปริมาตร 10.00 mL ชั่ง HgCl2 0.xxxx g (นิสิตค้านวณเอง) ละลายด้วยน้า RO แล้วปรับปริมาตรเป็น 10.00 mL ถ่ายเท ใส่ในขวด vial และติดฉลากให้เรียบร้อย 15 04201332 Laboratory in Instrumental Analysis ตอนที่ 2 เตรียมสารละลาย working Hg2+ 1.0 mM ในน้า RO ปริมาตร 10.00 mL ปิ เ ปต Hg2+ 10 mM มา xx mL ใส่ ใ นขวดวั ด ปริ ม าตรขนาด 10.00 mL เจื อ จางให้ ถึ ง ขี ด บอก ปริมาตรด้วยน้า RO ถ่ายเทใส่ขวด vial และติดฉลากให้เรียบร้อย ตอนที่ 3 เตรียมสารละลายเพื่อสร้างกราฟมาตรฐานของการวิเคราะห์ Hg2+ ปิ เปตสารละลายคาร์ บ อนดอท มา 250 L ใส่ ล งในขวดวัดปริมาตรขนาด 10.00 mL จ้านวน 8 ใบ จากนันท้าการปิเปตสารละลาย 1 mM Hg2+ ลงไป 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 และ 800 L ตามล้าดับ ท้าการปรับปริมาตรให้ถึงขีดบอกปริมาตรด้วยน้า RO จากนันน้าไปวัดสเปกตรัมการคายแสงฟลูออเรสเซนส์ โดยท้าการกระตุ้นแสงที่ความยาวคลื่น 360 nm (ท้าการสแกนหาความยาวคลื่นในการกระตุ้นแสงอีกครัง) ใบที่ 1 2 3 4 5 6 7 8 คาร์บอนดอท (L) 250 250 250 250 250 250 250 250 2+ ปริมาตรสารละลาย 1 mM Hg (L) 0 50 100 200 300 400 500 800 ตอนที่ 4 เตรียมสารเพื่อวิเคราะห์ตัวอย่าง Hg2+ ปิ เปตสารละลายคาร์ บ อนดอท มา 250 L ใส่ ล งในขวดวัดปริมาตรขนาด 10.00 mL จ้านวน 4 ใบ จากนันท้าการปิเปตสารละลายตัวอย่าง Hg2+ ลงไป 150 L ลงในขวดวัดปริมาตรใบที่ 2-4 ตามล้าดับ ท้าการ ปรับปริมาตรให้ถึงขีดบอกปริมาตรด้วยน้า RO จากนันน้าไปวัดสเปกตรัมการคายแสงฟลูออเรสเซนส์ ตอนที่ 5 วัดความเข้มแสงฟลูออเรสเซนส์ของสารละลายคาร์บอนดอทที่ไม่มีและมี Hg2+ 5.1 ศึกษาหาความยาวคลื่นที่ใช้ในการกระตุ้น (ex) และความยาวคลื่นที่ใช้ในการคายแสง (em) ที่ เหมาะสมของคาร์บอนดอท โดยเปิดช่อง slit width excitation และ emission เป็น 5/5 nm 5.2 ศึกษาผลของ Hg2+ ต่อความเข้มแสงฟลูออเรสเซนส์ของคาร์บอนดอท โดยใช้สารละลายที่เตรียมได้ ในตอนที่ 3 แล้วน้าข้อมูลความเข้มแสงกับความเข้มเข้นของ Hg2+ ไปสร้างกราฟมาตรฐานระหว่าง ความเข้ม แสงฟลูออเรสเซนส์ที่ความยาวคลื่นในการคายแสงสูงสุด (em) (แกน y) กับความเข้มข้น Hg2+ ในหน่วย nM (แกน x) 5.3 วัดความเข้มแสงฟลูออเรสเซนส์ของสารละลายตัวอย่าง และค้านวณหาความเข้มข้นของ Hg2+ ใน ตัวอย่าง การรายงาน 1. ค้านวณความเข้มข้นจริงของสารละลาย Hg2+ ที่เตรียมได้ในตอนที่ 1 และ 2 2. พล็อตสเปกตรัมการกระตุ้นแสง และการคายแสงของสารละลายคาร์บอนดอท 3. พล็อตสเปกตรัมการคายแสงของคาร์บอนดอทในสภาวะที่มี Hg2+ ความเข้มข้นแตกต่างกัน 4. พล๊อตกราฟมาตรฐานของ Hg2+ (ใช้ความเข้มข้นจริงที่เตรียมได้) โดยท้าการพล็อตกราฟระหว่าง F (แกน y) กับ [Hg2+] (nM) (แกน x) 5. ค้านวณหาความเข้มข้นของ Hg2+ ในตัวอย่าง หาค่าเฉลี่ย และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของปริมาณ Hg2+ ในตัวอย่างที่วิเคราะห์ได้ 16