Streptococcus y Enterococcus Chapter 13 PDF

______________________________________________________ José González Cabeza. Cap. 13. Género Streptococcus y Enterococcus _________________________________ 2. CA...

______________________________________________________ José González Cabeza. Cap. 13. Género Streptococcus y Enterococcus _________________________________ 2. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL GÉNERO Streptococcus. Capítulo 13 El género Streptococcus incluye un grupo filogenética y fenotípicamente heterogéneo de GÉNERO: Streptococcus y bacterias que pueden ser frecuentemente encontrados parasitando a humanos y animales. Algunas especies pueden ser patógenas y otras comensales avirulentos que forman parte de la flora normal del tracto respiratorio y tracto genital, colonizando además piel y membranas Enterococcus mucosas. Las especies del género Streptococcus son bacterias anaerobias facultativas esféricas u ovales que miden menos de 2 m de diámetro. Mediante tinción de Gram se pueden observar 1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LA “FAMILIA STREPTOCOCCACEAE”. como cocos Gram positivos que se encuentran frecuentemente formando parejas o cadenas. Entre otras características importantes destacan su no movilidad, carecen de flagelos y no En los esquemas taxonómicos tradicionales la “Familia Streptococcaceae” incluye cocos forman esporas, además de que todas las especies reaccionan negativamente a la catalasa. Gram positivos, catalasa negativos que tienden a crecer en pares o en cadenas, los cuales se diferencian de la familia Micrococcaceae (Staphylococcus y Micrococcus) por cuanto estos últimos Las especies del género Streptococcus son bacterias relativamente fastidiosas, con son catalasa positivos. Sin embargo, estudios filogenéticos recientes cuestionan la posición requerimientos nutricionales que varían según la especie. La mayoría de las especies crecen taxonómica real de la “Familia Streptococcaceae” y han aumentado considerablemente los adecuadamente en medios nutritivos enriquecidos con sangre o suero. Algunas cepas requieren géneros y las especies relacionadas a Streptococcus. La mayoría de los géneros relacionados a de atmósferas elevadas en CO2 (5-10%), lo cual incrementa el crecimiento y la actividad Streptococcus tienen un metabolismo anaeróbico facultativo (Cuadro 13.1), en donde los géneros hemolítica. Luego de 18-24 horas de incubación a 35-37oC, las colonias aisladas miden de 0.3 a 2 Streptococcus y Enterococcus son importantes patógenos para el ser humano y animales. Algunos mm de diámetro, son opacas, blanquecinas, circulares, de bordes definidos y presentan hemólisis otros géneros muestran un metabolismo anaeróbico estricto, de los cuales, únicamente los variable. géneros Peptococcus y Peptostreptococcus se encuentran en infecciones en el ser humano. Algunas características diferenciales de estos géneros se indican en el cuadro 13.2. Algunas de las especies más frecuentemente asociadas a cuadros clínicos en seres humanos y animales se muestran en el cuadro 13.3, cuya clasificación en los diferentes grupos se basa en el análisis del RNAr 16S. Cuadro 13.1. Nomenclatura de los cocos Gram positivos, catalasa negativos, anaerobios facultativos o anaerobios estrictos. Cuadro 3. Ejemplos de especies asignados a los diferentes grupos del género Streptococcus basados en el análisis del ARNr 16S. Anaerobios facultativos Anaerobios estrictos Streptococcus Gemella Peptococcus Grupo Designación Especies Grupo de Lancefield Enterococcus Alloiococcus Peptostreptococcus I Grupo piogénico S. pyogenes A Aerococcus Vagococcus Ruminococcus S. agalactiae B Lactococcus Tetragenococcus Coprococcus S. equi C Leuconostoc Globictella Sarcina S. dysgalactiae C Pediococcus Helcococcus Varias especies G S. canis L,M S. porcinus E,P,U,V II Grupo S. bovis S. bovis, S equinus D,D Cuadro 13.2. Algunas características diferenciales de cocos Gram positivos. III Grupo S. mitis S. mitis, S. gordonii, No aplicable S. pneumoniae Género Metabolismo Catalasa Movilidad IV Grupo S. mutans S. mutans, S. sobrinus No aplicable Streptococcus Anaerobio facultativo - - V Grupo S. salivarius S. salivarius No aplicable Enterococcus Anaerobio facultativo - -/+ VI Grupo S.milleri S. anginosus, No aplicable Staphylococcus Anaerobio facultativo + - S constellatus Peptococcus Anaerobio estricto - - VII Otras especies S. acidominimus No aplicable Peptostreptococcus Anaerobio estricto - - S. suis R, RS,S,T Leuconostoc Anaerobio facultativo - - Pediococcus Anaerobio facultativo - - Los microorganismos de este género que son patógenos pueden encontrarse produciendo erisipela, fiebre puerperal, infecciones generalizadas, faringitis, piodermia estreptocócica (impétigo), endocarditis aguda y subaguda, infecciones fulminantes por estreptococos del grupo A, síndrome de choque tóxico, infecciones del sistema urinario, de vías biliares, enfermedad 179 180 ______________________________________________________ José González Cabeza. Cap. 13. Género Streptococcus y Enterococcus _________________________________ post-estreptocócica (fiebre reumática y glomerulonefritis), neumonías, sinositis, otitis, sangre. Particularmente, los patrones hemolíticos utilizados en la identificación de especies de bronquitis, bacteremias, meningitis e infecciones nosocomiales. Streptococcus y Enterococcus se han determinado usando eritrocitos ovinos o bovinos, los cuales pueden variar si se utilizan eritrocitos humanos, equinos o de conejo. 3. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL GÉNERO Enterococcus. 4.2. PRUEBA DE CAMP (Christie, Atkins Munch-Petersen) El género Enterococcus incluye a bacterias que son cocos Gram positivos que se La prueba de CAMP se utiliza para la identificación presuntiva de S. agalactiae (grupo B de encuentran solos o formando parejas o cadenas cortas similares a los Streptococcus, pero que Lancefield). En esta prueba se observa un efecto sinérgico que se produce al interactuar el factor pueden mostrarse en formas cocobacilares cuando son cultivadas en medios sólidos. Las CAMP producido por cepas de S. agalactiae con la hemolisina β de Staphylococcus aureus. especies de Enterococcus crecen a una temperatura óptima de 35oC, pero la mayoría de las Ambos son productos extracelulares que difunden en el medio de cultivo para producir dicho especies pueden crecer entre 10°C y 45oC, crecen en caldo tripticase soya (CTS) conteniendo 6.5% efecto en forma de flecha cuando se utilizan placas de agar sangre preparadas con eritrocitos de NaCl e hidrolizan la esculina en presencia de sales biliares. Algunas especies de Enterococcus ovinos o bovinos. Una vez inoculados, los medios de cultivo deben ser incubados a 35-37oC por son móviles. La expresión de un fenotipo hemolítico es altamente variable entre las diferentes 18-24 horas. especies de Enterococcus así como entre cepas de una misma especie. Por ejemplo, algunas cepas de E. faecalis son β-hemolíticas en medios con sangre de conejo o caballo, pero no hemolíticas en Algunos autores recomiendan no incubar las placas de agar sangre para la prueba de medio con sangre de oveja. CAMP en una atmósfera enriquecida con CO2 debido a un probable efecto inhibitorio sobre el sinergismo. Enterococcus es un grupo de bacterias muy resistentes que pueden sobrevivir en ambientes muy adversos lo que les permite encontrarse casi en cualquier parte de la naturaleza 4.3. PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE ESCULINA como en suelo, agua, alimentos, animales, aves e insectos. Diferentes especies de Enterococcus pueden encontrarse formando parte de la flora normal del tracto gastrointestinal y tracto Esta prueba se utiliza para la identificación presuntiva de Streptococcus del grupo D, como genitourinario del ser humano y muchos animales. Las especies clínicamente más importantes S. bovis y S. equinus, y de las especies de Enterococcus, todos los cuales dan esta prueba positiva. son E. faecalis y E. faecium, con frecuencias de aislamiento de infecciones por Enterococcus de 80- Esta prueba se realiza utilizando un medio llamado agar bilis-esculina, el cual contiene 4% de sales 90% y de 10-15%, respectivamente. Estas especies de Enterococcus son responsables biliares y 1% de esculina. La hidrólisis de la esculina resulta en la formación de glucosa y aproximadamente del 10% del total de las infecciones urinarias y del 16% de las infecciones esculetina. La esculetina en presencia de Fe3+ forma un complejo de color negro. Por lo tanto, las urinarias de origen nosocomial. Adicionalmente, las especies de Enterococcus son importantes en las infecciones intraabdominales o pélvicas y de bacteriemias, las cuales se presentan en bacterias que crecen en presencia de las sales biliares e hidrolizan esculina tornan el medio de pacientes inmunocomprometídos o con enfermedad grave que requieren de hospitalización color negro, generalmente en un periodo de incubación de 18-24 horas a 35-37oC. La presencia de prolongada. La bacteriemia puede llevar a endocarditis, en donde la especie E. faecalis es el crecimiento pero sin la formación del color negro se considera como una prueba negativa. agente más común en los casos de endocarditis por Enterococcus. 4.4. PRUEBA DE CRECIMIENTO (TOLERANCIA) EN 6.5% DE NaCl 4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN DE Streptococcus y Enterococcus. Esta prueba permite diferenciar las especies de Enterococcus (crecimiento positivo en presencia de 6.5% de NaCl) de los Streptococcus del grupo D (crecimiento negativo en presencia 4.1. ACTIVIDAD HEMOLÍTICA. de 6.5% de NaCl). El microorganismo en estudio se inocula en un caldo tripticasa soya conteniendo 6.5% de NaCl. Luego de un periodo de 18-24 horas a 35-37°C se observa la presencia La hemólisis observada en los aislamientos de Streptococcus y Enterococcus en diferentes o ausencia de crecimiento en el medio de cultivo. muestras clínicas es una de las primeras características sugestivas de posibles especies. Algunas especies muestran una hemólisis completa (hemólisis β) alrededor de las colonias en agar sangre, 4.5. PRUEBA DE RESISTENCIA AL OPTOCHIN como S. pyogenes, S. agalactiae (aunque algunos aislamientos aparecen como no hemolíticos), Streptococcus de los grupos C, F y G, así como algunas cepas de Enterococcus, aunque, como se La prueba de resistencia al optochin (hidrocloruro de hidrocupreína), permite la indicó anteriormente, el fenotipo hemolítico en Enterococcus es muy variable. Otras especies diferenciación de Streptococcus pneumoniae (sensible al optochin) de otros Streptococcus α- pueden mostrar una hemólisis incompleta (hemólisis alfa) alrededor de las colonias en agar hemolíticos como los Streptococcus del grupo viridans (resistentes al optochin). Para la realización sangre, incluyendo S. pneumoniae, Streptococcus del grupo D y del grupo viridans. de esta prueba el microorganismo en estudio debe ser inoculado densamente en una placa de agar sangre y sobre el inoculo se coloca un disco conteniendo optochin (rotulado con una P), el Al realizar la determinación de los patrones hemolíticos de los aislamientos de cual se presiona levemente para que se adhiera a la superficie del medio. Las placas de agar Streptococcus y Enterococcus es importante considerar que muchas de sus citolisinas sangre son posteriormente incubados a 35-37oC por un período de 18-24 horas en una atmósfera (hemolisinas) son lábiles al 02, por lo que las bacterias deben ser inoculadas dentro del agar para enriquecida con CO2. proporcionar un ambiente relativamente anaeróbico. Asimismo, los patrones hemolíticos varían grandemente dependiendo del tipo de eritrocito que se ha utilizado en la preparación del agar La mayoría de los discos conteniendo optochin disponibles comercialmente tienen un 181 182 ______________________________________________________ José González Cabeza. Cap. 13. Género Streptococcus y Enterococcus _________________________________ diámetro de 6 mm. Utilizando estos discos de 6 mm para la prueba de resistencia al optochin, un Hidrólisis de hipurato - + - resultado se considera negativo (susceptible) cuando el halo de inhibición mide al menos 14 mm Producción de PYR + - - de diámetro. Sin embargo, algunas pocas casas comerciales tienen a disposición discos Crecimiento en CTS + - V - conteniendo optochin de 10 mm de diámetro. En este caso, un halo de inhibición igual o superior 6.5% NaCl a 16 mm de diámetro se debe interpretar como un resultado negativo (susceptible). Hidrólisis de esculina en - - - presencia de billis 4.6. PRUEBA DE RESISTENCIA A LA BACITRACINA Solubilidad en bilis - - - a +, > o = 90% de las cepas dan un resultado positivo; -, > o = 90% de las cepas dan un resultado La prueba de resistencia a la bacitracina se utiliza para la diferenciación presuntiva de negativo; V 11-89% de las cepas dan un resultado positivo. Streptococcus β-hemolíticos del grupo A de Lancefield (S. pyogenes) de otros Streptococcus β- hemolíticos. S. pyogenes se muestra sensible a la bacitracina mientras que otros Streptococcus β- Cuadro 13.6. Características diferenciales de Streptococcus del grupo de Lancelfield D y de hemolíticos son generalmente resistentes a la bacitracina. Enterococcus. Para realizar esta prueba, el microorganismo en estudio se debe inocular densamente en Caracteristica Streptococcus S. pneumoniae una placa de agar sangre y sobre el inóculo se coloca un disco conteniendo 0.04 unidades de Grupo Viridans bacitracina (rotulado con una A), el cual se presiona levemente para que se adhiera a la superficie Hemólisis Alfa, ninguna Alfa, beta, ninguna del medio. Las placas de agar sangre son posteriormente incubados a 35-37oC por un período de Prueba de CAMP con S. aureus (β - - 18-24 horas en una atmósfera aerobia no enriquecida con CO2. La presencia de cualquier halo de –lisina) inhibición se considera como negativo (susceptible), mientras que el crecimiento bacteriano hasta Resistencia a bacitracina (0.04) + + el borde del disco se considera como positivo (resistente). Resistencia a optochin + + Resistencia a sulfametoxazol- + - Cuadro 13.4. Características preliminares para diferenciar los géneros Streptococcus y trimetoprin Enterococcus. Hidrólisis de hipurato - v Producción de PYR - + Característica Streptococcus Enterococcus Crecimiento en CTS + 6.5% NaCl - + Producción de leucina + + Hidrólisis de esculina en presencia + + aminopep tidasa (LAP) de billis Producción de pirrolidonil- - + Solubilidad en bilis - - arilamidasa (PYR) a +, > o = 90% de las cepas dan un resultado positivo; —.,> o = 90% de las cepas dan un resultado Hidrólisis de esculina V + negativo; v,11-89% de las cepas dan un resultado positivo. Crecimiento en CTS V + conteniendo 6.5% NaCl Cuadro 13.7. Características diferenciales de Streptococcus del grupo viridans y de Streptococcus Crecimieno a 10°C - + pneumoniae. Crecimiento a 45°C - + a + > 90% de las cepas dan un resultado positivo;- ¸ > o = 90% de las cepas dan un resultado Caracteristica Streptococcus S. pneumoniae negativo; v, 11-89% de las cepas dan un resultado positivo. Grupo Viridans Hemólisis Alfa, ninguna alfa Cuadro 13.5. Características diferenciales de Streptococcus de los grupos de Lancefield A (S. Prueba de CAMP con S. aureus (β– - - pyogenes), B (S.agalactiae), C, F y G. lisina) Resistencia a bacitracina (0.04) V V Caracteristica Grupo A Grupo B Grupo C,F y G Resistencia a optochin + - Hemólisis β β, ninguna β Resistencia a sulfametoxazol- - - trimetoprin Prueba de CAMP con S. - + - Hidrólisis de hipurato V - Aureus (β-lisina) Producción de PYR - - Resistencia a + - V Crecimiento en CTS + 6.5% NaCl - - bacitracina (0.04 U) Hidrólisis de esculina en presencia V - Resistencia a optochin + + + de billis Resistencia a - - + Solubilidad en bilis - + sulfametoxazol- +, > o = 90% de las cepas dan un resultado positivo; —.,> o = 90% de las cepas dan un resultado trimetoprin negativo; v,11-89% de las cepas dan un resultado positivo. 183 184 ______________________________________________________ José González Cabeza. Cap. 13. Género Streptococcus y Enterococcus _________________________________ 5. ACTIVIDADES PRÁCTICAS S. aureus Streptococcus-Enterococcus Día 1 Entrega de cultivos en placas de agar sangre. Describir la morfología colonial Realizar frotis y tinción de Gram. Describir la morfología microscópica. Realizar la prueba de catalasa, utilizando una cepa de S. aureus y una cepa de Enterococcus como controles positivo y negativo, respectivamente. Inocular una placa de agar sangre para evaluar la actividad hemolítica. Para esto, inocular una placa de agar sangre preparada con eritrocitos bovinos o equinos (rotulada como CAMP), y realizar varias hendiduras en el agar, de manera que posteriormente al período de incubación ocurra crecimiento por debajo de la superficie del medio. Inocular una placa de agar sangre corriente y procesar de la misma manera que la anterior. Incubar a 35-37oC en una atmósfera enriquecida con CO2. Inocular una placa de agar sangre para realizar las pruebas de resistencia a bacitracina y a optochin. Para esto, inocular densamente la placa de agar sangre con la correspondiente Inocular un tubo conteniendo caldo tripticasa soya con 6.5% de NaCl e incubar a 35-37°C bacteria. Colocar un disco conteniendo optochin (marcado con una P de por 18-24 horas. “pneumococccus”) y otro disco conteniendo 0.04 U de bacitracina (marcado con una A) Inocular un tubo conteniendo agar bilis-esculina e incubar a 35-37°C por 18-24 horas. sobre el inóculo, de manera que cada uno de los discos queden colocados hacia una mitad de la placa (ver la siguiente figura). Presionar levemente cada uno de los discos para que Día 2. se adhieran a la superficie del medio. Incubar a 35-37°C por 18-24 horas en una atmósfera enriquecida con CO2. Realizar la lectura de las pruebas inoculadas en el día 1. Realizar la identificación de las cepas utilizando los cuadros 4, 5, 6, 7. 6. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es la composición del agar bilis-esculina? ¿Cuál es la función de cada uno de sus componentes? P A 2. ¿Cuál es el mecanismo por el cual el optochin produce la inhibición del crecimiento en Streptococcus pneumoniae? Inocular una placa de agar sangre preparada con eritrocitos ovinos o bovinos mediante estría para realizar la prueba de CAMP. Para realizar esta prueba, la placa debe ser 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS inoculada en el centro por estría con una cepa de Staphylococcus aureus productora de la toxina β (esfingomielinasa). Perpendicularmente al inóculo de S. aureus se inocula por Madigan, M.; Martinko, J.; J. Parker – 2004 – BROCK BIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS. estría la especie de Streptococcus o Enterococcus, sin tocar el sitio donde se inoculó la Edit. Prentice Hall. 10ª Edic. 1011 pp. otra bacteria, tal y como se muestra en la siguiente figura. Posteriormente las placas González, N.; Torales, A y D. Gómez. – 2004 - INFECTOLOGÍA CLÍNICA PEDIÁTRICA. Edit. Mc Graw deben ser incubadas a 35-37oC por 18-24 horas. Hill. 7ª Edic. 1141 pp. Jawetz, E.; Melnick, J.; Adelberg, A. – 1997 - MICROBIOLOGÍA MÉDICA. Edit. Moderna. 18ª Edic. México. 476 pp. Joklik, W.; Willett, H.; Amos, B.; C. Wilfert – 1997 – ZINSSER, MICROBIOLOGÍA. Edit. 185 186 ______________________________________________________ José González Cabeza. _____________________________________________________ José González Cabeza Panamericana. 20ª Edic. Bs.As. 1696 pp. Liébana, J. – 2002 - MICROBIOLOGÍA ORAL. Ed. Mc Graw-Hill-Interamericana. 2ª Edic. Madrid. Capítulo 12 677 pp. MacFaddin – 2003 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA CLÍNICA. Edit. Médica Interamericana. 3ª Edic. Bs.As. Argentina 850 pp. Mims, C.; Playfair, J.; Roitt, I.; Derek, W.; Williams, R.; Anderson, R. – 1995 - MICROBIOLOGÍA GÉNERO Staphylococcus MÉDICA. Edit. Mosby / Doyma Libros. Gran Bretaña. Freeman, B. – 1983 - TRATADO DE MICROBIOLOGÍA DE BURROWS. Edit. Interamericana. 21ª 1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL GÉNERO Staphylococcus. Edición. México. 1119 pp. Pelczar, M.; Chang, R. – 1982 - MICROBIOLOGÍA. 2ª Edic. Edit. Mc Graw Hill. México. En el género Staphylococcus se incluyen bacterias Gram positivas que tienen una gran Vélez, H.; Rojas, W.; Borrero, J. y J. Restrepo – 2002 - FUNDAMENTOS DE MEDICINA: importancia en la medicina, tanto humana como veterinaria, por cuanto tienen la capacidad de ENFERMEDADES INFECCIOSAS. Edit. Corporación para Investigaciones Biológicas. 5ª Edic. causar una gran diversidad de infecciones en el ser humano y en los animales. S. aureus es el Colombia. 731 pp. prototipo del género y es reconocido desde hace decenas de años como un patógeno importante. Sin embargo, recientemente se ha involucrado el grupo de Staphylococcus coagulasa negativa en numerosas infecciones en seres humanos, tanto intra como extrahospitalarias, así como también en animales domésticos y salvajes. El diámetro de una célula individual de Staphylococcus es de 0.7 a 1.2 m. Típicamente, los Staphylococcus muestran una reacción positiva a la tinción de Gram. Sin embargo, células en cultivos viejos o ingeridas por fagocitos pueden mostrarse como Gram negativos. La clásica morfología de racimos de uva es más evidente en cultivos sobre medios sólidos. Esta morfología se origina debido a que los Staphylococcus se dividen en tres planos perpendiculares sucesivos y a que las células hijas no se separan completamente. En medios líquidos es posible observar cadenas cortas. Pero, a diferencia de los Streptococcus, los Staphylococcus raramente forman cadenas conteniendo más de cuatro células. Los Staphylococcus, son no móviles, carecen de flagelos y no forman esporas. Ciertas cepas tienen la capacidad de producir una cápsula extracelular de polisacáridos. La mayoría de las especies del género Staphylococcus son bacterias no fastidiosas que crecen relativamente bien en medios de cultivo sencillos como agar sangre, agar nutritivo, agar tripticasa soya y otros. Las colonias individuales de Staphylococcus crecidas sobre agar nutritivo son opacas, con bordes definidos, circulares, convexas y de 1 a 4 mm en diámetro. El clásico color amarillo (oro) de las colonias de S. aureus es debido a la presencia de carotenoides (aureus en latín significa oro). La pigmentación es usualmente aparente luego de 18-24 horas de incubación a 37oC, pero es más pronunciada cuando los cultivos son mantenidos a temperatura ambiente for 24-48 horas adicionales. Esta característica es pronunciada también por la presencia de monofosfato o monoacetato de glicerol en el medio de cultivo. La pigmentación no es producida durante el cultivo anaerobio o en cultivos líquidos. Por otra parte, existe una gran variación en cuanto a la pigmentación de las colonias, de un anaranjado profundo a blanco, entre las diferentes cepas de S. aureus o incluso entre colonias individuales de una misma cepa. Es importante destacar, sin embargo, que la pigmentación colonial no es una propiedad exclusiva de S. aureus, sino que está también presente en otras especies del género incluyendo a S. arlettae, S. chromogenes, S. haemolyticus y otras. Las especies de Staphylococcus son metabólicamente muy activas, por lo que generalmente no requieren la adición de nutrientes específicos. Su temperatura óptima de crecimiento es de aproximadamente 35-37oC aunque crecen también a temperatura ambiente. Los Staphylococcus son anaerobios facultativos y usualmente son productores de catalasa. Excepto por S. aureus subsp. Anaerobius y S. saccharolyicus, el crecimiento de los Staphylococcus es rápido y abundante bajo condiciones aeróbicas. Estos dos miembros del género Staphylococcus no son productores de catalasa y crecen mejor en condiciones anaerobias. 187 169 Cap. 12. Género Staphylococcus _____________________________________________ _____________________________________________________ José González Cabeza La morfología colonial es una ayuda muy útil que puede guiar a una identificación La cadena respiratoria de los Staphylococcus y de los Micrococcus difieren en la presuntiva de Staphylococcus. En medio no selectivos, como agar sangre, agar tripticase soya y composición de citocromos y menaquinona. La mayoría de los Staphylococcus contienen otros, la mayoría de los Staphylococcus producen colonias de 1-3 mm de diámetro en las primeras citocromos tipos a y b, mientras que los Micrococcus tienen los tipos c y d. Las especies S. 18-24 horas de incubación, alcanzando a veces hasta 8 mm de diámetro en incubaciones por 5 caseolyticus, S. lentus y S. sciuri contienen citocromos tipos a, b además de dos citocromos tipo días a 37oC. Algunas especies o cepas de Staphylococcus crecen muy lentamente en medios no c. selectivos y requieren hasta 36 horas de incubación para que las colonias se hagan visibles. Este es el caso de S. aureus subsp. anaerobius, S. saccharolyticus, S. auricularis, S. equorum y S. lentus. La mayoría de las colonias de S. aureus son relativamente grandes (> 5 mm de diámetro), lisas, 2. TAXONOMÍA. levantadas, pueden estar pigmentadas (desde amarillo oro hasta anaranjado) y producir hemolisinas que se detectan en agar sangre. Algunas cepas productoras de cápsula tienen una En el género Staphylococcus se incluyen actualmente 32 especies, cuyos nombres se morfología colonial mucoide. En agar manitol-sal, S. aureus y otras especies manitol positivas muestran en el cuadro 12.1. Algunas especies están constituidas por dos o más subespecies (ver producen colonias amarillas y el color amarillo se extiende sobre el medio de cultivo conforme cuadro 12.2.). difunde el ácido producido por las bacterias. Las colonias de S. epidermidis son relativamente pequeñas, alcanzando hasta 5 mm de diámetro, por lo general no son pigmentadas ni hemolíticas Cuadro 12.1. Especies que constituyen el género Staphylococcus. con el resto de la morfología colonial siendo muy similar a la de S. aureus. El resto de las especies de Staphylococcus muestran morfologías coloniales muy similares a las de S. aureus y S. S. aureus S. haemolyticus S. cohnii S. carnosus epidermidis con ligeras variaciones. S. epidermidis S. hominis S. xylosus S. piscifermentans S. capitis S. lugdunensis S. kloosii S. felis Los cocos Gram positivos aislados de muestras clínicas deben ser inicialmente analizados S. caprae S. schleiferi S. equorum S. intermedius por la producción de la enzima catalasa. Esta es una prueba muy sencilla pero fundamental para S. saccharolyticus S. muscae S. arlettae S. delphini distinguir dos grandes grupos: cocos Gram positivos, catalasa positivos que incluyen S. warneri S. auricularis S. gallinarum S. hyicus Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus y Stomacoccus, y cocos Gram positivos, catalasa S. pasteuri S. saprophyticus S. simulans S. chromogenes negativos con Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus y Planococcus entre otros. Como se S. caseolyticus S. sciuri S. lentus S. vitulus indicó anteriormente, las especies S. aureus subsp. anaerobius y S. saccharolyticus son catalasa negativa. Sin embargo, la producción de catalasa puede ser inducida en S. saccharolyticus por la adición de hemina en el medio de cultivo, pero no en S. aureus subsp. anaerobius. Cuadro 12.2. Especies de Staphylococcus que están constituidas por subespecies. Los Staphylococcus, a su vez, pueden ser diferenciados de los Micrococcus mediante las S. aureus S. aureus subsp. aureus, S. aureus subsp. anaerobius. pruebas de oxidasa y resistencia a la furazolidona y de los Planococcus y Stomacoccus por la S. capitis S. capitis subsp. capitis, S. capitis subsp. ureolyticus. prueba resistencia a la lisostafina. Es importante recordar, sin embargo, que ciertos S. cohnii S. cohnii subsp. cohnii, S. cohnii subsp. urealyticum. Staphylococcus pueden ser resistentes a la lisostafina debido a sustituciones en residuos de glicina S. schleiferi S. schleiferi subsp. coagulans, S. schleiferi subsp. schleiferi por L-serina o L-alanina en el interpéptido del peptidoglicano, como en el caso de S. epidermidís y en S. sciuri respectivamente. En caso de duda, se puede realizar la prueba de resistencia a la bacitracina, en la cual los Staphylococcus se muestran resistentes, mientras que Mícrococcus y El género Staphylococcus pertenece a la familia Micrococcaceae junto con los géneros Stomacoccus son sensibles. Adicionalmente las especies S. sciuri, S. lentus y S. caseolyticus Micrococcus, Stomacoccus y Planococcus. De los cuatro géneros indicados, únicamente tienen citocromos tipo c y son, por lo tanto, oxidasa-positivos. Sin embargo, estas tres especies Staphylococcus puede causar infecciones en el ser humano y en animales regularmente. Sin tienen poca importancia clínica. embargo, miembros de los otros tres géneros podrían ser eventualmente encontrados contaminando muestras clínicas mal tomadas o procesadas, o bien, en otro tipos de muestras La producción de coagulasa es una prueba esencial en la identificación de especies de no clínicas (alimentos, plantas). Las principales características de los géneros de la familia Staphylococcus patógenos causantes de infecciones agudas, como S. aureus (aislada de Micrococcaceae y de otros géneros de cocos Gram positivos se muestran en el cuadro 12.3. humanos y animales) S. intermedius y S. hyicus (aisladas de animales). Se han diseñado dos pruebas de coagulasa con diferencias importantes entre sí. La prueba de coagulasa en tubo o coagulasa libre detecta la producción de la enzima estafilocoagulasa, una proteína de 64 kDa con 3. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Staphylococcus actividad proteolítica. La estafilocoagulasa interactúa con la protrombina formando un complejo denominado estafilotrombina que convierte el fibrinógeno en fibrina. Esta enzima es producida Los Staphylococcus deben ser diferenciados inicialmente de otros cocos Gram positivos por S. aureus incluyendo S. aureus subsp. anaerobius, S. intermedius, S. delphini y por varias que pueden estar presentes en los mismos nichos así como en las mismas muestras clínicas, antes cepas de S. hyicus. La prueba de coagulasa en lámina o coagulasa fija detecta la producción de de continuar con la identificación hasta nivel de especie y/o subespecie. Diferentes propiedades una proteína localizada en la superficie de gran parte de las cepas de S. aureus (pero no de S. fenotípicas pueden ser utilizadas para realizar la diferenciación y/o identificación como la aureus subsp. anaerobius), así como también de S. lugdunensis, S. schleferi y de algunas cepas morfología colonial, producción de diversas enzimas, resistencia a ciertos antibióticos y la de S. intermedius, a la cual se le ha dado el nombre de “factor de agrupamiento” (en inglés presencia de rutas metabólicas para la utilización de diversos carbohidratos. “clumping factor”). Esta proteína de 21 kDa media la adhesión de esos Staphylococcus al fibrinógeno, lo cual provoca el “agrupamiento” de las bacterias al mezclarse con el plasma. 170 171 Cap. 12. Género Staphylococcus _____________________________________________ _____________________________________________________ José González Cabeza Obviamente, un resultado positivo de la prueba coagulasa en lámina no significa que la bacteria 4. ACTIVIDADES PRÁCTICAS sea productora de estafilocoagulasa. La mayoría de las cepas de S. aureus aisladas de infecciones de humanos son positivas tanto por la producción de la estafilocoagulasa como por la presencia Día 1. del factor de agrupamiento. Alrededor de un 3% de cepas de S. aureus estafilocoagulasa positivo son factor de agrupamiento negativo y un porcentaje similar son estafilocoagulasa negativo y Entrega de cultivos. factor de agrupamiento positivo. Estos porcentajes pueden aumentar hasta casi un 50% en cepas Inocular en una placa de agar sangre y en una de agar manitol-sal. A) Incubar la placa de de S. aureus aisladas de animales. Una variedad de plasmas pueden ser utilizados para realizar agar sangre a 35-37°C en jarra con vela por 18-24 horas. B) Incubar la placa de agar estas pruebas. Sin embargo, plasma deshidratado de conejo conteniendo citrato o EDTA se manitol-sal a 35-37°C por 18-24 horas. obtiene comercialmente y es adecuado para la identificación de S. aureus, S. intermedius y S. Realizar frotis y tinción de Gram. hyicus. El plasma humano es usualmente más satisfactorio para la identificación de S. lugdunensis y S. schleferi. El plasma humano no debe ser rutinariamente utilizado, a menos que se analice Día 2. cuidadosamente por su capacidad coagulante y por la presencia de sustancias que puedan inhibir la prueba (anticuerpos, antibióticos). Describir la morfología colonial en cada uno de los medios utilizados. Realizar frotis y tinción de Gram. En adición a las pruebas mencionadas anteriormente, una serie de propiedades Describir la morfología microscópica. metabólicas y actividades enzimáticas específicas pueden ser detectadas en especies de Realizar las pruebas de catalasa y oxidasa. Utilizar cepas de S. aureus y Enterococcus sp. Staphylococcus, las cuales son utilizadas en los esquemas de identificación. Entre estas pruebas se como controles positivo y negativo, respectivamente, para la prueba de catalasa, así como incluyen la producción de pigmentos y hemolisinas, crecimiento en condiciones anaerobias, la cepas de Micrococcus sp. y S. aureus como controles positivo y negativo, producción de enzimas como ureasa, termonucleasa, fosfatasa alcalina, ornitina descarboxilasa, respectivamente, para la prueba de oxidasa. β-galactosidasa, producción de acetoína, producción de ácido a partir de carbohidratos, Realizar la prueba de coagulasa utilizando plasma humano en un tubo 12 mm x 75 mm e resistencia a novobiocina y a polimixina B. En el cuadro 4 se muestran las reacciones bioquímicas inocular densamente con la bacteria. Incubar inmediatamente en baño maría a 35-37°C y otras características de especies de Staphylococcus clínicamente importantes. por 18-24 horas adicionales y realizar una segunda lectura. Utilizar cepas de S. aureus y S epidermidis como controles positivo y negativo, respectivamente. En el mercado se encuentran sistemas bioquímicos comerciales que identifican cierto Preparar una suspensión de la bacteria en solución salina estéril a una densidad de 0.5 número de especies de Staphylococcus, con una exactitud de 70 a más de 90% con simplicidad y MacFarland. Introducir un hisopo de algodón en la suspensión y escurrir el exceso de relativa rapidez. La exactitud de estos sistemas incrementará con el tiempo con mayores bases de inóculo contra las paredes internas del tubo. Utilizando el hisopo inocular en tres datos y con el desarrollo de pruebas más discriminativas. Los sistemas actualmente disponibles direcciones una placa de agar Mueller-Hinton. Usando pinzas colocar un disco de pueden identificar cepas de S. aureus S. epidermidis, S. capitis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, bacitracina (0.04 U) en el centro de la placa. Presionar el disco levemente para que se S. simulans y S. intermedius. Para ciertos casos es necesario realizar pruebas adicionales no adhiera al agar. Incube a 35-37°C por 18-24 horas. incluidas en los sistemas comerciales incluyendo la coagulasa, el factor de agrupamiento, la Inocular por estría un tubo de agar P conteniendo novobiocina (1.6 g/ml) e incube a 35- actividad ornitina descarboxilasa, crecimiento anaerobio en tioglicolato o resistencia a la 37°C por 18-24 horas. novobiocina. Si estas pruebas adicionales no son realizadas por el microbiólogo, la identificación Calentar en baño maría hasta ebullición un tubo de tioglicolato. Dejarlo enfriar a puede ser imposible para ciertas especies. Por ejemplo, en el sistema API-Staph Ident las cepas temperatura ambiente e inocular la bacteria hasta el fondo de los tubos. Incubar a 35- fosfatasa negativa de S. epidermidis se confunden con S. homínis. Para poder distinguir entre 37°C por 48 horas. ambas especies es necesario realizar la prueba de crecimiento anaerobio en medio de tioglicolato semisólido. El sistema de identificación API-Staph Ident consiste en una serie de pruebas Día 3. bioquímicas sobre una tira que son inoculadas con una suspensión de la bacteria, según las instrucciones del fabricante. Luego de una incubación de 18-24 horas a 35-37oC los resultados son Realizar la lectura de las pruebas a las 24 horas, según lo indicado, para las siguientes interpretados y el perfil bioquímico es convertido a un número de siete dígitos. Este número pruebas: Coagulasa, Crecimiento en anaerobiosis, Crecimiento en agar P conteniendo 1.6 corresponde a una especie o pequeño grupo de especies según la base de datos utilizada para la g/ml de novobiocina, identificación. El sistema automatizado de Vitek incuba las tarjetas inoculadas, realiza la lectura e 5. CUESTIONARO interpreta los resultados, y, con ayuda de su computadora programada, determina la identificación del microorganismo. El sistema Vitek puede proporcionar una identificación 1. Para que se utiliza la prueba de resistencia a la bacitracina en la identificación de preliminar en unas cuatro horas utilizando la tarjeta de identificación para Gram positivos. Los Staphylococcus?. programas de este sistema automatizado convierten los resultados en números que son comparados contra una base de datos. Este sistema puede realizar también determinaciones rápidas de susceptibilidad a los antibióticos además de la identificación del microorganismo. 2. Cuál es la utilidad práctica de la prueba de la resistencia a novobiocina?. 172 173 Cap. 12. Género Staphylococcus _____________________________________________ 3. Porque para las pruebas de utilización de carbohidratos para Staphylococcus se utilizan medios sólidos y no medios líquidos?. 4. Diseñe un flujograma para la investigación de Staphylococcus a partir de varios tipos de muestras. _____________________________________________________ José González Cabeza Cuadro 12.3. Características de Staphylococcus y otros géneros relacionadosª. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Género %G+C Metabolismo Movilidad Catalasa Oxidasa Resistencia a Lisostafina Furazolidona Bacitacina Staphylococcus 30-35 Anaerobio facultativo — + — — — + Madigan, M.; Martinko, J.; J. Parker – 2004 – BROCK BIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS. Micrococcus 66-75 Aerobio estricto — + + + + — Edit. Prentice Hall. 10ª Edic. 1011 pp. Planococcus 39-52 Aerobio estricto + + ND + — ND González, N.; Torales, A y D. Gómez. – 2004 - INFECTOLOGÍA CLÍNICA PEDIÁTRICA. Edit. Mc Graw Stomacoccus 56-60 Anaerobio facultativo — ± — + — — Aerococcus 35-40 Anaerobio facultativo — — — + — — Hill. 7ª Edic. 1141 pp. Streptococcus 34-46 Anaerobio facultativo — — — + — v Jawetz, E.; Melnick, J.; Adelberg, A. – 1997 - MICROBIOLOGÍA MÉDICA. Edit. Moderna. 18ª Edic. Enterococcus 34-42 Anaerobio facultativo — — — + — + México. 476 pp. Peptococcus y 33-37 Anaerobio estricto — — — ND ND ND Joklik, W.; Willett, H.; Amos, B.; C. Wilfert – 1997 – ZINSSER, MICROBIOLOGÍA. Edit. Peptostreptococcus ª Los géneros Staphylococcus, Planococcus, Stomacoccus y Micrococcus se incluyen dentro de la familia Micrococcacceae. Los géneros Panamericana. 20ª Edic. Bs.As. 1696 pp. Aerococcus, Streptococcus, Enterococcus, Peptococcus y Peptostreptococcus se incluyen en el cuadro, ya que pueden ser encontrados junto con Liébana, J. – 2002 - MICROBIOLOGÍA ORAL. Ed. Mc Graw-Hill-Interamericana. 2ª Edic. Madrid. Staphylococcus en muestras clínicas. 677 pp. En algunas especies, la catalasa puede ser activada por la adición de hemina. MacFaddin – 2003 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE A una concentración de 200 g/ml en agar Mueller-Hinton. Las bacterias resistentes (+) crecen en este medio, mientras que las sensibles no lo hacen. IMPORTANCIA CLÍNICA. Edit. Médica Interamericana. 3ª Edic. Bs.As. Argentina 850 pp. Utilizando discos conteniendo 100 microgramos de furazolidona en agar Mueller-Hinton. Las bacterias resistentes (+) no muestran halos de Mims, C.; Playfair, J.; Roitt, I.; Derek, W.; Williams, R.; Anderson, R. – 1995 - MICROBIOLOGÍA inhibición, mientras que las bacterias sensibles (-) tienen halos de inhibición de 10 a 25 mm. MÉDICA. Edit. Mosby / Doyma Libros. Gran Bretaña. Utilizando discos conteniendo 0.04 U de bacitracina en agar Mueller-Hinton.las bacterias resistentes (+) muestran halos de inhibición de 9 mm o Freeman, B. – 1983 - TRATADO DE MICROBIOLOGÍA DE BURROWS. Edit. Interamericana. 21ª menos, mientras que las bacterias sensibles (-) tienen halos de inhibición de 15 a 35 mm. Símbolos: +,90% o más de las especies dan reacción positiva, -, 90% o más de las especies dan una reacción negativa; +-, 90% o más de las Edición. México. 1119 pp. especies dan una reacción débil; ND, no determinado. Pelczar, M.; Chang, R. – 1982 - MICROBIOLOGÍA. 2ª Edic. Edit. Mc Graw Hill. México. Las especies S. caseolyicus, S. sciuri y S. lentus son oxidasa-positivas. Vélez, H.; Rojas, W.; Borrero, J. y J. Restrepo – 2002 - FUNDAMENTOS DE MEDICINA: ENFERMEDADES INFECCIOSAS. Edit. Corporación para Investigaciones Biológicas. 5ª Edic. Colombia. 731 pp. 175 174 Cap. 12. Género Staphylococcus _____________________________________________ _____________________________________________________ José González Cabeza Cuadro 12.4. Pruebas para la identificaciónª de especies de Staphylococcus con mayor importancia clínica. Cuadro 12.4. Pruebas para la identificaciónª de especies de Staphylococcus con mayor importancia clínica (continuación). Especie Pigmento Hemólisis Crecimiento Oxidasa Coagulasa Nucleasa Fosfatasa Ornitina Ureasa anaerobio Libre Fija alcalina descarboxilasa Especie β- Producción de NO3 → NO2 Resistencia a Novoboicina Resistencia a Polimixina S. aureus subsp. aureus + + + — + + + + — v Galactosidasa acetoína B S. capitis subsp. capitis — (v) (+) — — — — — — — S. aureus subsp. aureus — + + — + S. capitis subsp. ureolyticus (v) (v) (+) — — — — — — + S. capitis subsp. capitis — v v — — S. cohnii subsp. cohnii — (v) v — — — — — — — S. capitis subsp. ureolyticus — v + — ND S. cohnii subsp. urealyticum v (v) (+) — — — — + — + S. cohnii subsp. cohnii — v — + — S. epidermis — (v) + — — — — + (v) + S. cohnii subsp. urealyticum + v — + — S. haemolyticus v (+) (+) — — — — — — — S. epidermis — + + — + S. hominis v — — — — — — — — + S. haemolyticus — + + — — S. hyicus — — + — v — + + — v S. hominis — v v — — S. intermedius — v (+) — + v + + — + S. hyicus — — + — + S. kloosii v (v) — — — — — v — v S. intermedius + — + — — S. lugdunensis v (+) + — — (+) — — + v S. kloosii v v — + — S.saprophyticus v — (+) — — — — — — + S. lugdunensis — + + — v S. schleiferi subsp. coagulans — (+) + — + — + + — ND S.saprophyticus + + — + — S. schleiferi subsp. schleiferi — (+) + — — + + + — — S. schleiferi subsp. coagulans ND + + — ND S. sciuri v — (+) + — — — + — — S. schleiferi subsp. schleiferi (+) + + — — S. simulans — (v) + — — — — (v) — + S. sciuri — — + + — S. warneri v (v) + — — — — — — + S. simulans + v + — — S. xylosus v — v — — — — v — + S. warneri — + v — — (continúa) S. xylosus + v v + — ª Ver comentarios en el texto. (Continúa) Símbolos: +, 90% o más de las cepas dan reacción positiva; —, 90% o más de las cepas dan reacción negativa; ±, 90% o más de las especies dan ª Ver comentarios en el texto. una reacción débil; v, 11 a 89% de las cepas dan reacción positiva; ( ), reacción retardada; ND, no determinado. Símbolos: +, 90% o más de las cepas dan reacción positiva; —, 90% o más de las cepas dan reacción negativa; ±, 90% o más de las especies dan una reacción débil; v, 11 a 89% de las cepas dan reacción positiva; ( ), reacción retardada; ND, no determinado. 177 176 _____________________________________________________ José González Cabeza. Cuadro 12.4. Pruebas para la identificaciónª de especies de Staphylococcus con mayor importancia clínica (continuación). Producción Aeróbica de Ácido a partir de: ESPECIE Arabinosa Lactosa Maltosa Manitol Manosa Trehalosa Sacarosa Xilosa S. aureus — + + + + + + — subsp. aureus S. capitis — — — + + — (+) — subsp. capitis S. capitis — (v) + + + — + — subsp. ureolyticus S. cohnii subsp. — — (v) v (v) + — — cohnii S. cohnii subsp. — + (+) + + + — — urealyticum S. epidermis — v (+) — (+) — + — S. haemolyticus — v + v — + + — S. hominis — v + — — v (+) — S. hyicus — + — — + + + — S. intermedius — v ± (v) + + + — S. kloosii v (v) v + — + (±) (v) S. lugdunensis — + + — + + + — S.saprophyticus — v + v — + + — S. schleiferi — v — v + — v — subsp. coagulans S. schleiferi — — — — + v — — subsp. schleiferi S. sciuri v (v) (v) + (v) + + (v) S. simulans — + (±) + v v + — S. warneri — v (+) v — + + — S. xylosus v v + + + + + + ª Ver comentarios en el texto. Símbolos: +, 90% o más de las cepas dan reacción positiva; —, 90% o más de las cepas dan reacción negativa; ±, 90% o más de las especies dan una reacción débil; v, 11 a 89% de las cepas dan reacción positiva; ( ), reacción retardada; ND, no determinado. 178