Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) PDF

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC) I. Principe de la chromatographie La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d'un mélange même très complexe. Il existe trois principaux types de chromatographie : la chromatographie en phase gazeuse (CPG) la chromatographi...

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC) I. Principe de la chromatographie La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d'un mélange même très complexe. Il existe trois principaux types de chromatographie : la chromatographie en phase gazeuse (CPG) la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) la chromatographie en couche mince (CCM). Les deux premières méthodes peuvent être assez largement décrites par des théories communes. Dans les deux cas, un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire. A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne. Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne. De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés. Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic. Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté. 1  II. La chromatographie liquide haute performance Figure 1 : principe de fonctionnement de l’HPLC a) Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité suffisante. Plusieurs flacons d'éluants (solvants de polarités différentes) sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe doseuse. b) La pompe : elle est muni d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du solvant. Elle permet de travailler :  en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse.  en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange d'éluants. Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques µl à plusieurs ml/min c) Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes, nous utiliserons une boucle de 20µl. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative Figure 2 : les deux phases d’injection avec une boucle 2 d) La colonne : Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 crn. Au-delà, les importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide beaucoup trop élevées. Figure 3 : exemple d’une colonne HPLC e) La phase stationnaire  La phase normale : La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête. L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.  La phase inverse : La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H20). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante. f) La phase mobile : L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire normale ou à polarité inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés. La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe : - si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la chromatographie est dite en phase normale ; - si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire ( le plus souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en phase inverse. 3 En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention k des composés. Les silices greffées conduisent en général à une perte importante de polarité. Avec une phase greffée, l'ordre d'élution est opposé à celui auquel on est habitué avec la phase normale. Ainsi avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu'un composé apolaire. Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. On réalise des gradients d'élution en diminuant au cours de la séparation la polarité de l'éluant (ex : mélange eau /acétonitrile dont la concentration en acétonitrile va en croissant au cours de l'élution). On peut, en mélangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d'élution de la phase mobile. Figure 4 : pouvoir d’élution de la phase mobile en HPLC 4 f) Détecteurs * détecteur UV-visible (celui que nous utilisons) : il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. Il opère à longueur d'onde constante, celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deuterium est utilisée pour des longueurs d'ondes variant de 190- 350 nm et la lampe à vapeur de mercure est utilisée à la longueur d'onde non variable de 254 nm. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que :  le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à l'appareil, et que son coefficient d'absorption ε soit suffisamment grand ;  la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur. III) Application de la chromatographie à l'analyse Un chromatogramme est le graphique d'une fonction de la concentration de l'analyte en fonction du temps d'élution. Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté. Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics correspondant à chacun des produits. Un chromatogramme doit être parfaitement reproductible. 5 Le but de la plupart des séparations chromatographiques est de fournir une analyse de l'échantillon. Celle-ci est dite qualitative si elle permet de déterminer le nombre et la nature des composants de l'échantillon et quantitative si elle permet de déterminer la quantité d'un ou plusieurs des composants présents. 6  La courbe d’étalonnage est une droite qui passe par l’origine. Déduire la concentration CX de la solution à doser par extrapolation. 7  Chromatographe en phase gazeuze (CPG) 1. Introduction La chromatographie en phase gazeuse (CPG) (gas chromatography, GC, en anglais) est une technique de séparation d’un mélange de molécules volatiles, appelées ici « analytes ». Cette technique a été développée par A.J.P MARTIN et R.L.M. SYNGE, récipiendaires du Prix Nobel de chimie 1952 pour l’invention de la chromatographie de partage. Elle est utilisée dans des domaines très variés, tels que la parfumerie, l’œnologie, l’industrie pétrolière, la biologie, la chimie fine et l’industrie des matières plastiques. 2. Principe physico-chimique La CPG repose sur l’équilibre de partage des analytes entre une phase stationnaire et une phase mobile gazeuse. La séparation des analytes repose sur la différence d’affinité de ces composés pour la phase mobile et pour la phase stationnaire. Le mélange à analyser est vaporisé puis transporté à travers une colonne renfermant une substance liquide ou solide qui constitue la phase stationnaire. Le transport se fait à l'aide d'un gaz inerte, appelé « gaz vecteur », qui constitue la phase mobile. Le partage est un équilibre dynamique entre l’analyte A dans la phase stationnaire A(phase stationnaire) et le même analyte dans la phase mobile A(phase mobile) : A(phase stationnaire) ⇄ A(phase mobile) Le coefficient de partage K est la constante d’équilibre associée à cet équilibre. Plus la molécule a d’affinité pour la phase stationnaire, moins elle est entraînée par le gaz vecteur et donc plus elle est retenue sur la colonne. Ainsi, sur colonne polaire, les analytes apolaires sortent en premier, alors que sur colonne apolaire, les analytes polaires sortent en premier. Par ailleurs, plus la température est haute, plus on déplace l’équilibre de partage vers A(phase mobile), et donc plus l’analyte A est entraîné par le gaz vecteur. Si les analytes d’un échantillon ont des coefficients de partage différents, alors, tous les autres paramètres étant identiques (débit du gaz vecteur, température), leurs durées de parcours dans la colonne seront différentes. Ainsi, les analytes se séparent puis sortent de la colonne les uns après les autres. La durée entre la date d’injection et celle de sortie de colonne d’un analyte A est son « temps de rétention ». L’analyse conduit à l’obtention d’un chromatogramme, dont un exemple est donné ci- dessous Figure 1 : 1  Figure 1 - Chromatogramme d’un mélange d’alcanes Chaque analyte du mélange d’alcanes est caractérisé par un temps de rétention bien précis. Ici, la séparation des analytes du mélange a été effectuée de façon optimale. 3. Appareillage L’appareil utilisé pour réaliser une analyse par chromatographie en phase vapeur est appelé chromatographe. Il comporte plusieurs éléments, comme indiqué sur le schéma ci- dessous Figure 2 : 2  Figure 2 - Schéma d’un chromatographe 3.1. Le gaz vecteur (phase mobile) Le gaz vecteur est le gaz qui circule à l’intérieur du chromatographe, entraînant les analytes à travers la colonne, depuis l’injecteur jusqu’au détecteur. Son choix dépend du type de détecteur utilisé ; cela peut être par exemple de l’hélium, de l’azote, de l’argon ou de l’hydrogène. Le débit de ce gaz vecteur est de l’ordre de 30 à 40 mL/min pour les colonnes remplies et de 0,2 à 2 mL/min pour les colonnes capillaires (voir plus loin pour la description des deux types de colonne). 3.2. Le système d’injection Ce système (Figure 3) permet à la fois l’introduction de l’échantillon dans la colonne du chromatographe, ainsi que la volatilisation des analytes. La température de l’injecteur doit être réglée de manière à entraîner la vaporisation de tous les analytes de l’échantillon : elle est généralement maintenue à 50 °C au-dessus de la température d’ébullition de l’analyte le moins volatil. L’introduction se fait à l’aide d’une microseringue (le volume à injecter est généralement voisin de 1 µL) à travers un septum (qui assure l’étanchéité) dans un liner (typiquement un tube de verre rempli d’un petit morceau de coton). 3 Si l’échantillon contient des espèces non-volatiles, celles-ci sont retenues sur le coton et donc non-injectées dans la colonne, ce qui permet de la protéger. Les espèces volatiles sont vaporisées et entraînées par le gaz vecteur vers la tête de la colonne. 3.3. La colonne (phase stationnaire) Il existe deux types de colonnes : les colonnes remplies et les colonnes capillaires (Figure 4). Les colonnes remplies ont un diamètre de quelques millimètres et une longueur de l’ordre du mètre. Elles sont remplies de granules de support inerte, généralement de la silice, dont la surface est imprégnée ou greffée avec la phase stationnaire. Elles sont aujourd’hui supplantées par les colonnes capillaires, dont le pouvoir de résolution est bien supérieur. Les colonnes capillaires sont de simples tubes d’acier inoxydable, de verre ou de silice fondue (matériau inerte vis-à-vis de la phase stationnaire et des échantillons) de diamètre intérieur compris entre 0,1 et 0,5 mm, et d’une longueur typique de plusieurs dizaines de mètres, pouvant aller jusqu’à 100 m. Pour tenir dans l’appareil, la colonne est enroulée, avec des 4 spirales ayant 10 à 30 cm de diamètre. La surface interne de ce tube est recouverte d’un film de 0,1 à 5 µm d’épaisseur constitué de la phase stationnaire. Ce film est mis en place par greffage ou simple déposition, le greffage étant généralement préféré pour des raisons de stabilité thermique. Par exemple, la Carbowax® est une colonne capillaire comportant un film polaire de polyéthylène glycol greffé en surface, film qui constitue la phase stationnaire. La SE-30® est une colonne capillaire apolaire comportant un film de polydiméthylsiloxane qui constitue la phase stationnaire (Figure 5). Afin de maximiser l’influence de l’équilibre de partage, la colonne est choisie de telle sorte que le temps de rétention des analytes soit important. Une colonne capillaire de faible diamètre, longue, présentant une phase stationnaire épaisse et ayant des propriétés chimiques similaires aux molécules de l’échantillon permet typiquement d’obtenir de meilleures séparations. 3.4. Le four La colonne est contenue dans un four de type chaleur tournante, dont la température est précisément ajustable (typiquement entre 20 °C et 350 °C) et programmable. Les températures utilisables en pratique dépendent des domaines de stabilité en température de la colonne utilisée, et de ceux des composés analysés. Plus la température du four (et donc de la colonne) est élevée, plus les analytes se déplacent rapidement dans la colonne, mais moins ils interagissent avec la phase stationnaire, et donc moins les analytes sont séparés. Plus la température du four est basse, meilleure est la séparation des analytes mais plus longue est l’analyse. Le choix de la température est donc un compromis entre la durée de l’analyse et le niveau de séparation désiré. 5 Une méthode pour laquelle la température est gardée constante tout au long de l’analyse est appelée « isotherme ». A l’inverse, on peut choisir d’augmenter la température du four au cours de l’analyse : cette méthode est appelée « gradient ». D’une manière générale, une méthode isotherme tend à donner des pics larges pour les espèces les plus retenues, et donc une moins bonne séparation (Figure 6). Ce phénomène est partiellement dû à la diffusion : plus une espèce chimique circule longuement dans la colonne, plus elle a le temps de diffuser, élargissant ainsi le pic, et donc diminuant la hauteur des pics par la même occasion. Figure 6 - Chromatogrammes d’un même échantillon réalisés dans différentes conditions : (a) avec une méthode isotherme à 45 °C ; (b) avec une méthode isotherme à 145 °C ; (c) avec une méthode utilisant un gradient de température de 30 °C à 180 °C sur 30 minutes. 6 3.5. Le détecteur (FID) Le FID (en anglais flame ionisation detector, en français détecteur à ionisation de flamme), est le détecteur le plus utilisé. La sortie de colonne traverse une flamme maintenue à une tension d’une centaine de volts. La pyrolyse ionise les composants, provoquant l’apparition d’un courant électrique entre les électrodes, ensuite amplifié. Typiquement utilisé avec les gaz vecteurs azote, hélium et hydrogène. 4. En pratique Mode opératoire pour réaliser une analyse CPG :  Vérifier qu’une colonne (ou plusieurs) est/sont déjà en place dans le chromatographe.  Programmer le four. Si des conditions expérimentales adéquates sont déjà connues, les utiliser. Sinon :  Une méthode de type gradient est souvent suffisante. Balayer une grande plage de température, par exemple de 50 à 250 °C sur 10 min.  Si une méthode isotherme est désirée, commencer par le même gradient, puis resserrer les valeurs extrémales par itération pour obtenir le pic correspondant à l’analyte d’intérêt au temps de rétention jugé adéquat.  Préparer une solution d’échantillon à une concentration environ égale à 1 mg.mL–1, dans un solvant volatil (par exemple diéthyléther, cyclohexane, acétate d’éthyle).  Choisir la colonne. Par défaut, une colonne apolaire est suffisante. On réserve généralement l’utilisation de colonnes polaires aux cas où les volatilités des analytes à séparer sont très proches.  Injecter environ 1 µL dans l’injecteur. Par défaut, on peut choisir comme température de l’injecteur la plus haute température atteinte dans le four pendant l’analyse.  Afin de nettoyer la colonne, on peut la laisser quelques minutes à la température maximale d’utilisation. Ceci permet de débarrasser la colonne des analytes les moins volatiles qui ne sont pas sortis de la colonne à la fin de l’analyse, et risquent de sortir lors d’une injection ultérieure. 7