Labo 1 Microscopie et introduction à l'héritabilité des cheveux - Instructions du Labo 1

Labo 1 Microscopie et introduction à l’héritabilité de l’épaisseur et la texture des cheveux Ce premier laboratoire examine la calibration et l’utilisation d’un microscope composé. Il est important de maîtriser les techniques de base en microscopie car nous utiliserons le microscope dans chacun des...

Labo 1 Microscopie et introduction à l’héritabilité de l’épaisseur et la texture des cheveux Ce premier laboratoire examine la calibration et l’utilisation d’un microscope composé. Il est important de maîtriser les techniques de base en microscopie car nous utiliserons le microscope dans chacun des cinq laboratoires prévus ce semestre. Les exercices pratiques du présent laboratoire impliquent des observations mettant en évidence la variabilité des caractéristiques des cheveux humains et l'implication probable des gènes sur la variabilité de ces traits. L’héritabilité de divers traits humains, y compris le diamètre des cheveux, sera étudiée plus en profondeur dans le laboratoire 2. RÉSULTATS D’APPRENTISSAGE ATTENDUS Théorie Identifier et comprendre le fonctionnement de chacune des parties d’un microscope composé Expliquer la procédure pas à pas pour la calibration d’un microscope composé (les deux séquences 1-2-3) Définir et distinguer les concepts de précision et d’exactitude, et l’écart-type, l’erreur type de la moyenne et le coefficient de variation Expertise pratique et analyse de données Calibrer et utiliser un microscope composé Mesurer (1) le diamètre et (2) l’épaisseur des écailles cuticulaires de cheveux humains Entrer des données, générer des graphiques et attribuer des formules prédéfinies dans Excel Estimer la précision et l’exactitude de procédures de mesurage en microscopie Enregistrer et analyser des images de microscopie avec Infinity Analyze Calculer l’écart type, l’erreur type de la moyenne et le coefficient de variation Évaluer l’impact de facteurs démographiques (genres, ethnies et groupes d’âge) sur le diamètre et l’épaisseur des écailles cuticulaires de cheveux humains PROCÉDURES PARTIE 1 – Calibration et utilisation d’un microscope composé Les microscopes de dissection et composé disponibles dans les laboratoires d’enseignement sont équipés de lentilles de qualité supérieure (objectifs et oculaires). Le microscope ne peut cependant générer des images de bonne qualité que s’il est utilisé adéquatement : « Correct … adjustments are critical for the microscope to exhibit its full performance. » (Manuel d’instructions pour le microscope CX41 Olympus). Cette partie explique la procédure de calibration pour obtenir des images de bonne qualité. Pièces du microscope CX41 Olympus L’utilisation de la terminologie correcte pour décrire les parties du microscope est essentielle pour bien comprendre les procédures de calibration et de fonctionnement décrites plus loin. Figure 1 Pièces du microscope CX41 Olympus. (Manuel d’instructions pour le microscope CX41 Olympus) Calibration du microscope CX41 Olympus La calibration du microscope composé est résumée par l’astuce mnémonique de deux séquences 1-23. En laboratoire, il est suggéré de regarder les vidéos ci-dessous pour vous guider dans la calibration de votre microscope. Vous pouvez également accéder à ce didacticiel interactif récapitulant les étapes de la calibration. Vue d’ensemble du microscope et première séquence 1-2-3 (lien) Deuxième séquence 1-2-3 (réglage de la hauteur, de l’alignement et de l’ouverture du condenseur (lien) Changement d’objectif (lien) Quelques erreurs à éviter et astuces pour atténuation l’arrière-plan des images (lien) Étapes de la calibration : Première séquence 1-2-3 : mise au point du spécimen au grossissement le plus faible 1. Engagez l’objectif 4X. 2. Mettez une lame avec échantillon en place et, si besoin, utilisez la vis macrométrique pour faire une première mise au point grossière, puis ajustez la vis micrométrique pour peaufiner la mise au point. C’est le seul moment où la vis macrométrique nécessite un ajustement. 3. Ajuster l’intensité lumineuse comme décrit dans la deuxième séquence 1-2-3. Deuxième séquence 1-2-3 : régler la lumière passant à travers le condenseur 1. Réglez la hauteur du condenseur en fermant l’iris du diaphragme de champ jusqu’à ce qu’un polygone de lumière soit visible à l’écran. Utilisez le bouton de réglage de la hauteur du condenseur pour mettre au point les bords du polygone visible à l’écran (les bords du polygone doivent être aussi nets que possible). 2. Orientez les deux vis d’alignement vers vous afin qu’elles puissent être facilement accessibles. Utilisez les deux vis pour centrer le polygone visible à l’écran. Le centrage sera plus facile si vous agrandissez d’abord le polygone afin qu’il couvre presque complètement le champ de vision. 3. Ajustez l’intensité de la lumière transmis par le condenseur. Ouvrez d’abord l’iris du diaphragme de champ à son ouverture minimale pour que le polygone lumineux couvre entièrement le champ de vision tel qu’il apparait sur l’écran d’ordinateur. Ensuite, réglez l’ouverture du condenseur à la valeur indiquée sur l’objectif en place (Figure 2). Il y a deux étapes à compléter suite à la mise en place d’un objectif de grossissement plus élevé. Tout d’abord, utilisez uniquement le bouton de mise au point micrométrique pour optimiser la mise au point du spécimen, puis ajustez l’ouverture du condenseur selon la valeur indiquée sur l’objectif engagé (Figure 2). Une erreur courante avant d'engager un objectif différent consiste à utiliser la vis macroscopique de mise au point pour abaisser la platine afin de ne pas endommager l'objectif ou casser la lame et lamelle en place, mais cette pratique est inappropriée. Si l'on utilise la vis macroscopique pour abaisser la platine, il peut être difficile de réajuster la mise au point à un grossissement plus élevé, particulièrement pour des échantillons avec faible contraste tels que les chromosomes que vous observerez au laboratoire 5. Le modèle de microscope à votre disposition dans les labos d’enseignement est un microscope de haute qualité doté d'un nez rotatif robuste et précis qui prévient tout contact direct entre la lamelle et l'objectif en autant que l'échantillon était bien au point avant le changement d’objectif. Une personne qui utilise correctement le microscope ne devrait pratiquement jamais avoir à régler la vis macroscopique, et ce, même lors du transport du microscope dans son armoire de rangement. Figure 2 Les trois objectifs utilisés avec le microscope composé disponibles dans les laboratoires d’enseignement. La valeur d’ouverture du condenseur recommandée est encerclée en rouge sur chaque objectif. PARTIE 2 - Utilisation de Lumenera Analyze Lumenera Analyze est une application pour la capture et le traitement d’images. Dans cette partie, nous explorerons comment calibrer Lumenera Analyze pour mesurer avec précision les distances et les zones sur des images de microscopie. Pour mesurer avec précision les distances sur des images, on peut utiliser un oculaire gradué avec des divisions micrométriques, mais les microscopes que nous avons dans les laboratoires d’enseignement ne sont pas équipés d’un tel oculaire (Figure 3). Nous utiliserons plutôt la largeur connue du champ de vision comme référence pour la procédure de calibration. Figure 3 Étapes du processus d'installation d'un micromètre oculaire. Nous devrions suivre ce processus si des micromètres oculaires étaient disponibles au laboratoire d’enseignement, mais ce n'est pas le cas. Dans ce laboratoire, nous référerons à la largeur connue du champ de pour calibrer Lumenera Analyze et procéder à des mesures de distance et de surface. Cette figure fut obtenue de http://www.mecanusa.com/microscope/micrometer/Calibration.htm. Calibration 1. Prenez un cheveu et transférez-le sur une lame de microscope, puis ajoutez une goutte d’eau et une lamelle. 2. Insérez l’objectif 4X en place pour un grossissement total de 40X (objectif 4X x 10X pour l’oculaire). 3. Mettez votre lame avec le cheveu sur la platine du microscope et ajustez la luminosité et la mise au point. 4. Cliquez sur l’icône Applications Launcher de l’ordinateur, puis accédez à Lumenera Analyze. 5. Verifiez que l’option Preview Captured Image est sélectionnée dans le panneau Capture Options Panel. 6. Capturez l’image. 7. Sélectionnez Calibrate dans le menu déroulant Mesure (Figure 4a), puis faites un clic avec le bouton gauche de la souris sur une position de référence à l’extrême gauche du champ de vision de la caméra. Faites glisser le curseur au travers le champ de vision complet jusqu’à une position de référence à l’extrême droite de l’image, puis cliquez à nouveau sur le bouton gauche de la souris pour terminer l’opération. Le panneau de Micrometer Calibration devrait s’afficher automatiquement (Figure 4b). Figure 4 Capture d’écran de Lumenera Analyze. (a) Image du menu déroulant Mesurer. (b) Image de la boîte de dialogue Calibration du micromètre. 8. Entrez la longueur que vous venez de délimiter et la valeur numérique du grossissement. La largeur du champ de vision complet pour l’objectif 4X (grossissement total 40X) est de 1 800 um. 9. Spécifiez l’abréviation des unités des mesures linéaire et carrée. Pour les besoins de ce laboratoire, l’unité de mesure est le micron (1 um = 10-6 m). 10. Entrez le nombre de microns dans l’une de vos unités de mesure (si vous utilisez des microns, entrez 1). 11. Appuyez sur OK pour terminer la calibration. 12. Vérifiez la précision de votre calibration en mesurant la largeur du champ de vision apparaissant à l’écran, ce qui devrait indiquer une valeur proche de 1 800 um comme indiqué dans la figure 5. La mesure de la largeur totale de champ de vision corrobore non seulement le fait que Lumenera Analyze ait été calibré avec succès, mais elle suggère également que les valeurs de distance mesurées dans une image seront exactes. La pleine largeur d’une image correspondant au champ de vision est généralement appelée la barre d’échelle. Cette dernière est utile car elle fournit une indication visuelle de la taille relative des éléments affichés. Pour les fins du laboratoire BIO2533, vous devrez insérer systématiquement une barre d’échelle sur chacune de vos images de microscopie. Notez que le champ de vision varie avec le grossissement. Pour le microscope composé, le champ de vision est 1800 um à 40X, 720 um à 100X, et 180 um à 400X. Figure 5 Cheveu humain à 40X. La valeur de pleine largeur indiquée, 1799.83um, est très proche du champ de vision de référence (1800um) qui avait été utilisé pour la calibration de Lumenera Analyze. Image de G. Guillet. 13. La police de texte par défaut et l’épaisseur de ligne pour les mesures sont trop petites. Cela est un problème, surtout que vous devrez réduire vos images afin de les insérer dans les documents que vous aurez à soumettre en équipe. Accédez à Annotate/Properties et ajustez l’épaisseur des lignes de mesure à 3, et la police de texte de mesure à 48 (Figure 6). Figure 6 Capture d'écran montrant le format recommandé pour l'épaisseur des lignes et la police et la taille du texte pour les mesures dans Lumenera Analyze. 14. Le nombre de décimales après la virgule par défaut dans Lumenera Analyze est de deux, mais cette valeur doit être ajustée pour être compatible avec la précision des mesures réalisées. Les mesures de distance peuvent fluctuer de quelques microns, de sorte que le nombre de décimales après la virgule doit être mis à zéro, et cela peut être fait via les options Measure / Options / Number of Decimal Places (Figure 7). Figure 7 Capture d'écran montrant l’ajustement du nombre de décimales après la virgule dans Lumenera Analyze. Ajustement de la calibration La calibration a été enregistrée pour l’objectif 4X, mais elle doit être ajustée si vous sélectionnez un autre objectif. Pour régler le grossissement, choisissez Magnification & Units dans le menu Adjust et définissez le grossissement sur 100X ou 400X selon que vous utilisez l’objectif 10X ou 40X. La nouvelle calibration ajustée sera utilisée par défaut pour toutes les nouvelles images, mais vous devez d’abord sélectionner l’option All Open Images pour appliquer le nouvel ajustement à une image qui avait été précédemment enregistrée. Mesure d’une distance Sélectionnez Point-to-point dans le menu déroulant Measure, puis cliquez successivement aux deux extrémités d’un élément pour estimer sa distance dans l’unité sélectionnée, qui devrait être le micron. Mesurer une surface Sélectionnez Polygon dans le menu déroulant Measure, puis délimitez la périphérie de tout élément que vous souhaitez déterminer la surface. Prenez un de vos cheveux et transférez-le sur une lame de microscopie, puis ajoutez de l’eau et une lamelle. Capturez et sauvegardez une image avec chacun des objectifs 4X, 10X et 40X. Sur chacune de vos trois images, utilisez l’option Measure et Annotate pour afficher l’épaisseur ou la largeur mesurée de votre cheveu. Les trois valeurs sont-elles comparables? Ajustez le format et la taille de vos annotations pour optimiser leur lisibilité. Ajustez également les options de lumière pour avoir un fond net. Un fond clair et net nécessite d’abord le calibrage approprié du microscope et, subséquemment et si nécessaire, l’ajustement de la valeur Gain dans Infinity Analyze (ne jamais utilisez l’option White Balance pour éviter l’altération des couleurs véritables de votre spécimen). Pour enregistrer vos photos, vous pouvez utiliser les options d’enregistrement intégrées dans Lumenera Analyze, mais il est beaucoup plus simple d’utiliser l’outil Capture d’écran accessible en cliquant sur l’icône Windows 10 située en bas à gauche de l’écran de l’ordinateur. Lorsque vous utilisez Capture d’écran, sachez que le champ de vision de l’image est réduit si vous ne sélectionnez qu’une partie de l’image affichée. Référez-vous au document Consignes générales pour formater vos figures afin de bien répondre aux attentes signifiées. Assurez-vous que l'arrière-plan de chacune de vos images de microscopie soit claire, et que le texte et les valeurs numériques soient formattés tel que spécifié. Lumenera Analyze est une application quelque peu capricieuse et il vous faudra du temps pour vous familiariser avec les différentes options. Suivez à la lettre les consignes fournies afin de perdre inutilement des points. Au besoin, demandez de l'aide auprès de vos coéquipiers. PARTIE 3 – Héritabilité de l’épaisseur et de la texture des cheveux Épaisseur et texture des cheveux humains Différents gènes affectent la densité, la texture et la structure des cheveux. Dans cette partie, nous étudions la variation de deux traits des cheveux : le diamètre et l’épaisseur des écailles cuticulaires (Figure 8). Deux étapes préliminaires évalueront la précision et l’exactitude des mesures du diamètre d’un cheveu à l’aide d’Infinity Analyze. Figure 8 Anatomie du cheveu humain. Journal of Applied Cosmetology, 2015 Concepts statistiques pour l’analyse des données L’exactitude et la précision sont des concepts différents utilisés pour évaluer la qualité des mesures. L’exactitude fait référence à la proximité d’une mesure par rapport à la valeur réelle. Une balance qui est mal calibrée, par exemple, indiquera des valeurs de poids qui sont constamment inférieures ou supérieures à la valeur réelle. La précision fait référence à la proximité des mesures du même élément les unes par rapport aux autres. La précision d’une balance pourrait être estimée en mesurant à plusieurs reprises le poids du même objet, puis en évaluant l’écart entre ces valeurs. Quelqu’un qui lance à répétition des fléchettes au centre d’une cible pourrait être considéré comme étant exact et précis (Figure 9A). Figure 9 Cibles d’un jeu de fléchettes montrant différents scénarios d’exactitude et de précision. Une bonne exactitude est montrée en A et B, tandis qu’une faible exactitude correspond aux scénarios C et D. Une bonne précision est observée en A et C, tandis que B et D affichent une précision moindre. L’écart-type (SD pour Standard Deviation) et l’erreur type de la moyenne (SEM pour Standard Error of the Mean) sont deux concepts connexes pour estimer la dispersion des valeurs autour de la moyenne centrale. Pour une distribution normale symétrique, près des deux tiers de toutes les observations se retrouvent dans l’intervalle de la moyenne ± 1 SD ([moyenne1SD]