Cytologie - Année académique 2024-2025 - PDF

Cytologie Année académique 2024-2025 Objectifs Objectif général: L'apprentissage de la biologie cellulaire fait partie des enseignements qui visent à développer la compréhension du fonctionnement d'un organisme animal et des bases physiopathologiques des principales maladies. Objectifs spécif...

Cytologie Année académique 2024-2025 Objectifs Objectif général: L'apprentissage de la biologie cellulaire fait partie des enseignements qui visent à développer la compréhension du fonctionnement d'un organisme animal et des bases physiopathologiques des principales maladies. Objectifs spécifiques: Savoir identifier, reconnaître, définir, décrire, manipuler les éléments et concepts suivants de la biologie cellulaire animale: - concepts de base de quelques techniques d'analyse microscopique - organisation intracellulaire générale - biogenèse, composition, caractéristiques structurales et fonctionnelles des principales structures intracellulaires - mécanismes et acteurs du dynamisme intracellulaire (transport des protéines et déplacement des organites dans le cytoplasme) - composition, organisation et rôles du cytosquelette - bases intracellulaires et moléculaires de certaines pathologies des organites (exemples sélectionnés dans le cours) 2 Enseignement : Cours en auditoire Une séance de travaux dirigés en auditoire Supports de cours: - Diapositives et schémas - Syllabus - Livre de référence « Molecular Biology of the Cell », Bruce Alberts et al., W. W. Norton & Company Evaluation formative: Test de « novembre » (QCM sur webcampus). Evaluation finale/Examen: Examen écrit (QCM) 3 1- INTRODUCTION 4 La théorie cellulaire Schleiden et Schwann, 1833 Dans sa version moderne: 1. Tous les organismes sont constitués d’une ou plusieurs cellules 2. Les cellules sont les plus petites unités du vivant 3. Les cellules sont uniquement formées par division d’une cellule préexistante 5  Composition chimique d’une cellule Hydrogène, Oxygène, Azote, Carbone, Phosphore, Soufre 70-99% Sodium Na+ H Potassium K+ Calcium Ca2+ O H Magnésium Mg2+ Chlore Cl- Bicarbonate HCO3- Protéines Lipides Phosphate HPO42- Acides nucléiques Glucides (hydrates de carbone) Met Arg Val Val Lys Arg Gln Asp Lys ORGANIQUE INORGANIQUE 6  Cellule eucaryote Cellule procaryote Campbell 9th Edition, Pearson Editions 7 2- LES PRINCIPAUX OUTILS DE L'ETUDE DES CELLULES ET DES TISSUS 8 2.1 Les techniques de microscopie 9  Microscopie ELECTRONIQUE Microscopie OPTIQUE 10 Microscope optique à fond clair Zeiss Optical microscope 1 Source de lumière (lampe) 5 2 Condenseur 3 Echantillon à 4 1 observer 3 4 Objectif 2 Oculaire 5 Rudi Rottenfusser, Erin E. Wilson and Michael W. Davidson; http://zeiss- campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/opticaltrain.html 11  Principaux types de microscopes optiques 1-Microscope optique à fond clair 2-Microscope optique à fond sombre 3-Microscope à contraste de phase 4-Microscope à fluorescence 5-Microscope à polarisation 12  L’observation des cellules et tissus avec un microscope optique 13 Coupe histologique Cellules isolées Organe ou morceau d’organe (ou de tumeur) Fixateur Dissociation des cellules Fixation, par ex. dans du formaldéhyde ou paraformaldéhyde Organe ou morceau d’organe (ou de tumeur) Culture in vitro Enrobage dans une d’un type cellulaire matrice solide, par ex. la sélectionné paraffine (Micro. optique) Découpage pour préparer de fines couches de tissus, ensuite placées Placement des cellules sur un sur un support support et fixation (sauf si cellules vivantes requises). Augmentation des contrastes, coloration Augmentation des contrastes, et/ou marquage coloration et/ou marquage. Observation Principes généraux de microscopie Grossissement Contrastes Résolution 14 1) Grossissement 10x 4x 10x 10x 10x 40x 10x 100x 15 2) Contrastes Interférence destructive Interférence constructive Molecular Biology of the Cell, 6th Edition, Bruce Alberts 16 Lorsqu’une onde lumineuse traverse un échantillon biologique, celle-ci peut être déviée lorsqu’elle rencontre un « obstacle ». Suivant les propriétés physicochimiques de la structure (intra)cellulaire traversée, divers « patterns » de déviation de la lumière sont possibles. Diffraction La formation d’une image agrandie fidèle et complète de l’échantillon résulte des processus de diffraction et des interférences constructives et destructives de l’ensemble des rayons résultants. 17 Pour faciliter la visualisation de structures biologiques, une coloration ou un marquage de l’échantillon ou d’une molécule peut également être effectué. Coloration Coupe histologique de peau sans Coloration de type HES: Hemalun – Erythrosine - Safran marquage: peu de contrastes 18 Coloration HES : 19 Marquages : a) Histochimie ou cytochimie enzymatique : + Substrat de l’enzyme cible + Conditions optimales de la réaction (température, pH, force ionique) Produit de la réaction : ▪ soit coloré => observation par M. optique à fond clair ▪ soit fluorescent => observation par M. optique à fluorescence (comprenant des lasers qui excitent les fluorophores, et des détecteurs de fluorescence) ▪ soit dense aux électrons => observation par microscopie électronique (voir plus loin) 20 + Faible capacité de diffusion b) Immunomarquage (immunodétection): Fluorophore (si M. optique à fluorescence) ou particule dense aux électrons (si M. électronique) Anticorps secondaire Anticorps primaire Protéine cible Tissu ou cellules isolées 21 c) Immunocytochimie ou immunohistochimie : Substrat de l’enzyme cible + Conditions optimales de la réaction Enzyme Anticorps secondaire Produit coloré, fluorescent Anticorps ou dense aux électrons primaire + Faible capacité de diffusion Protéine cible Tissu ou cellules isolées 22 3) Limite de résolution 23 Limite de résolution (en distance) versus pouvoir de résolution 24  1 Limite de résolution: Distance minimale entre deux points permettant de les identifier comme distincts 2 3 1- (lamda) = longueur d’onde de la lumière utilisée (M.optique) nm Question: Le pouvoir de résolution est-il plus élevé dans un microscope optique qui utilise une lumière bleue pour illuminer l’échantillon, ou dans un microscope qui utilise une lumière rouge?  1 Limite de résolution: Distance minimale entre deux points permettant de les identifier comme distincts 2 3 Huile Air 2- Indice de réfraction du milieu dans lequel se trouve l’échantillon et qui sépare celui-ci de l’objectif Question: Le pouvoir de résolution d’un microscope optique augmente- t-il si une goutte d’huile est placée entre l’échantillon et l’objectif? Molecular Biology of the Cell, 6th Edition, Bruce Alberts 26  1 Limite de résolution: Distance minimale entre deux points permettant de les identifier comme distincts 2 3 θ (theta) = la moitié de la θ 3- longueur de l’angle qui θ est formé par le cône de lumière focalisé par le condenseur 27 Microscope électronique 28  Microscope optique à fond clair Microscope électronique à transmission Source de Source lumière (lampe) d’électrons LENTILLES ELECTROMAGNETIQUES Condenseur LENTILLES EN VERRE Echantillon à observer Objectif Lentilles de Oculaire projection Ecran de visualisation Nuances de gris (ne détecte pas les couleurs) 29  Microscope électronique Grossissement et pouvoir de résolution plus élevés (par rapport à un microscope optique) car la longueur d’onde d’un électron est plus courte que celle d’un photon. Contrastes : N.B. Le microscope électronique ne détecte pas les couleurs. Pour distinguer des structures: Après fixation, enrobage et découpe, l’échantillon cellulaire ou tissulaire est imprégné avec des sels de métaux lourds. Incuber avec du tétraoxyde d’Osmium, qui contribue à contraster les membranes Immunodétection de protéines lysosomales: Et/ou procéder à un marquage (voir dias précédentes). Cyto/histochimie enzymatique : le produit de la réaction doit être dense aux électrons Immunomarquage : anticorps primaire, puis anticorps secondaire couplé à une particule dense aux électrons (par exemple une bille d’or) 30 Les grandes catégories de microscopie électronique 1-Microscopie électronique à transmission Sans marquage spécifique d’un constituant Avec immuno-marquage: Lysosome Anticorps secondaire couplé à une bille d’or Avec histo- ou cytochimie enzymatique: Lysosomes 31 Cytochimie enzymatique: produit de la réaction dense aux électrons  2-Microscopie électronique à balayage Sans marquage spécifique d’un constituant Avec immuno-marquage 32 Quelques questions 1) Si deux peroxysomes distants de 50 nm font l’objet d’un immunomarquage permettant de les colorer en rouge, les deux peroxysomes marqués peuvent être visualisés comme distincts par i- un microscope optique à fond clair ii- un microscope électronique à transmission iii- par les 2 types de microscopes listés ci-dessus iv- par aucun des microscopes listés ci-dessus 2) Une cellule fixée avec du paraformaldéhyde est une cellule qui ne se divise plus. VRAI / FAUX 3) Un globule rouge mature ne peut pas être coloré avec de l’hémalun. VRAI/FAUX 4) Dans le sang se trouve deux catégories de globules blancs: les basophiles et les éosinophiles. Laquelle de ces deux catégories comprend des cellules très marquées par l’hémalun? 36 Basophile Eosinophile ADN et ribosomes Protéines agrégés cytoplasmiques 37