TD5: La Microscopie Electronique 2024 PDF

TD5: la microscopie électronique Vanessa DEHENNAUT Laboratoire : UMR CANTHER Cité scientifique Institut ONCOLILLE Bât SN4, porte 103 Campus CHRU 03 20 43 44 56...

TD5: la microscopie électronique Vanessa DEHENNAUT Laboratoire : UMR CANTHER Cité scientifique Institut ONCOLILLE Bât SN4, porte 103 Campus CHRU 03 20 43 44 56 [email protected] MOODLE : TD BC1 gp V.DEHENNAUT Clé d’inscription rapide : kzrcgk 1  Principe généraux de la ME Utilise électrons  longueur d’onde nettement inférieure à celle du photon (0,04 A) => Résolution: 0,1 nm Grossissement: 200-500 000 x canon à électrons : e- émis par filament de tungstène porté à haute température (cathode), focalisés en un rayon fin (cylindre de Wehnelt) puis accélérés par une anode (vi = 164 000km/s) Émis sous vide (pompe à vide) : empêche la déviation des électrons par collision avec des molécules d’air Canon à électrons 2  Principe généraux de la ME Utilise électrons  longueur d’onde nettement inférieure à celle du photon (0,04 A) => Résolution: 0,2 nm Grossissement: 200-500 000 x canon à électrons : e- émis par filament de tungstène porté à haute température (cathode), focalisés en un rayon fin (cylindre de Wehnelt) puis accélérés par une anode (vi = 164 000km/s) Émis sous vide (pompe à vide) : empêche la déviation des électrons par collision avec des molécules d’air Focalisés par une série de lentilles électromagnétiques Observation non directe (rétine humaine insensible aux électrons) : image sur un écran 3 Microscope électronique à transmission (MET) Microscope électronique à balayage (MEB) 4 Microscope électronique à transmission (MET) Les e- traversent l’échantillon e- déviés selon la forme et la nature chimique de l’échantillon e- transmis Image agrandie par objectif et projecteur(s) Image sur écran (projecteur) 5 Microscope électronique à transmission balayage (MEB) Les e- ne traversent pas l’échantillon Bombardent la surface qui doit être métallisée Génération d’e- secondaires Détecteur qui amplifie le signal Image sur écran (projecteur) Échantillon recouvert d’une fine couche métallique (or, 6 Pt)  Observations microscopiques de l’algue unicellulaire Chlamydomonas Visualisation de l’ultrastructure cellulaire (organites, molécules) MET MP Faisceau focalisé en 1 point de l’échantillon MEB Balayage du faisceau sur toute la surface de l’échantillon Cartographie de la zone balayée Image pseudo 3D (visualisation de la surface de l’échantillon, impression de relief) 7 Préparation de l’échantillon pour l’observation en MET Observation de cellules au sein d’un tissu 1) Fixation 2) déshydratation 3) Inclusion 4) Coupes 5) Coloration contrastes Nécessité de coupes ! 8  1) Fixation But : Conserver l’échantillon dans un état aussi voisin que possible de l’état vivant tout en le rendant imputrescible. GLUTARALDEHYDE MET Méthodes physiques: Congélation : propane liquide -196 °C TETRAOXYDE D’OSMIUM Méthodes chimiques: Fixateurs : glutaraldéhyde + tetraoxyde d’osmium Créer des pontages entre les protéines et les lipides insaturés (mbn plasmique)  stabilisation des structures 9  2) Déshydration But : Remplacer l’eau contenu dans l’échantillon par un solvant compatible avec le milieu utilisé pour l’inclusion MP MET Idem sauf que solvant = acétone 10  3) Inclusion But : Durcir l’échantillon et l’inclure dans un milieu solide afin de pouvoir ensuite le couper MP Inclusion dans résine liquide = paraffine => réalisation d’un bloc MET Inclusion dans résine synthétique (époxyde, méthacrylate) = transparente au e-, polymérisation lente (chaleur ou lumière UV) => réalisation d’un bloc 11  4) Coupes But : coupes du spécimen en sections suffisamment fines pour que les photons ou les électrons puissent les traverser MP MET Coupes semi-fines (1µM) Coupes fines : 3-10 µM et ultrafines (50-80nm) MICROTOME ULTRAMICROTOME 12  13 https://www.unige.ch/sciences/biologie/bioveg/crevecoeur/microscopes/met/ultramicrotome/  14 https://www.unige.ch/sciences/biologie/bioveg/crevecoeur/microscopes/met/ultramicrotome/  5) Contrastes But : Rendre visible certaines structures MP Coloration topographique, cytochimiques, utilisation de fluorochromes MET Pas de coloration mais utilisation de méthodes permettant d’augmenter le contraste  Contrastant: empêche le passage des e- (les réfractent)=> zones qui les fixent = opaques aux e-  utilisation de sels de métaux lourds  Atomes de masses élevées se lient aux structures cellulaires: protéines, lipides, acides nucléiques 15 Préparation des échantillons pour l’observation en MET « coloration » positive Imprégnation de sels de métaux lourds (Ur, Pb…) électronographie Coupe longitudinale intestin Cellule végétale 16 Préparation des échantillons pour l’observation en MET « coloration » négative Montage de l’échantillon dans un liquide dense aux e- (acide phosphotungstique) Les métaux lourds ne pénètrent pas dans l’échantillon Échantillon apparait brillant sur fond opaque Observation de petits élements (virus, bactéries, ADN…) ADN en cours de réplication Adénovirus bactéries 17 Préparation des échantillons pour l’observation en MET Ombrage métallique (directionnel) Vaporisation d’atomes métalliques avec un certain angle, dans une enceinte sous vide Accumulation localisée de métal sur les pourtours de l’échantillon => impression de relief Paroi primaire de la cellule végétale (fibres de cellulose) 18 19 20 21 22 23 24 25