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Techniques chromatographiques Mme Hind MALKI  La Chromatographie A l'origine utilisée pour la séparation de substances colorées (d'où son nom), la chromatographie est aujourd'hui une méthode puissante d'analyse qualitative et quantitative. Son principe est...

Techniques chromatographiques Mme Hind MALKI  La Chromatographie A l'origine utilisée pour la séparation de substances colorées (d'où son nom), la chromatographie est aujourd'hui une méthode puissante d'analyse qualitative et quantitative. Son principe est basé sur une séparation entre une phase mobile et une phase stationnaire.  La Chromatographie sur couche mince (CCM) La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une méthode simple et rapide qui date de plus de 50 ans (fin des années 50) lorsqu'on abandonna progressivement la chromatographie sur papier pour des questions de reproductibilité et de rapidité. Elle est relativement peu performante, mais elle continue à être très utilisée car : - Elle ne nécessite pas un appareillage sophistiqué, - Son coût de revient est très faible, - Elle offre la possibilité de traiter rapidement un grand nombre d'échantillons (pour des analyses de routine).  La Chromatographie sur couche mince (CCM) La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique de chromatographie planaire dont la phase mobile est liquide. elle est couramment utilisée pour séparer des composants dans le but d'analyser (CCM analytique) ou de purifier (CCM préparatif). la chromatographie sur couche mince est une technique analytique qualitative et non quantitative. Elle comprend: Une phase stationnaire: peut être solide ou liquide. Dans le cas de CCM, on utilise une phase stationnaire de silice ( absorbant) qui est fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille de semi-rigide. Cette phase peut être composé par:  Gel de silice: Analyser un échantillon inconnu;  Alumine: Analyser une substance basique;  Cellulose: Substance très planaire (acide aminé, sucre....)  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Une phase mobile: peut être un solvant pur ou un mélange de solvants avec différents pourcentages qui sert à la migration des échantillons sur la plaque, son volume ne doit pas dépasser la ligne de départ qu'on a tracé sur la plaque. Les échantillons: sont des substances qui ont une faible polarité qui sert à leur migration rapide, on doit les dissocier avec des solvants très volatils. la vitesse de la migration des échantillons dépond de la nature du solvant et la force électrostatique.  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Principe de Fonctionnement La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants (état liquide) et la phase stationnaire est généralement un adsorbant maintenu sur une plaque en verre. Les constituants de l'échantillon sont élués (entraînés) par la phase mobile qui grimpe par capillarité vers le haut de la plaque. Ils peuvent être identifiés par comparaison à l'élution simultanée de témoins.  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Dépôt Il se fait de façon ponctuelle à l'aide d'une pipette capillaire à usage unique. Celle-ci doit être placée perpendiculairement (pour qu'elle ne se vide pas seule) et prudemment sur la plaque (pour ne pas l'endommager). Il est parfois nécessaire (problème de concentration) de faire plusieurs dépôts du même échantillon au même endroit. Il faut alors sécher (sèche-cheveux) entre chaque dépôt. La Chromatographie sur couche mince (CCM)  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Préparation de la plaque On trace une ligne de départ sur la plaque, située à une hauteur suffisante pour éviter que le volume de phase mobile ne dépasse cette ligne. Les produits ne doivent pas interagir fortement avec la phase mobile afin de ne pas être dissous et de permettre leur migration par capillarité. Cette ligne de départ doit être commune à tous les produits. À l'aide d'un capillaire, on prélève chaque produit après remplissage et on dépose une petite goutte sur la plaque, en respectant l'ordre établi. Il est important de ne pas élargir la tâche pour assurer une bonne lecture. Après chaque dépôt, la goutte est séchée. Si le produit est peu concentré, on procède en plusieurs étapes : une première goutte est déposée et séchée, suivie d'une deuxième goutte également séchée, et ainsi de suite, jusqu'à obtenir une tâche de taille appropriée.  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Préparation de la plaque Ensuite, on place la plaque verticalement dans un bocal contenant la phase mobile. On observe que la phase mobile commence à migrer vers le haut par capillarité. Lorsque le front du solvant atteint environ 0,5 cm de l'extrémité supérieure de la plaque, après un temps donné t, on retire la plaque du bocal. On trace immédiatement une ligne d'arrivée marquant la position finale du front de solvant, puis on sèche la plaque à l'aide d'un séchoir pour stopper la migration. La ligne d'arrivée permet de calculer le rapport frontal (Rf), qui est une mesure relative de la migration des composants.  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Développement des plaques La plaque est placée dans une cuve saturée en vapeur de solvant d'élution. Un bord de cette plaque trempe dans un fond de solvant, en prenant soin d'éviter tout contact entre le dépôt ponctuel de l'échantillon et le solvant. Ce dernier migre alors par capillarité vers le haut de la plaque. Les différents constituants de l'échantillon ne migrant pas à la même vitesse le long de la plaque, on obtient alors dans le cas idéal autant de taches que de constituants sur le trajet de migration du solvant (méthode de séparation).  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Développement des plaques La Figure montre le front de migration par capillarité du solvant à partir de la ligne de dépose des échantillons. La tache correspond à un produit qui a migré sur une distance B alors que le solvant a migré sur une distance A  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Développement des plaques Le paramètre le plus utilisé pour l'analyse qualitative est le rapport frontale Rf. La valeur de Rf est définie par le rapport de la distance parcourue par la substance sur la distance parcourue par le front de solvant soit la relation : La valeur de Rf est donc comprise entre 0 et 1. Pour obtenir des Rf reproductibles, il est nécessaire d'opérer dans des conditions identiques : composition identique d'éluant, température constante, cuve saturée...  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Visualisation des substances séparées Détecteur universel:  Iode : détecte les composés avec double liaison simple; il apparait sous forme de tâches d'une couleur jaune  UV : détecte les composés avec double liaisons conjugués; il apparait sous forme de tâches violette Après avoir été révélées, les taches sont marquées au crayon de façon à pouvoir se rappeler de leur position même après qu'elles se soient estompées.  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Visualisation des substances séparées Détecteur spécifique:  Révélation au permanganate de potassium KMNO4 : On l'utilise en trempage et cela produit un coloration jaune/marron des produits oxydables sur un fond violet/rose. Il est utilisable sur les plaques Alumine et Silice.  La vanilline : Utilisé en trempage suivi d'un chauffage à environ 200°C jusqu'à ce que les taches apparaissent. Il contient l'acide sulfirique et l'éthanol à 90-96%.  Ninydrine : possède la particularité de former un produit coloré avec les acides aminés à chaud.  La Chromatographie sur couche mince (CCM) Analyse qualitative Les témoins placés à coté de l'échantillon permettent d’identifiés les constituants de l'échantillon (les taches ayant parcouru la même distance et de même couleur). Chromatographie en Phase Liquide  La Chromatographie en phase liquide (LC) Introduction La chromatographie liquide est une technique analytique essentielle permettant de séparer, identifier et quantifier les composants d’un mélange complexe. Elle repose sur les interactions différentielles entre les analytes (substances à analyser) et deux phases : Une phase mobile, constituée d'un liquide (solvant ou mélange de solvants), qui transporte les analytes. Une phase stationnaire, fixée à l'intérieur de la colonne chromatographique, qui interagit avec les analytes.  La Chromatographie en phase liquide (LC) Principe de séparation Le principe de séparation en chromatographie liquide repose sur les différences d’affinité des analytes pour les deux phases : Phase mobile : Les analytes ayant une forte affinité pour la phase mobile migrent rapidement à travers la colonne. Phase stationnaire : Les analytes ayant une affinité élevée pour la phase stationnaire interagissent davantage avec elle, ce qui ralentit leur migration. Chaque analyte aura un temps de rétention distinct, déterminé par ses interactions respectives avec les deux phases. Ces temps permettent de séparer et d’identifier les composants du mélange.  La Chromatographie en phase liquide (LC) Phases utilisées Phase mobile : Elle peut être polaire (eau, méthanol, acétonitrile) ou apolaire, selon le type de chromatographie. La composition du solvant influence directement la sélectivité et l’efficacité de la séparation. Phase stationnaire : C’est un matériau solide ou une couche liquide fixée sur un support solide. Elle est choisie en fonction des caractéristiques chimiques des analytes.  La Chromatographie en phase liquide (LC) Matériels utilisés Colonne chromatographique : permet la séparation des composés de l'échantillon Pompes : Garantissent un débit constant de la phase mobile. Injecteur : Introduit l’échantillon dans la colonne. Détecteur : Mesure la concentration des analytes à la sortie de la colonne (par exemple, détecteur UV-Vis ou MS). Système d’acquisition de données : Permet de suivre et d’analyser les résultats. Solvants et réactifs : Utilisés comme phase mobile pour optimiser la séparation des analytes. Filtres et accessoires : Garantissent la pureté des solvants et protègent les colonnes contre les particules et les contaminants. Thermostat : Permet de contrôler la température de la colonne, influençant ainsi la performance et la reproductibilité des séparations.  La Chromatographie en phase liquide (LC) Types de colonnes Colonnes capillaires Description Matériaux Applications Avantages Colonnes très Fabriquées en Grande verre ou en Idéales pour efficacité de fines avec un acier l’analyse de séparation. diamètre interne inoxydable, leur composés allant de 0,1 à paroi interne complexes 0,5 mm et une est recouverte nécessitant une longueur Faible d'une phase grande pouvant consommation stationnaire résolution atteindre 100 cm de solvant  La Chromatographie en phase liquide (LC) Types de colonnes Colonnes remplies Description Matériaux Applications Avantages Colonnes plus Utilisées dans Large gamme larges (diamètre Généralement les systèmes d'applications. de 2 à 5 mm) et en acier HPLC pour plus courtes (5 à inoxydable pour diverses 30 cm) remplies résister à la techniques de particules pression élevée. (partage, Compatible solides ou de adsorption, avec des débits supports échange d’ions). plus élevés que poreux. les colonnes capillaires.  La Chromatographie en phase liquide (LC) Types de colonnes Colonnes Monolithiques Description Applications Avantages Débit plus rapide grâce à une faible Conviennent aux résistance au flux. Constituées d’un analyses rapides bloc continu de et aux matériau poreux, échantillons sans particules. complexes. Bonne efficacité de séparation.  La Chromatographie en phase liquide (LC) Types de colonnes Colonnes à Phase Stationnaire Modifiée Description Applications Avantages Colonnes où la phase stationnaire Adaptabilité selon est chimiquement les composés. modifiée pour Très utilisées pour améliorer la les analyses en sélectivité phase inverse. (exemple : colonnes C18 pour des composés Stabilité chimique hydrophobes). accrue.  La Chromatographie en phase liquide (LC) Types de colonnes Colonnes à Phase Stationnaire Polymérique Description Applications Avantages Haute stabilité chimique et Utilisent des thermique. polymères (comme Analytes sensibles le polystyrène- aux conditions divinylbenzène) acides ou comme phase basiques. stationnaire. Convient pour des applications spécifiques.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) (Généralités ) A l’origine la chromatographie en phase liquide se faisait sur des colonnes en verre. Le liquide traversait la phase stationnaire par gravité ou sous faible pression. Puis pour augmenter le débit, des manipulations ont été réalisées sous pression plus forte. C’est ce que l’on a appelé la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC).  La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui n’étaient auparavant pas possible avec les techniques sur couche mince ou en phase gazeuse.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Principe Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Fonctionnement de l'appareil La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique. Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Fonctionnement de l'appareil La phase stationnaire est un support plus ou moins poreux recouvert d’un gel (liquide greffé) qui a les propriétés désirées pour retenir les molécules de solutés. La phase mobile ou éluant est un liquide qui entraîne les solutés à travers la colonne.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Appareillage  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Appareillage Réservoir de la phase mobile (solvant) Le plus souvent ce réservoir est une bouteille en verre dans lequel plonge un tube avec une extrémité filtrante en téflon Pompe Elle délivre en continu la phase mobile sous pression avec un débit constant et stable Injecteur Le type d'injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle d'échantillonnage d'une capacité fixe (10, 20, 50 µL…). Cette boucle permet d'introduire l'échantillon sans modifier la pression dans la colonne.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Dimensions d’une colonne HPLC Longueur de la colonne Longueurs typiques : 50 à 300 mm. Colonnes courtes : 50 mm (pour des analyses rapides). Colonnes longues : jusqu’à 300 mm (pour des séparations complexes ou des analyses de haute résolution). Diamètre interne Diamètre interne typique : 2,1 mm à 4,6 mm. Colonnes étroites : 2,1 mm (utilisées pour réduire la consommation de solvant). Colonnes larges : 4,6 mm (standard pour de nombreuses analyses analytiques). Taille des particules de la phase stationnaire Taille des particules : 3 à 5 µm.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) vanne à boucle d'échantillonnage Elle possède 2 positions. La première permet le remplissage de la boucle d'injection de volume fixe (load), la seconde permet la mise en circulation de l'échantillon dans le système chromatographique (inject). Le remplissage de la boucle d'injection se fait à l'aide d'une seringue.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Vanne à boucle d'échantillonnage La pompe va aspirer le solvant depuis le réservoir à solvant puis l'injecter dans la colonne qui est la phase stationnaire Le système de la boucle est composé de six trous. Ces six trous vont pouvoir pivoter pour se mettre en correspondance et rejoindre les différents compartiments. La boucle est constituée d'un tuyau dont le volume est précisément connu, correspondant au volume injecté. La partie d'injection est équipée d'une seringue qui permet d'injecter le produit dans la colonne. Un réservoir-poubelle est également prévu pour récupérer le produit excédentaire ainsi que le trop-plein de la boucle, assurant ainsi un fonctionnement propre et efficace du système.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Vanne à boucle d'échantillonnage Une fois que la pompe est activée (allumée), le solvant est aspiré vers la colonne. Il traverse la boucle via les deux orifices alignés (qui ont été mis en correspondance). Ensuite, la boucle est remplie avec le produit à analyser. Le volume injecté doit être supérieur au volume de la boucle afin de garantir que celle-ci soit complètement remplie. L'excédent de produit est évacué vers le récipient-poubelle.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Vanne à boucle d'échantillonnage La boucle est ensuite tournée en position d'injection, ce qui permet au solvant de pousser le produit à analyser présent dans la boucle vers la colonne. Grâce à ce système, un volume précis du produit à analyser est injecté dans la colonne.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Vanne à boucle d'échantillonnage La boucle est ensuite remise dans sa position initiale, permettant au solvant de passer directement dans la colonne pour poursuivre la chromatographie.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Différents types de séparation - colonne La chromatographie d'adsorption (liquide/solide) La phase stationnaire consiste en une matière solide à grand pouvoir d'adsorption. Les composants sont simplement plus ou moins retenus à la surface de la phase stationnaire. C'est une technique qui prend en compte la polarité des composants Technique peu utilisée. La chromatographie de partage (liquide/liquide) Une technique chromatographique dans laquelle la séparation des composés repose sur leur répartition entre deux phases liquides immiscibles : Phase stationnaire : Un liquide immobilisé sous forme d'une fine couche sur un support solide inerte, comme de la silice. Phase mobile : Un autre liquide, qui s'écoule sur ou à travers la phase stationnaire.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Différents types de séparation - colonne La chromatographie de partage (liquide/liquide) Phase normale La phase normale la plus utilisée est à base de gel de silice. Cette phase sert ainsi principalement à séparer des composés polaires. Phase inverse La base d'une phase inverse est une phase normale sur laquelle des chaînes alkyles ont été greffées au niveau des groupes. En général, la phase stationnaire est majoritairement composée de petites particules de silice sur lesquels on a greffé des fonctions chimiques, le plus souvent de chaînes alkyles à 18 atomes de carbones. Phase inverse Cette phase est dite "inverse" car de polaire et hydrophile (sans les "greffes"), la phase devient apolaire et hydrophobe. Technique utilisée majoritairement aujourd’hui  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Différents types de séparation - colonne La chromatographie d'échange d'ions Pour le dosage des molécules chargées, par exemple pour faire un bilan anionique ou cationique dans l’eau. La chromatographie d'exclusion Les composants sont séparés selon leur dimension moléculaire. La phase stationnaire est composée d'un matériel poreux, les molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores ne peuvent pénétrer et ne sont pas retenues. La durée de séjour dans la colonne augmente lorsque le poids moléculaire diminue. Utilisé principalement pour une étape de purification.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Détecteurs Détecteur UV-Visible (UV-Vis) Principe : Mesure l'absorption de la lumière ultraviolette ou visible par les analytes (Absorption à une longueur d’onde spécifique) Applications : Analyse des composés contenant des doubles liaisons, cycles aromatiques, etc... Le plus courant. Peu spécifique. Détecteur UV à barrette de diodes Principe : Similaire au détecteur UV-Vis, mais avec la capacité de détecter les spectres d’absorption sur plusieurs longueurs d'onde simultanément. Applications : Analyse multi-composants, identification et pureté des composés. Plus spécifique, mais présente peu d’intérêt en limite de sensibilité.  Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Différence entre HPLC/ UPLC La HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) et la UPLC (Ultra- Performance Liquid Chromatography) sont des termes qui désignent des techniques de chromatographie liquide, mais elles diffèrent principalement par les performances et les spécifications techniques. Voici une comparaison détaillée : Chromatographie Liquide couplé à la spectrométrie de masse (HPLC/MS) Au niveau du HPLC Séparer les composés présents dans un mélange complexe en fonction de leurs propriétés physico-chimiques (polarité, interactions avec la phase stationnaire). Une phase mobile (solvant liquide) transporte les analytes à travers une colonne remplie de phase stationnaire. Les interactions entre les analytes, la phase stationnaire et la phase mobile déterminent leur vitesse de migration. Les analytes sortent de la colonne (élution) à des temps différents (temps de rétention). Au niveau du MS Identifier et quantifier les analytes en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Les analytes sont convertis en ions (positifs ou négatifs) dans la source d'ionisation. Les ions produits sont triés et détectés en fonction de leur m/z. Les spectres de masse obtenus fournissent des informations structurelles et quantitatives sur les analytes.  Chromatographie Liquide couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS) En chromatographie liquide haute performance (HPLC), les modes de séparation phase normale et phase inverse reposent sur la nature de la phase stationnaire et de la phase mobile, ainsi que sur les interactions entre les analytes et ces phases:  Phase normale Principe La phase stationnaire est polaire (ex. : silice non modifiée). La phase mobile est apolaire ou faiblement polaire (ex. : hexane, éther diéthylique). Mode d’interaction Les analytes polaires interagissent fortement avec la phase stationnaire polaire. Les analytes apolaires interagissent peu avec la phase stationnaire et sont donc éludés plus rapidement. Ordre d’élution Les composés apolaires sont éludés en premier. Les composés polaire sont retenus plus longtemps. Applications Analyse de composés très polaires (sucres, alcools, acides). Applications dans les solvants organiques non polaires.  Chromatographie Liquide couplée à la spectrométrie de masse  Phase inverse Principe La phase stationnaire est apolaire (ex. : silice modifiée avec des chaînes alkyles, comme C18 ou C8). La phase mobile est polaire (ex. : mélange d’eau et de solvants organiques comme le méthanol ou l’acétonitrile). Mode d’interaction Les analytes apolaires interagissent fortement avec la phase stationnaire apolaire via des interactions hydrophobes. Les analytes polaires interagissent davantage avec la phase mobile et sont éludés plus rapidement. Ordre d’élution Les composés polaire sont éludés en premier. Les composés apolaires sont retenus plus longtemps. Exemple de phase stationnaire Silice greffée avec des chaînes alkyles (C18, C8, C4). Applications Analyse de composés apolaires ou semi-polaires (lipides, hydrocarbures, médicaments). Techniques les plus courantes en HPLC, car compatibles avec les échantillons biologiques et aqueux.  Chromatographie Liquide couplée à la spectrométrie de masse En chromatographie liquide haute performance (HPLC), deux modes principaux sont utilisés pour faire circuler la phase mobile dans la colonne : le mode isocratique et le mode gradient.  Mode isocratique La composition de la phase mobile reste constante tout au long de l’analyse ; Par exemple, un mélange de 60 % d’eau et 40 % d’acétonitrile est utilisé du début à la fin de la séparation. Convient pour les mélanges simples avec des composés de polarités proches.  Mode gradient La composition de la phase mobile change progressivement pendant l’analyse; Par exemple, on commence avec 80 % d’eau et 20 % d’acétonitrile, puis on passe à 20 % d’eau et 80 % d’acétonitrile sur une durée déterminée. La polarité de la phase mobile varie, permettant une meilleure séparation des composés de polarités différentes. Plus adapté pour des échantillons complexes, offrant une meilleure séparation et un gain de temps.  Chromatographie Liquide couplée à la spectrométrie de masse Détection et identification (MS) : Une fois les analytes séparés, ils sont dirigés vers la spectrométrie de masse via une source d’ionisation. Dans la source, les molécules sont converties en ions (chargés) et transférées dans l’analyseur de masse. L’analyseur mesure le rapport masse/charge (m/z) des ions, permettant l’identification et la quantification des composés. Production des Ions: Ionisation par électrospray (ESI - Electrospray Ionization) L’échantillon liquide est pulvérisé en gouttelettes chargées en présence d’une haute tension électrique. Les gouttelettes se fragmentent et se désolvatisent sous l'effet de la chaleur ou d’un flux de gaz, libérant des ions moléculaires. Les ions détectés sont souvent sous forme [M+H]+ ou [M−H]−, représentant un gain ou une perte de proton.  Chromatographie Liquide couplée à la spectrométrie de masse Ionisation en mode positif (gagner un proton : [M+H]+) Principe En mode positif, les molécules gagnent un proton (H+) pour devenir des ions chargés positivement. Cette ionisation est facilitée par la présence d’un solvant acide dans la phase mobile, tel que : Acide formique Acide acétique Trifluoroacétique (TFA) Réaction chimique Pour une molécule neutre M : M+H+→ [M+H]+ Conditions favorables La molécule doit contenir des groupes fonctionnels capables d’accepter un proton, tels que : Groupes amines (−NH2​) Groupes hydroxyles (−OH) Hétéroatomes riches en électrons (oxygène, azote). Un solvant acide favorise la disponibilité des protons dans la phase mobile. Exemple L’ionisation d'une molécule d’amine : R−NH2+H+→[R−NH3​]+  Chromatographie Liquide couplée à la spectrométrie de masse Ionisation en mode négatif (perdre un proton : [M-H]−) Principe En mode négatif, les molécules perdent un proton (H+) pour devenir des ions chargés négativement. Cette ionisation est facilitée par la présence d’un solvant basique ou d’un milieu faiblement acide. Réaction chimique Pour une molécule neutre M : M−H+→[M−H]− Conditions favorables La molécule doit contenir des groupes fonctionnels capables de perdre un proton, tels que : Groupes carboxyles (−COOH) Groupes phénols (−OH) Groupes thiols (−SH). Un pH basique dans la phase mobile facilite la déprotonation. Exemple L’ionisation d’un acide carboxylique : R−COOH→ [R−COO]−+H+  Chromatographie Liquide couplée à la spectrométrie de masse Une fois que les ions chargés quittent la source d'ionisation dans un système HPLC-MS, ils entrent dans le spectromètre de masse pour une analyse plus approfondie. Les ions sont séparés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) dans l’analyseur de masse à Quadripôle (En ajustant les tensions appliquées, seuls les ions d’un certain m/z traversent le quadripôle et atteignent le détecteur). Les ions séparés atteignent un multiplicateur d’électrons. Cette amplification produit un signal électrique proportionnel au nombre d’ions. Ce signal est converti en un spectre de masse. Le spectre de masse est une représentation graphique des ions détectés : Axe x : Rapport masse/charge (m/z). Axe y : Intensité relative (abondance des ions). Les informations fournies incluent : La masse moléculaire de l’analyte ([M+H]+ ou [M−H]−).  Chromatographie Liquide couplée à la spectrométrie de masse Schéma global du fonctionnement L’échantillon est injecté dans le système LC. Les analytes sont séparés dans la colonne chromatographique. Les analytes séparés sont transférés dans la source d'ionisation via l’interface. Les analytes sont ionisés et introduits dans l’analyseur de masse. Le détecteur enregistre les ions triés, produisant un spectre de masse.  Les Grandeurs physiques En chromatographie, plusieurs grandeurs physiques sont utilisées pour caractériser et analyser les performances du processus de séparation Temps de rétention (tR) Définition : Temps nécessaire pour qu'un analyte atteigne le détecteur après son injection dans la colonne. Unité : Secondes (s) ou minutes (min). Importance : Utilisé pour identifier les composés en comparant leur temps de rétention avec des standards. Temps mort (t0​ ou tM) Définition : Temps nécessaire pour qu’une molécule non retenue (ne subissant aucune interaction avec la phase stationnaire) traverse la colonne. Unité : Secondes (s) ou minutes (min). Importance : Sert de référence pour calculer des paramètres tels que le facteur de rétention.  Les Grandeurs physiques En chromatographie, plusieurs grandeurs physiques sont utilisées pour caractériser et analyser les performances du processus de séparation Facteur de rétention (de capacité) (k′) Définition : Rapport entre le temps passé par l’analyte dans la phase stationnaire et celui passé dans la phase mobile. Formule : k′=(tR−t0)/t0 = tR’/t0 Importance : Évalue l'efficacité de la séparation et la rétention des analytes. Facteur de sélectivité (α) Définition : Rapport des facteurs de rétention de deux analytes adjacents (le pouvoir de distinguer entre deux composés). Formule : α=k2′/ k1′ (k2′​>k1′​) α>1 colonne sélective α=1 tra=trb colonne non sélective Importance : Indique la capacité de la colonne à séparer deux composés proches en termes de propriétés physico-chimiques.  Les Grandeurs physiques En chromatographie, la largeur du pic peut être exprimée en termes de deux paramètres principaux : σ sigma (l'écart-type) et ω omega (la largeur totale du pic L'écart-type (σ) : Représente une mesure de la dispersion ou de l'élargissement du pic (disperson de l’analyte au cours de la séparation). Largeur du pic (ω) Largeur d’un pic chromatographique à une certaine hauteur (souvent mesurée à la base ou à mi-hauteur ω0.5).  Relation entre σ et ω Pour un pic gaussien, la largeur totale (ω0.5) et l'écart-type (σ) sont liés par la relation suivante : ω0.5=2.354⋅σ o La largeur à mi-hauteur (ω0.5) correspond aux points où l'intensité est 50% de la hauteur maximale. ω=4σ o Utilisée pour décrire la largeur totale du pic (ω) mesurée entre les points où l'intensité du pic descend à environ 13,5% de sa hauteur maximale (soit deux écarts-types de chaque côté de la moyenne) dans une distribution gaussienne idéale. Les points à ±2σ autour de la moyenne (μ) représentent environ 95,4% de l'aire totale sous le pic. Cela signifie que la majorité du pic est contenue dans cet intervalle. Largeur totale (ω) : Est mesurée entre ces deux points (μ−2σ et μ+2σ), donnant : ω=(μ+2σ)−(μ−2σ)=4σ  Les Grandeurs physiques Résolution (Rs) Définition : Capacité à séparer deux pics chromatographiques adjacents. Formule : Rs=2(tR2−tR1)/ ω 1+ ω 2​ tR1et tR2​ sont les temps de rétention, et w1​ et w2 sont les largeurs des pics. Importance : Rs​ supérieur à 1,5 est considéré comme une séparation complète. Nombre de plateaux théoriques (N) Définition : Mesure de l’efficacité de la colonne en termes de séparation. Formule : N=16⋅(TR2/ω2) ​ou N=tR2​/ σ2 Importance : Plus N est grand, plus la colonne est efficace.  Les Grandeurs physiques Hauteur équivalente à un plateau théorique (H) Définition : Longueur de colonne nécessaire pour atteindre un plateau théorique. Formule : H=L/N où L est la longueur de la colonne. Importance : Évalue l’efficacité de la colonne en fonction de sa longueur. Volume de rétention (VR) Définition : Volume de phase mobile nécessaire pour éluer un analyte de la colonne. Formule : VR=tR⋅D où D est le débit volumétrique. Unité : Millilitres (mL). Importance : Lié à la quantité de solvant utilisée pour la séparation. Volume mort (VM): Il représente le volume total de la phase mobile présente dans la colonne chromatographique. VM= tM.D tM​ : Temps mort (temps nécessaire pour qu’un composé non retenu traverse la colonne). D : Débit volumétrique de la phase mobile (mL/min).  Les Grandeurs physiques En chromatographie, plusieurs grandeurs physiques sont utilisées pour caractériser et analyser les performances du processus de séparation Débit (D) Définition : Volume de phase mobile passant par la colonne par unité de temps. Unité : Millilitres par minute (mL/min). Importance : Affecte directement les temps de rétention et la qualité de la séparation. D= u. S S : Aire de la section transversale de la colonne (cm2) u=​L​/t0 où : u : Vitesse linéaire de la phase mobile. L: Longueur de la colonne (cm). t0​ : Temps mort ou temps de rétention de la phase mobile (s). D=L. S/t0  Les Grandeurs physiques En chromatographie, plusieurs grandeurs physiques sont utilisées pour caractériser et analyser les performances du processus de séparation Relation de prunell (R) La relation de Prunell permet d’ajuster les conditions chromatographiques pour améliorer la séparation des analytes en jouant sur l’efficacité de la colonne (N), la sélectivité (α) et la rétention (k′). 𝑵 𝜶−𝟏 𝒌′ Rs= 𝟒 𝜶 𝟏+𝒌′ Lorsqu’on effectue une analyse chromatographique en maintenant α (sélectivité), k′ (facteur de capacité) et H (hauteur équivalente à un plateau théorique) constants, la résolution (Rs) dépend uniquement de la longueur de la colonne (L) 𝑳 N=L/H Rs= 𝟒 ∗ 𝐂𝐭𝐞 𝑯 Rs = 𝑳 * Cte