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Chapitre II Techniques chromatographique I. Définition : La chromatographie sous toutes ses formes, est une méthode séparative qui permet l’identification et le dosage des constituants d’un mélange gazeux, liquide ou solide. C’est une technique de séparation tr...

Chapitre II Techniques chromatographique I. Définition : La chromatographie sous toutes ses formes, est une méthode séparative qui permet l’identification et le dosage des constituants d’un mélange gazeux, liquide ou solide. C’est une technique de séparation très puissante qui permet de travailler sur des quantités allant jusqu’au µg. Les principaux objectifs donc de la chromatographie sont:  Séparation : Isoler les différents constituants d'un mélange.  Identification : Déterminer la nature des composants séparés.  Purification : Obtenir des substances pures à partir d'un mélange.  Quantification : Mesurer les quantités relatives des différents constituants. Le principe de la chromatographie est basé sur les différences d’affinité des composés du mélange avec la phase stationnaire et la phase mobile. Les différences d’affinité des composés dans un mélange peuvent influencer divers aspects, comme la solubilité, la réactivité chimique ou la séparation des composants. Voici quelques éléments à considérer :  Polarisabilité : Les molécules polaires auront tendance à interagir plus fortement entre elles, alors que les molécules apolaires s’agrègent.  Point d'ébullition : Les composés avec des points d'ébullition différents peuvent être séparés par distillation. Les substances avec des interactions plus fortes (liaisons hydrogène, par exemple) auront des points d'ébullition plus élevés.  Solubilité : Les composés se dissolvent mieux dans des solvants ayant des polarités similaires (principe "les semblables se mélangent"). Par exemple, un solvant polaire dissoudra mieux des solutés polaires.  Affinité chimique : Les différences d'affinité pour une réaction chimique peuvent conduire à des vitesses de réaction différentes, influençant la composition finale du mélange.  Interactions ioniques : Dans des solutions contenant des ions, les interactions entre ions positifs et négatifs affectent la solubilité et la formation de complexes. Ces différences d’affinité sont fondamentales dans des techniques de séparation comme la chromatographie, où les composants se déplacent à des vitesses différentes en fonction de leur affinité pour la phase stationnaire et la phase mobile. 1 Historique : Il existe peu d’exemple de développement d’un procédé ou d’une méthode aussi extraordinaire que celui de la chromatographie. Le terme chromatographie vient du grec « chroma = couleur » et « graphien = écrire ». Quelques dates importantes : 1906 : Découverte de phénomène chromatographique par le botaniste russe Mikhail TSWETT. Chromatographie et consistait à séparer les pigments d'une feuille d'épinard sur une colonne en CaCO3. Tswett constatait : "Tout comme les rayons lumineux d'un spectre, les différentes composantes d'un mélange de colorants se déploient sur la colonne de carbonate de calcium selon une loi et peuvent être analysé qualitativement et quantitativement. 1952 : Première chromatographie gazeuse (MARTIN et JAMES) 1967 : Début de la chromatographie liquide haute performance (HUBER et HUZSMAN). Le chromatogramme traduit la variation du soluté dans l’éluant (solvant) en fonction du temps. Le terme de chromatographie recouvre donc plusieurs technologies basées sur un principe commun: l'identification par la séparation.  Nous avons à retenir avant tout que: Chromatographie = Séparation. II. Principe Générale: Le principe est basé sur les différences d’affinité des composés du mélange avec la phase stationnaire et la phase mobile.  Le principe de la chromatographie consiste à entrainer l’échantillon à l’aide d’un éluant (gazeux ou liquide) appelé phase mobile (PM), qui se déplace au contact d’une seconde phase fixée sur un support (colonne ou surface plane). Celle-ci, dite stationnaire (PS), est insoluble dans la première.  Chaque composé est caractérisé par un coefficient de distribution de Nernst K (appelé également coefficient de partition) défini comme suit: 𝐂𝐬 𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐭𝐚𝐢𝐨𝐧 𝐝𝐮 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐭é 𝐝𝐚𝐧𝐬 𝐥𝐚 𝐩𝐡𝐚𝐬𝐞 𝐬𝐭𝐚𝐬𝐢𝐨𝐧𝐧𝐚𝐢𝐫𝐞 𝑲= = 𝐂𝐦 𝐂𝐨𝐧𝐜𝐞𝐧𝐭𝐫𝐭𝐚𝐢𝐨𝐧 𝐝𝐮 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐭é 𝐝𝐚𝐧𝐬 𝐥𝐚 𝐩𝐡𝐚𝐬𝐞 𝐦𝐨𝐛𝐢𝐥𝐞 2 Il existe différents types de chromatographie suivant la méthode de séparation utilisée:  la Chromatographie en Couche Mince (CCM).  la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).  la Chromatographie en phase Liquide à Haute Performance (HPLC). l'abréviation anglaise HPLC (High Performance Liquid Chromatography ou plus rarement high pressure liquid chromatography). Les différentes techniques exposées ci-dessus sont très différentes sur le plan technologique mais ont de nombreux points communs sur le principe de fonctionnement. Elles sont différentes quant au matériel utilisé.  Une CCM nécessite une feuille de papier, un solvant et une cuve en verre. La CPG, ou la HPLC nécessite des appareils de technologies poussées de coût élevé. III. Chromatographie sur Couche Mince (CCM) La chromatographie sur couche mince est la plus simple des méthodes chromatographiques. Elle consiste à placer sur une feuille (papier, silice ou autre....) une tache et de la laisser éluer en la trempant dans un solvant ou un mélange de solvant (appelé éluant), l’éluant diffuse le long du support. La tache migre sur la feuille plus ou moins vite selon la nature des interactions qu'elle subit de la part du support et de l'éluant. III.1. Principe La chromatographie sur couche mince (CCM) est basée essentiellement sur des phénomènes d’adsorption et sur le principe de la capillarité. Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l’échantillon est placée dans la cuve chromatographique, l’éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. La vitesse de déplacement de chaque composant de l’échantillon dépend d’une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Le contenant sera une cuve chromatographique, à savoir un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche. 3 La figure suivante représente Les principaux éléments d’une séparation Chromatographique sur Couche Mince (CCM): Figure : Schéma d’une CCM Remarque : a) L'adsorption: Est le processus par lequel des molécules d'un gaz, d'un liquide ou d'un soluté se fixent à la surface d'un solide ou d'un liquide, formant une couche mince. Ce phénomène est différent de l'absorption, où les molécules pénètrent dans le volume du matériau. b) Le principe de la capillarité : La capillarité est le phénomène physique que l'on observe lorsque l'on immerge partiellement un tube de petit diamètre dans un liquide. On constate que le liquide s'élève spontanément dans le tube. Cette propriété est utilisée par les plantes : la sève monte dans les tiges sous l'effet de la capillarité. Explication : la hauteur à laquelle montera le liquide Position de la plaque La plaque CCM est introduite en position verticale dans la cuve et l’éluant qui en recouvre le fond monte par capillarité, entraînant à des vitesses différentes les constituants à séparer. Remarque : Lorsque le niveau atteint par l’éluant (le solvant) de l’extrémité supérieure (appelé front de l’éluant), la plaque est retirée de la cuve. 4 On va devoir gérer 3 éléments bien définis : i) La phase stationnaire/Plaque CCM: c’est une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice (un adsorbant parmi d’autres) qui est fixée sur une plaque de verre (ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium, voire même sur une feuille de papier), à l’aide d’un liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre), l’amidon ou un polymère organique. Après le dépôt de l’échantillon sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant. Par ordre d’importance décroissante, les adsorbants employés en CCM sont le gel de silice, l’alumine, et la cellulose. Les adsorbants forts comme le gel de silice. Les adsorbants à faible capacité d’adsorption comme l’alumine, ou le carbonate de sodium etc. ii) L’échantillon: Il est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatile, qui n’est pas forcément le même que l’éluant : les plus utilisés sont le trichlorométhane (chloroforme), la propanone ou le dichlorométhane. La solution (1 cm³ max.) est déposée sur la plaque, à environ 1 cm de la partie inférieure (c'est-à-dire environ de la petite quantité de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à analyser, déposer en un point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant (ligne de dépôt)). 5 iii) La phase mobile également appelée éluant: c’est un solvant (ou un mélange de solvants), qui progresse le long d’une phase dite « stationnaire », fixée sur un support, en entraînant les composants de l’échantillon. Selon le type d’analyse à réaliser, le choix de l’éluant sera variable :  Pour des composés apolaires (les hydrocarbures et groupements fonctionnels courants) : hexane, éther de pétrole ou benzène. Hexane ou éther de pétrole, mélangés en proportions variables avec du benzène ou de l’éther diéthylique.  Pour des composés polaires : éthanoate d’éthyle, propanone ou méthanol. Remarque : La polarité de l’éluant va déterminer à quelle vitesse le composé migre Révélation Après migration, les taches doivent être révélées; c'est la détection qui peut se faire soit: Lorsque les composants de l’échantillon à analyser sont colorés (sous forme des taches visible), leur séparation est facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire (taches invisibles) on doit rendre les taches visibles par un procédé de révélation. Les taches sont ensuite cerclées au crayon. Les méthodes usuelles de révélation sont les suivantes :  A l’œil nu : si le produit est coloré (taches visibles)  Radiation UV : en exposant la plaque à une source de radiation UV, certains composés apparaissent sous formes de tache brillantes.  Fluorescence : si un indicateur de fluorescence est incorporé à l’adsorbant ; la plaque entière devient fluorescente lorsqu’elle est soumise à radiation UV. Les composés sont révélés sous forme de taches sombres.  Iode : il réagit avec un grand nombre de composé organique en formant des complexes jaunes. La révélation est réalisée en mettant la plaque, préalablement séchée en présence de quelque cristaux d’iode dans un récipient; fermé ensuite pour saturé de vapeur. Paramètre du CCM : Chaque substance est caractérisée par sa mobilité appelée rapport frontal « Rf ». Le rapport frontal (appelé aussi rétention frontale) de chaque composé est défini par le rapport : Rf = X / Y (Valeur entre 0 et 1) 6 Remarque :  Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé organique. Si l’analyse, réalisée avec divers solvants et différents adsorbants, révèle la présence d’une seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est probablement pur.  la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d’un mélange, on peut l’employer pour suivre la progression d’une réaction. Exemple : Conclusion : La chromatographie est donc une technique qui permet de :  Vérifier qu’une substance est pure.  Analyser un mélange.  Reconnaître les constituants d’un mélange par comparaison de référence (Rf). 7 III.2. Exemple d’analyse par Chromatographie sur couche Mince (CCM) des sucres Vérification de la présence de 3 glucides (glucose, maltose et saccharose) dans un jus de fruit.  Solutions de glucose, maltose et saccharose  Jus de fruit (jus d’orange) - A l’aide d’un tube capillaire, on dépose une très petite goutte de chaque solution préparée ainsi que le jus d’orange sur la plaque de chromatographie. - Insérons la plaque dans la cuve à chromatographie contenant 0.5 cm d'éluant. - Retirons la plaque quand l’éluant est à environ 1cm du bord supérieur de la plaque. On observe des tâches lors de la migration des dépôts de glucose et saccharose similaires aux tâches de l'orange, et l’absence de la tache du maltose par rapport au jus d’orange. Nous en déduisons donc que le jus d'orange contient du saccharose et du glucose. IV. Chromatographie en phase gazeuse (CPG) 1. Définition La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une méthode de séparation dont les principes généraux sont les mêmes que ceux énoncés pour la chromatographie en général, c’est-à-dire fondés sur la migration différentielle des constituants du mélange à analyser au travers d’un substrat choisi. La particularité du procédé est d’opérer en totalité sur des produits volatilisés (des composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition), ce qui implique de maintenir une température minimale convenable, mais sans qu’il y ait volatilisation du substrat, et de travailler en circuit étanche aux gaz (c.à.d: pour empêcher les fuites de gaz). CPG est une chromatographie de partage dans laquelle la phase mobile est un gaz. Elle constitue la méthode la plus puissante et la plus fine pour séparer, identifier et quantifier les corps gazeux ou volatilisables. Elle permet ainsi l'analyse de mélanges éventuellement très complexes dont les constituants peuvent différer de façon considérable par leur nature et leur volatilité. 8 IV.1. Principe La CPG repose sur l’équilibre de partage des analytes entre une phase stationnaire et une phase mobile gazeuse. La séparation des analytes repose sur la différence d’affinité de ces composés pour la phase mobile et pour la phase stationnaire. Le mélange à analyser est vaporisé puis transporté à travers une colonne renfermant une substance liquide ou solide qui constitue la phase stationnaire. Le transport se fait à l'aide d'un gaz inerte, appelé gaz vecteur (le plus souvent He ou N2), qui constitue la phase mobile. On obtient un chromatogramme où apparaissent des pics d'intégration proportionnelle à la quantité de produit injecté. Le pic est caractérisé par son temps de rétention tR, porté en abscisse (fig.VI-1). Figure VI-1: Exemple d’un chromatogramme IV.2. Appareillage L’appareil utilisé pour réaliser une analyse par chromatographie en phase gazeuse "CPG" (phase vapeur) est appelé chromatographe. Un appareil de chromatographie en phase gazeuse comporte trois parties: un injecteur, une colonne et un détecteur, comme indiqué sur le schéma (fig.VI-2).  Injecteur: Il permet d'introduire un liquide qui doit être vaporisé instantanément avant d'être transféré dans la colonne. Les échantillons liquides sont injectés à l’aide d’une micro-seringue graduée dans la chambre de vaporisation, au travers d’un bouchon généralement constitué de téflon, la température doit être suffisante a l’entrée de l’échantillon pour permettre une vaporisation du liquide sans que l’échantillon se décompose ou que s’effectue une séparation partielle 9 des constituants, en règle générale en choisit la température d’ébullition du constituant le moins volatil, pour plus d’efficacité, on prélèvera le plus faible volume d’échantillon (1 à 10µl) qui soit compatible avec la sensibilité du détecteur.  Colonne: C'est l'organe principal. Elle est constituée d'un tube généralement métallique de diamètre intérieur de l'ordre du millimètre (mm). La colonne est placée dans un four fermé à thermostat pour maintenir la température constante à 0,5°C prés et pour que les conditions soient reproductibles. Cette température peut être choisie dans une gamme allant de la température ambiante jusqu'à plus de 400°C et pour une opération isotherme.  Détecteur: Placé à la sortie de la colonne de séparation, Leur fonction est de détecter et de mesurer, après séparation la présence de petites quantités de constituants dans l’éluat de la colonne (différents gaz séparés). Les résultats sont envoyés à un appareil qui trace une courbe appelée chromatogramme. Le choix du détecteur dépend de plusieurs facteurs tels que le niveau des concentrations à mesurer et la nature des constituants séparés. On distingue trois types de détecteur:  Détecteur à ionisation de flamme.  Détecteur à capture d’électron.  Détecteur à cathétomètre (c’est un détecteur à conductibilité thermique le plus utilisé en CPG). DIF : Détecteur à Ionisation de Flamme (utilise une flamme d’hydrogène brûlant dans un excès d’oxygène.) (c-à-d : Les solutés élués sont brûlés dans une flamme très chaude air-hydrogène) Figure VI-2: deux Schémas fonctionnels d’un appareil de CPG 10 IV.3. Utilisation de la CPG (Voici quelque application de la CPG)  Dosage en toxicologie: - Recherche de toxique en intoxication aiguë - Dosage des drogues comme : opiacés (‫)المواد األفيونية‬, cannabinoïdes (‫)القنب‬ - Contrôle anti-dopage (‫)مكافحة مراقبة المنشطات‬ - Dépistage de toxicomanie (‫)فحص تعاطي المخدرات‬  Agroalimentaire: - Recherche et dosage des pesticides (‫)المبيدات الحشرية‬ - Recherche et dosage des nitrosamines (nitrites) Les nitrosamines sont une famille de composés chimiques azotées et oxydées. Les nitrosamines sont des composés potentiellement cancérigènes, présents dans divers produits industriels comme les aliments, les plastiques, et les produits pharmaceutiques. IV.4. Exemple d’application Détection des Esters Méthyliques d'Acides Gras (EMAG) dans les corps gras d'origines animales et végétales, la méthode est basée sur le fait que des esters méthyliques sont formés par transméthylation avec une solution méthanolique d'hydroxyde de potassium. À l'aide de la chromatographie en phase gazeuse (CPG), les esters méthyliques d'acides gras (EMAG) sont séparés sur une phase stationnaire hautement polaire en fonction de leur longueur de chaîne, de leur degrés de saturation/d'instauration et selon la configuration et la position des doubles liaisons. V. Chromatographie Liquide Haute Performance HPLC/CLHP C’est une technique de séparation analytique de molécules présentes dans un mélange. Sa grande précision permet la recherche de traces. La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui n'étaient auparavant pas possible avec les techniques sur couche mince ou en phase gazeuse. Cette forme de chromatographie est fréquemment utilisée en biochimie et en toxicologie. 11 V.1. Principe Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique. C'est ce que l'on a appelé la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC). Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. L'ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme. Le signal du détecteur est amplifié et enregistré, la température du four est maintenue constante. Figure V-1. Chromatogramme d’un soluté en HPLC Quatre types d’HPLC sont couramment employés en fonction de la nature de la phase stationnaire.  HPLC d'adsorption : La phase stationnaire est constituée d’un solide polaire et adsorbant : silice non greffée, silice greffée polaire, la phase mobile est un éluant isocratique apolaire ou un gradient de polarité. Une élution isocratique est une élution au cours de laquelle la composition de la phase mobile n'est pas modifiée au cours du temps. 12   HPLC phase inversée : La phase stationnaire est un solide apolaire, c’est une silice greffée apolaire, par exemple une silice greffée 18 carbones, la phase mobile est un éluant isocratique polaire ou un gradient de polarité.  HPLC d’exclusion : La phase stationnaire est un solide poreux, silice poreuse à groupements silanols bloqués ou supports organiques. La phase mobile est un éluant isocratique inerte.  HPLC ionique : La phase stationnaire est une silice greffée chargée ou un support acrylique chargé. La phase mobile est un gradient de pH ou de force ionique. V.2. Appareillage Schéma du principe du fonctionnement du chromatographe en phase liquide haute performance (HPLC). Dans tout appareil de chromatographie liquide haute performance (Fig.V-2) on retrouvera toujours les éléments de base suivants : a) Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité suffisante ou plusieurs flacons d'éluants (solvants de polarités différentes) sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe doseuse. b) La pompe : elle est muni d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du solvant. Elle permet de travailler: - en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse. - en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange d'éluants. Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques µL à plusieurs mL/min. c) Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes, (Capacité de 5 à 5000µL). Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative. d) La colonne : Une colonne HPLC se compose de deux parties principales : i) Le tube : Il est généralement fabriqué en acier inoxydable ou en matériaux résistants à la pression, et il est de forme cylindrique. La colonne est souvent de petite taille (en termes de longueur et de diamètre), mais elle peut contenir une grande surface de phase stationnaire pour maximiser l'interaction avec les analytes. ii) La phase stationnaire : C'est le matériau à l'intérieur de la colonne qui joue un rôle clé dans la séparation des composés. Elle est constituée de particules solides (souvent de silice ou de polymères) qui ont été modifiées chimiquement pour favoriser des 13  interactions spécifiques avec les molécules de l'échantillon. Selon la nature de la phase stationnaire, la séparation peut être basée sur différentes propriétés des analytes, telles que leur polarité, leur charge ou leur taille. e) La phase stationnaire - La phase normale: La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête. L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations. - La phase inverse : La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (Acétonitril «ACN», Methanol «MeOH», H2O). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante. f) La phase mobile : L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire normale ou à polarité inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés. La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe : - si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la chromatographie est dite en phase normale ; - si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire (le plus souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en phase inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention k des composés. g) Détecteurs Citons comme exemple ces deux types de détecteurs qui sont classiquement utilisés :  Détecteur UV-visible: il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que : - le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à l'appareil, et que son coefficient d'absorption (coeff. d’extinction molaire) ε soit suffisamment grand ; - la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur.  Réfractomètre : il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la colonne. Cette mesure, extrêmement précise, dépend néanmoins de la température du liquide. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure : il y a donc une référence d'où le terme de variation de l'indice. Ce détecteur exclut les variations de la 14  composition de la phase mobile; il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique avec ce détecteur. Les données sont collectées par l'intermédiaire soit d'un intégrateur ou d'une station d'acquisition. Figure V-2: Schéma d’un système d’HPLC V.3. Domaine d’application Les domaines d’applications sont nombreux et vastes, l’HPLC est particulièrement employée en cosmétologie ou en biochimie Voici quelques-uns de ses principaux domaines d'application :  Elle permet l’analyse de substances thermiquement instables, puisqu’opération s’effectue à T° ambiante.  L’analyse de substances peu volatiles.  L’analyse des substances ionisés (protéines, acides aminés…) VI-Théorie de la chromatographie (Aspect théorique) La théorie générale de la chromatographie peut être longue et complexe à exposer. En outre, chaque méthode chromatographique possède sa théorie et ses mécanismes propres. Nous présentons seulement dans ce chapitre les grandeurs fondamentales de la chromatographie (sous toutes ses formes) qui sont des éléments théoriques indispensables au praticien. VI-1- Comment améliorer une séparation en chromatographie ? Figure VI.1: Séparations entre 2 pics en chromatographie 15  Il y a deux possibilités pour améliorer la séparation entre les 2 pics du chromatogramme (a) : i) A largeur de pic constante, on peut augmenter la différence de temps de rétention entre les deux pics, ceci est illustré dans chromatogramme (b) ii)A temps de rétention constant, on peut diminuer la largeur des pics, le chromatogramme (c) illustre ce phénomène. En pratique, on peut jouer à la fois sur ces 2 paramètres pour améliorer une séparation. En conclusion, deux paramètres s'avèrent donc primordiaux en chromatographie, la rétention et la forme du pic. VI-2:Paramètres caractérisant la rétention. Figure VI.2 : Chromatogramme(1) d’un soluté montre tM, tR, t’R Le chromatogramme (2) du Prozac (antidépresseur) a été enregistré dans les conditions suivantes : HPLC. Colonne C18: 15cm x 4.6mm Phase mobile: acetonitrile / 25mM KH2PO4 pH 7.0 (40:60) Débit: 2mL/min. Température: 30°C Détecteur UV : 254 nm. Injection: 1µL VI-2-1- Le temps de rétention. Le temps de rétention tR d'un produit S est le temps écoulé entre le début de l'injection et la sortie du produit. (pour le chromatogramme 2, tR = 3mn) tR dépend du produit S et des conditions expérimentales (colonne, température, débit de phase mobile... etc.). VI-2-2- Le volume de rétention Le volume de rétention VR correspond au volume de phase mobile nécessaire pour éluer le produit S. Connaissant le débit D de la phase mobile, supposé maintenu constant, on définit le volume de rétention: VR = tR. D pour le chromatogramme 2 : VR = (3).(2) = 6 ml 16 VI-2-3- Le temps mort. Le temps mort 𝒕𝒎 est le temps que met la phase mobile pour traverser la colonne. (Dans la figure 2, 𝒕𝒎 = 𝟏𝐦𝐧) La phase mobile est caractérisée par sa vitesse linéaire U de 𝐋 déplacement dans la colonne de longueur L, on a : 𝐔= 𝒕𝒎 (pour le chromatogramme 2, U = 15 cm/mn). En CPG, le temps mort correspond au temps de rétention de substances non retenue par la phase stationnaire comme l'air ou le méthane. VI-2-4- Le volume mort. On appelle volume mort 𝑽𝒎 le volume de phase mobile qui passe à travers la colonne pour aller d'une extrémité à l'autre de la colonne (pendant le temps 𝒕𝒎 ). Autrement dit, 𝑽𝒎 est le volume occupé par la phase mobile dans une colonne. 𝑽𝒎 = 𝒕𝒎. 𝐃 ; (Pour le chromatogramme 2 : 𝑽𝒎 = (𝟏). (𝟐) = 𝟐𝐦𝐥 Vm ne dépend que de la géométrie et du remplissage de la colonne. Remarque : Pour une colonne de section S et de longueur L, Le Volume Vt de la colonne est donné 𝐝𝟐 part : 𝑽𝒕 = 𝐋. 𝐒 = 𝐋. 𝛑. 𝐫 𝟐 = 𝐋. 𝛑. 𝟒 la surface de la section de la colonne est : S= π. r2 avec : r = (d/2) est le rayon de la section de la colonne ; d est son diamètre. Vt : égal au volume total du solvant contenu dans la colonne (c.à.d Vt est le Volume de la 𝑽𝒎 colonne). On défini ainsi la porosité  par :  = 𝑽𝒕 Le Volume mort Vm est donc : Vm= . Vt = . L. π.(d/2)2 VI-2-5- Volume et temps de rétention réduits On appelle volume de rétention réduit V'R, la différence entre les termes 𝑽𝑹 et 𝑽𝒎. 𝑽′𝑹 = 𝑽𝑹 − 𝑽𝒎 (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟏) (Pour le chromatogramme 2,𝑽′𝑹 = 𝟒𝐦𝐥). Le volume de rétention réduit correspondant au produit S est : le volume de phase mobile qui doit passer à travers la colonne pour éluer le composé S. De la même façon, on définit un temps de rétention réduit t'R. 𝒕′𝑹 = 𝒕𝑹 − 𝒕𝒎 (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟐) (Pour le chromatogramme 2, t'R = 2 mn) 17 Les volumes et temps de rétention réduits sont indépendantes des volumes et temps morts, elles dépendent donc moins de l'instrumentation (de la colonne). VI-2-6- Le facteur de rétention K' (ou de capacité). Si on représente la colonne de chromatographie comme un milieu hétérogène constitué de deux phases non miscibles, l’une fixe et l’autre mobile et si on introduit dans ce milieu un composé présentant des affinités envers les deux phases, il s’établira, en chaque point de la colonne, un équilibre entre la concentration de ce composé dans la phase mobile et sa concentration dans la phase stationnaire. Le rapport de ces concentrations à l’équilibre est le coefficient de partage K. Le facteur de rétention K' pour un produit donné est défini comme suit : 𝑽𝑹 − 𝑽𝒎 𝑽′𝑹 𝒕𝑹 − 𝒕𝒎 𝒕′𝑹 𝐊′ = = 𝐨𝐮 é𝐠𝐚𝐥𝐞𝐦𝐞𝐧𝐭 𝐊′ = = (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟑) 𝑽𝒎 𝑽𝒎 𝒕𝒎 𝒕𝒎 Ce qui donne ∶ 𝑽𝑹 = 𝑽𝒎 (𝟏 + 𝐊 ′ ) 𝐞𝐭 𝒕𝑹 = 𝒕𝒎 (𝟏 + 𝐊 ′ ) (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟒) Les facteurs de rétention sont des grandeurs sans dimension donc plus générales d'un produit donné que les temps ou les volumes de rétention réduits. (pour le chromatogramme 2, K' = 2). D'où une définition du facteur de rétention d'après (eq.1-3) : c'est le rapport du temps passé par le soluté dans la phase stationnaire sur le temps passé par ce même soluté dans la phase mobile. VI-3. Interprétation thermodynamique des paramètres de rétention VI-3-1- La constante d'équilibre (ou constante de partition) K Le problème est le suivant: trouver les relations entre les paramètres de rétention (VR, k', tR' et tR) et la constante d'équilibre K caractérisant l'équilibre suivant: L'élution d'un soluté S en chromatographie est donc caractérisé par la constante d'équilibre K, appelée aussi constante de partition (déjà définie). [𝑺𝒔 ] 𝑪𝒔 𝒎𝒔 𝒎𝒎 𝑲= (ou bien 𝐊 = ) (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟓) où [𝑺𝒔 ] = 𝐞𝐭 [𝑺𝒎 ] = [𝑺𝒎 ] 𝑪𝒎 𝑽𝒔 𝑽𝒎 Avec : 18  [𝑺𝒔 ] : Concentration du soluté dans la phase stationnaire [𝑺𝒎 ] : Concentration du soluté dans la phase mobile. mm = masse du soluté S dissous dans la phase mobile. ms = masse du soluté S dissous dans la phase stationnaire. Vm = volume de la phase mobile (équivalent au volume mort). Vs = volume de la phase stationnaire. Vm et Vs sont constants pour une colonne donnée avec une phase stationnaire donnée 𝛃 = 𝑽𝒎. Le paramètre β, appelé rapport de phases est une constante qui caractérise une 𝑽𝒔 colonne de chromatographie. β sera calculé par la suite pour une colonne capillaire en chromatographie en phase gazeuse. La relation (eq.1-5) devient : [𝑺𝒔 ] 𝒎𝒔 𝑽𝒎 𝒎𝒔 𝑲= = = 𝛃 (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟔) [𝑺𝒎 ] 𝒎𝒎 𝑽𝒔 𝒎𝒎 VI-3-2- Le facteur de rétention k' 𝑽𝑹 𝐊′ = −𝟏 𝒅′ 𝒂𝒑𝒓é𝒔 (é𝒒. 𝟏 − 𝟑), 𝒐𝒏 𝒅é𝒅𝒖𝒊𝒕 𝒒𝒖𝒆: 𝑽𝒎 Si on suppose que VR est proportionnel à la masse totale de soluté dissous dans la phase stationnaire et dans la phase mobile. On a donc VR proportionnel à (ms + mm) De la même façon, si on suppose que Vm est proportionnel à la masse de soluté dissous dans la phase mobile. On a donc Vm proportionnel à mm 𝒎𝒔 + 𝒎𝒎 𝒎𝒔 On en déduit que 𝐊′ = −𝟏= et d’après éq.1-6 on a donc 𝒎𝒎 𝒎𝒎 𝒎𝒔 [𝑺𝒔 ] 𝑽𝒔 𝑽𝒔 𝐊 𝐊′ = = =𝐊 = 𝒎𝒎 [𝑺𝒎 ] 𝑽𝒎 𝑽𝒎 𝛃 𝐊 Ce qui nous donne une relation fondamentale de la chromatographie 𝐊 ′ = 𝛃 (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟕) VI-3-3- Le temps de rétention 𝒕𝑹 ∶ D'après les équations 1-4 et 1-7, on déduit que : 𝐊 𝐊 𝒕′𝑹 = 𝒕𝒎 𝐞𝐭 𝒕𝑹 = 𝒕𝒎 ( 𝟏 + ) ( 𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟖) 𝛃 𝛃 La dernière expression est cohérente, si un produit n'a aucune affinité avec la phase stationnaire: [Ss] = 0 donc K = 0 et 𝒕𝑹 = 𝒕𝒎. Ceci est le cas de l'air ou en première approximation du CH4 en CPG, ce qui permet la mesure du temps mort. VI-3-4- Influence de la température sur les temps de rétention réduits tr' 19 K varie avec la température T suivant l'équation classique (eq.1-9), où ΔrG° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases. K est >>1 donc − 𝚫𝐫𝐆° ΔrG° est négative. 𝒍𝒏𝑲 = (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟗) 𝐑𝐓 En combinant cette expression avec l'équation 1-8, on trouve la relation entre le temps de rétention réduit et la température : − 𝚫𝐫𝐆° 𝒍𝒏(𝒕′ 𝑹 ) = − 𝐥𝐧(𝛃) + 𝐥𝐧(𝐭𝒎 ) (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟏𝟎) 𝐑𝐓 Où ΔrG° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté entre les phases mobile et stationnaire. FigureVI.3 : Représentation graphique du terme DrG°(dissol pm→ ps) Plus rG° (dissol pm→ ps) est petit (grand en valeur absolue) (voir eq.1-9), plus la constante d'équilibre K est grande, plus le produit est retenu sur la colonne, plus le tR est grand (voir eq.1-8). D’après la figure VI.3, il apparaît que pour avoir une séparation chromatographique, il faut que :  rG° (dissol pm→ ps) rG° (dissol pm)  rG° (dissol pm→ ps) est fonction de la température, en effet rG°= Hr°-TSr° Si l'on suppose que rH° et rS° sont indépendants de la température, la formule (eq.1-10) − 𝚫𝐫𝐇° 𝚫𝐫𝐒° devient : 𝒍𝒏(𝒕′ 𝑹 ) = + − 𝐥𝐧(𝛃) + 𝐥𝐧(𝐭𝒎 ) 𝐑𝐓 𝐑 𝐀 Soit : 𝒍𝒏(𝒕′ 𝑹 ) = +𝐁 (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟏𝟏) 𝐓 20 Où A et B sont des constantes pour un produit donné et une colonne donnée. Considérons deux températures T1 et T2 où T2>T1 avec les facteurs de rétention correspondants k'1 et k'2, la formule (eq.1-10) devient : 𝒕′ 𝑹𝟏 − 𝚫𝐫𝐇° 𝟏 𝟏 − 𝚫𝐫𝐇° 𝒍𝒏 ( )= ( − )= (𝐓 − 𝐓𝟏 ) (𝐞𝐪. 𝟏 − 𝟏𝟐) 𝒕′ 𝑹𝟐 𝐑 𝐓𝟏 𝐓𝟐 𝐑 𝐓𝟏. 𝐓𝟐 𝟐 Comme 𝒕′ 𝑹𝟏 > 𝒕′ 𝑹𝟐 ,on voit que rH° est toujours