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RESUMEN Las células sanguíneas (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) se forman en la médula ósea a partir de células pluripotentes, a través de un proceso finamente regulado. Una característica distintiva del sistema hematopoyético es que las células maduras poseen una vida media corta, de...

RESUMEN Las células sanguíneas (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) se forman en la médula ósea a partir de células pluripotentes, a través de un proceso finamente regulado. Una característica distintiva del sistema hematopoyético es que las células maduras poseen una vida media corta, de modo que la hematopoyesis es, necesariamente, un proceso continuo durante la vida. En mamíferos, el sistema hematopoyético comprende una jerarquía de células en donde la célula troncal hematopoyética o “stem cell”, es la base. En un individuo adulto, la célula troncal hematopoyética (CTH) reside en la médula ósea y es responsable del desarrollo de todos los linajes de células sanguíneas maduras, reflejando su pluripotencialidad, su capacidad de diferenciación, de proliferación y de auto-renovación. Estudios destinados a entender cómo la célula troncal pluripotencial es capaz de auto-renovarse, de desarrollar la capacidad de restricción de linaje y de adquirir las características de una célula terminalmente diferenciada, han permitido identificar un gran número de factores y genes los que interactúan en forma controlada y coordinada con la finalidad de mantener el desarrollo normal de la hematopoyesis. El microambiente en el cual las CTH y células progenitoras residen, otorga un entorno adecuado para el desarrollo de la hematopoyesis, proveyendo los factores y moléculas necesarias para la diferenciación, maduración y eventual emigración de las células a la circulación. Además de entender la regulación del sistema hematopoyético, el conocimiento de la biología de las CTH es de crucial importancia médica, debido a su enorme potencial en reemplazos o reparación de tejidos y eventualmente como vehículo en terapias génicas. En este capítulo se revisan los aspectos más importantes de la CTH, eritropoyesis, granulopoyesis, linfopoyesis y megacariopoyesis. 1. INTRODUCCIÓN 2.1. Histología Las células sanguíneas (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) se originan en la médula ósea mediante un complejo proceso de diferenciación y maduración celular. En este proceso denominado hematopoyesis participan varios factores de maduración. También es fundamental la participación de las moléculas de adhesión celular, presentes en las células hematopoyéticas, en las células del estroma y en la matriz extracelular. Este capítulo describirá los aspectos fisiológicos fundamentales de la hematopoyesis y de cada una de las líneas celulares en particular. La médula ósea está for mada por dos importantes compartimientos: vascular y hematopoyético (figura 1-1). 2. MÉDULA ÓSEA La hematopoyesis ocurre en la médula ósea a partir de la segunda mitad del embarazo y en el resto de la vida. La médula ósea se encuentra en la cavidad medular de los huesos largos (principalmente en las epífisis) y en los espacios existentes entre las trabéculas de los huesos esponjosos. Figura 1-1. Estructura general de la médula ósea. Se destaca el compartimiento vascular (arterias, venas y sinusoides) y el compartimiento hematopoyético. 46 Los vasos sanguíneos del compartimiento vascular forman un esqueleto estructural en la médula ósea. La sangre que ingresa a la médula ósea lo hace por las arterias nutricias que perforan la diáfisis a través de los agujeros nutricios. Estas arterias entran en la cavidad medular y dan origen a la arteria longitudinal central, desde la cual se generan pequeños vasos que irrigan tanto la médula como el hueso cortical. Las ramas dirigidas a la médula descargan su sangre a capilares, los cuales vacían en una extensa red de sinusoides. Los sinusoides (45 a 80 mm de diámetro) están compuestos por células endoteliales, una lámina basal y una capa externa de células reticular es; estas últimas cubren aproximadamente el 50% de la superficie endotelial. Estos sinusoides drenan en una vena longitudinal central, que a su vez descarga su contenido en venas que salen del hueso por el conducto nutricio. de migración transitorios (<4 µm de diámetro) que se forman en las células endoteliales de los sinusoides. El compartimiento hematopoyético está for mado por los islotes de células hematopoyéticas de las diferentes líneas celulares (serie eritroblástica, serie granulocítica, serie monocítica serie linfoide y serie megacariocítica), en sus distintos estadios madurativos. En células se ubican entre los sinusoides, y entre éstos y la cortical del hueso. Además de las células hematopoyéticas en la médula ósea también existen otras células que forman parte del denominado estroma medular. Entre ellas destacan: macrófagos, células reticulares y algunas células adiposas (figura 1-2). Estas células participan activamente en la regulación de la hematopoyesis secretando citoquinas y factores de maduración. Adicionalmente los macrófagos fagocitan núcleos expulsados por los eritroblastos ortocromáticos al madurar a reticulocitos, células alteradas y células muertas. El pasaje transendotelial de células maduras, desde el comportamiento hematopoyético a la sangre ocurre directamente a través de poros Figura 1-2. Estructura histológica de la médula ósea. La médula ósea está formada por vasos sanguíneos, sinusoides, células del estroma y células hematopoyéticas. Los distintos tipos de células se desarrollan en islotes hematopoyéticos ubicados a diferente distancia de la pared de los sinusoides, según el linaje celular. 47 Figura 1-3. Esquema de la Hematopoyesis. La célula madre pluripotencial autoperpetuable, da origen a una célula pluripotencial, también denominada CFU-ML (Unidad formadora de colonias mieloides y linfoides), de la que se originan: a) el progenitor mieloide (CFU-GEMM), a partir del cual por procesos de maduración y diferenciación se originan los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), monocitos, eritrocitos y plaquetas; y b) el progenitor linfoide (CFU-L), que después de un proceso de maduración y diferenciación, da origen a los linfocitos T y linfocitos B. Se muestra los puntos de acción de las citoquinas (IL-1, IL-3, IL-6 e IL-7) y factores estimuladores de colonias (CSF) específicos, que participan como factores reguladores de la granulopoyesis y linfopoyesis. EPO, eritropoyetina; TPO, trombopoyetina. Compartimiento de células madres. Las células madres o troncales (“stem cells”) representan menos del 1% de las células de la médula ósea. No son identificables morfológicamente, por lo que deben ser identificadas por el inmunofenotipo (CD34+, CD38-) y adicionalmente (CD90+, CD117+ y HLA-DR-), o ser estudiadas en cultivos in vitro. Entre los mecanismos de control que regulan las células troncales, destacan: células del estr oma medular, matriz extracelular (fibronectina, vitronectina, laminina, colágeno), moléculas de adhesión (integrinas, superfamilia de las inmunoglobulinas, selectinas), y citoquinas y factores de crecimiento. Actualmente existen varias fuentes de «stem cells»: médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical, hígado fetal y sistemas in vitro, siendo la sangre periférica y de cordón umbilical las más utilizadas actualmente en el tratamiento con células progenitoras. Las CTH (“stem cells”) también denominadas CFU-ML (Unidad for madora de colonias mieloides y linfoides) dan origen a dos líneas celulares principales, mieloide y linfoide (figura 1-3). En la línea mieloide, a partir de la CFUGEMM (granulocítica, eritroide, monocítica y megacariocítica) se producen dos diferentes CFU “encomendadas”, CFU-GM (granulocito, monocito) y CFU-MegE (megacariocito, eritroide); posteriormente se generan las CFUG, CFU-M, CFU-E, CFU-Meg. Compartimiento mitótico. A partir de las CFU de las líneas celulares específicas antes mencionadas, se generan las primeras células reconocibles morfológicamente de cada línea celular: mieloblasto en el caso de los 48 granulocitos, que posteriormente madurará a promielocito y luego a mielocito etapa en la cual se diferencian las tres líneas específicas de los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos). las CTH para diferenciarse a células sanguíneas maduras o a sus precursores. En general, los ensayos in vitro miden la actividad de células más maduras, y los in vivo, generalmente detectan la actividad de células más primitivas, siendo necesario el trasplante o injerto de las células a un ambiente adecuado para producir la progenie. Comportamiento de maduración almacenamiento. Las etapas posteriores de maduración de los granulocitos corresponden a juveniles, baciliformes y segmentados. Por su parte, la serie monocítica madura en las etapas de monoblasto y monocito. Ensayos in vitro Los sistemas de cultivo in vitro se pueden agrupar en dos categorías generales: los independientes de estroma y los dependientes de estroma: De la CFU-Meg, la línea megacariocítica se reconoce las etapas de megacarioblasto, megacariocito y plaquetas. En la serie eritr oblástica se reconocen las etapas, proeritroblasto, eritroblasto basófilo, eritroblasto policomatófilo, eritroblasto ortocromático, reticulocito y glóbulo rojo. a) Cultivo in vitro independiente de estroma. Entre los cultivos de este tipo está el ensayo de unidades de formación de colonias en cultivo (CFU-C) el cual detecta el crecimiento de células hacia una población más madura, comprometida al linaje eritroide o mieloide. Las colonias emergen luego de 5 a 14 días de cultivo en un medio semi-sólido, en presencia de uno o más factores de crecimiento. Una célula primitiva que posea potencialidad de multilinaje y un alto grado proliferativo en cultivo, es denominada una “célula formadora de colonias de alto potencial pr oliferativo” (“high proliferative potencial colony-forming cell”: HPP-CFC). En este caso, es posible observar colonias que se caracterizan por alcanzar un tamaño mayor a 0,5 mm de diámetro y por contener varias células de la línea mieloide. En la línea linfoide, a partir de la CFU-L, después de un proceso de diferenciación y maduración se originan los linfocitos B y linfocitos T; estos últimos requieren una etapa posterior de maduración en el Timo. 3. CÉLULAS TRONCALES HEMATOPOYÉTICAS 3.1. Definición de célula troncal hematopoyética Décadas de estudios funcionales realizados en ratones y últimamente en humanos, han contribuido a la definición conceptual de la célula troncal hematopoyética (CTH) como una población celular que reside en la médula ósea de un individuo adulto y que es responsable del origen de todo el espectro de células sanguíneas maduras. Cultivo in vitro dependiente de estroma. Un ensayo que se correlaciona mejor con la actividad de las CTH, es el cultivo dependiente de estroma por largos períodos de tiempo o “long-term culture initiating cell” (LTC-IC). Las células primitivas, cultivadas sobre una capa de células estr omales generan pr ogenie aproximadamente a las 12 semanas de cultivo, teniendo la precaución de remover células semanalmente para evitar su sobrecrecimiento. Esta alta capacidad de crecimiento es indicativa de la habilidad de auto-renovación continua que poseen las células primitivas. Tres propiedades características de la CTH son, su multi-potencialidad, su capacidad de autorenovación y de proliferación. Por lo tanto, una célula troncal hematopoyética puede ser definida como células clonogénicas que poseen la propiedad de renovarse a sí mismas, de proliferar y de diferenciarse hacia todos los tipos de células sanguíneas. Ensayos in vivo Uno de los ensayos in vivo ampliamente utilizado, es el de formación de unidades de colonias en bazo o “colony-forming unit-spleen assay (CFU-S), desarrollado en 1961 por Till y McCulloch, el cual se basa en el trasplante de células de médula ósea o de bazo en ratones irradiados letalmente. Luego de 8 ó 12 días, 3.2. Estudio de la célula troncal hematopoyética Con el propósito de comprender la biología de las CTH, se han desarrollado diversos ensayos tanto in vivo como in vitro. La mayoría de estos sistemas permiten estudiar la potencialidad de 49 los bazos de estos ratones se analizan para la detección de colonias, llamadas CFU-S8 y CFUS12, respectivamente. Estas colonias representan dos poblaciones diferentes de células, las que generaron las CFU-S8 son predominantemente uni-potenciales y están compuestas primordialmente de células del linaje eritroide y las CFU-S12 están compuestas por varios tipos de células mieloides, incluyendo eritrocitos, megacariocitos, macrófagos y granulocitos. depletan las células proliferantes de la médula ósea y enriquecen la población de células no proliferantes. A pesar de que esta estrategia enriquece la población de CTH y la actividad de CFU-S, la calidad de las células se ve afectada. Un avance importante para la separación de CTH se logró mediante la utilización de la citometría de flujo o “fluorescence-activated cell sorter” (FACS). Este método utiliza un flujo citométrico que separa células en base a sus características físicas tales como tamaño o granularidad y además, por la presencia de marcadores de superficie celular. Anticuerpos específicos, mar cados con moléculas fluorescentes, diseñados a reconocer proteínas de la superficie celular generan un patrón de fluorescencia por la incidencia de un rayo láser, permitiendo su identificación y subsiguiente separación. Un ensayo más riguroso para evaluar actividad de CTH es el ensayo de repoblación por largos períodos de tiempo o “long term repopulation assay” (LTRA), ya que requiere que las células a analizar posean los criterios que definen una CTH. Las células donantes son multipotenciales si generan células del linaje linfoide (B y T) además del mieloide; poseen capacidad de auto-renovación si son capaces de mantener su actividad por periodos de tiempo prolongados y además, poseen la habilidad de proliferar. Para la utilización de esta técnica fue necesario la identificación de proteínas que fueran expresadas específicamente en la superficie de la CTH. Uno de los primer os antígenos descubierto fue Thy-1 que se expresa en la superficie de las CFU-S de médula ósea de rata, hígado fetal y, en bajos niveles, en la médula ósea de ratón. En 1982, Muller-Sieburg y colaboradores desarrollaron una estrategia para la separación de CTH de ratón por FACS basados en un protocolo de selección negativa, en el cual utilizaron una mezcla de antígenos expresados en células B y T maduras, macrófagos y granulocitos. Combinando esta estrategia y la selección de células negativas para el antígeno de linaje (Lin neg) y con baja expresión de Thy-1 (Thy-1low), se obtuvieron CFU-S enriquecidas 200 veces. En este ensayo, las células troncales se trasplantan en ratones que han sido irradiados letalmente para depletar las células hematopoyéticas endógenas y se evalúan a las 8 a 10 semanas post-trasplante. Luego de este periodo se espera que haya ocurrido un reestablecimiento de la hematopoyesis con células provenientes de las CTH trasplantadas. La incorporación de marcadores celulares en las CTH donantes comprueba que las células hematopoyéticas generadas en el ratón receptor son efectivamente progenie de las células trasplantadas. El ensayo de re-trasplante de las CTH en un segundo animal puede ilustrar y cuantificar el proceso de auto-renovación, propiedad de CTH verdaderas. 3.3. Identificación y aislamiento de las células troncales hematopoyéticas En la actualidad, en ratón se aíslan CTH en base a fenotipos Sca-1pos, c-kitpos, Thy-1.1low, linneg, obteniéndose un enriquecimiento de 2000 veces para actividad de CTH. Una de las primeras aproximaciones utilizadas para aislar CTH de médula ósea se basó en técnicas de separación por densidad y tamaño. Ensayos de velocidad de sedimentación y centrifugación por gradientes de equilibrio demostraron que las células de CFU-S proliferantes poseen un tamaño que varía entre 7,3 a 9,2 µm de diámetro, en tanto que las células no proliferantes son de 7,0 µm de diámetro. Células troncales hematopoyéticas humanas se aíslan comúnmente en base a los marcadores de superficie CD34, CD38-, HLA-DR- y bajos niveles de Thy-1 y la ausencia del marcador de linaje Lin. Estas células poseen la capacidad de multilinaje en ensayos in vivo e in vitro (LTC-IC) y son capaces de mantener su propiedad de auto-renovación en ensayos de repoblación celular en un segundo huésped. Enriquecer la obtención de CTH es requisito para su estudio e identificación. Una de las estrategias empleadas utiliza drogas que intervienen en el ciclo celular (vinblastina, 5-Fluorouracil, etc.) que Funcionalmente, CD34 es importante en la adhesión de las células hematopoyéticas al estroma de la médula ósea y en la interacción entre progenitores. El antígeno c-kit es un 50 miembro de la familia de los receptores de tirosinas kinasas y el antígeno Sca-1(“stem cell activator”) y aunque su función no está totalmente esclarecida, aparentemente tendría una función en activación celular. quizás más útil funcionalmente considerar la célula troncal como aquella que es capaz de renovarse a sí misma y de diferenciarse en células hematopoyéticas maduras independiente de su grado de pureza. Este concepto de compartimiento de células troncales involucra una jerarquía de CTH con capacidad de auto-renovación y de multilinaje. Aunque estos marcadores son útiles para la identificación y purificación de CTH humanas y murinas, no se ha encontrado una molécula cuya expresión sea definitoria de célula troncal, como lo es por ejemplo, la expresión de globina en células rojas. Es así como la expresión de CD34, además de encontrarse en células troncales, se encuentra en endotelio vascular y en algunos fibroblastos y c-kit se expresa en algunas células hematopoyéticas maduras, tales como mastocitos, megacariocitos, linfocitos pre-B, melanocitos, algunas células germinales, cerebro, estómago y testículo. 3.5. División de las células troncales hematopoyéticas La generación continua de células sanguíneas maduras desde el “pool” de células troncales multipotentes, sin alteración del tamaño de éste, puede lograrse por división celular simétrica, asimétrica o ambas en cualquier nivel de la jerarquía hematopoyética. Una de las preguntas es cómo logra la CTH dividirse produciendo dos células hijas con diferentes destinos, y si es así, cómo regula esta asimetría. La asimetría puede resultar por procesos extrínsecos o intrínsecos (figura 1-4). En el modelo extrínseco, las células hijas son originalmente idénticas, pero adoptan difer entes destinos debido a factores ambientales como por ejemplo, citoquinas (figura 1-4A). En el modelo intrínseco, la célula hija difiere al momento de la división debido a una partición desigual de los determinantes del destino celular, tales como factores de transcripción, receptores celulares o RNA (figura 1-4B). En mamíferos, hay pocos ejemplos de 3.4. Heterogeneidad de las células troncales hematopoyéticas Las técnicas de aislamiento de CTH actuales no han permitido aún la obtención de células de suficiente pureza de modo que cada una de ellas sea capaz de repoblar el sistema hematopoyético de un ratón. Debido a esto, se ha incorporado el concepto de un compartimiento de células troncales que contiene CTH y además, una población de células multipotentes que pueden carecer de la propiedad de auto-renovación en forma permanente o continua. Utilizando un colorante fluorescente mitocondrial, rodamina-123 (Rho-123), se han identificado CTH con diferentes grados de fluorescencia que corresponden a células con distintas actividades de auto-renovación en ensayos in vivo e in vitro, pero capaces de mantener un cierto grado de multilinaje. De estos estudios se deduce que las CTH que mantienen una extensa capacidad de regeneración constituyen, probablemente, menos de un 0,01% de las células de la médula ósea, con una frecuencia de aproximadamente 1 CTH por 10.000 células de la médula. La habilidad de estas células de regenerarse en forma prolongada estaría dado por la gran capacidad proliferante de ellas. Esta capacidad per mitiría que la CTH cumpla con la extraordinaria función de producir células sanguíneas durante toda la vida de un individuo. Figura 1-4. Modelos de división simétrica versus asimétrica en células troncales hematopoyéticas. División celular simétrica (A), la cual puede dar como resultado dos células troncales hijas (gris) o dos progenitores de linaje restringido (blanco). En este modelo, la célula progenitora debe poseer la capacidad de auto-renovación para permitir la expansión de un linaje determinado (B) Modelo en que todas las divisiones son asimétricas; este modelo no permite un aumento del tamaño del “pool” de células troncales. En trasplantes de médula ósea, para propósitos terapéuticos, es preciso determinar lo que constituye una CTH verdadera, sin embargo, es 51