Gesamtzusammenfassung aller 10 Vorlesungen vom Teilbereich Mikrobiologie PDF

lOMoARcPSD|22121835 Gesamtzusammenfassung aller 10 Vorlesungen vom Teilbereich Mikrobiologie Grundlagen der Mikrobiologie und Hygiene (Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn) Scan to open on Studocu Studocu is not sponsored or endorsed by any college or university Downloaded by purma firewol...

lOMoARcPSD|22121835 Gesamtzusammenfassung aller 10 Vorlesungen vom Teilbereich Mikrobiologie Grundlagen der Mikrobiologie und Hygiene (Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn) Scan to open on Studocu Studocu is not sponsored or endorsed by any college or university Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Fach: Mikrobiologie und Hygiene Teilbereich: Mikrobiologie. Zusammenstellung aller Vorlesungsinhalte WS18/19 Themenüberblick: - Vorkommen Größe, Morphologie, Aufbau Beweglichkeit, Taxis Wachstum und Vermehrung Differenzierung Zellzahlbestimmung Genetik Vielfalt des Stoffwechsels Stickstoffkreislauf Pathogene Mikroorganismen Vorlesung 1: Bedeutung von Mikroorganismen - Krankheitserreger Nahrungsmittelproduktion Abwasserreinigung Bodensanierung Abluftreinigung Feinchemikalienherstellung Gründüngung Biogasproduktion Feinchemikalienherstellung: die meisten Chemikalien werden synthetisch hergestellt, da die natrülich vorkommenden Rohstoffe sonst nciht ausreichen würden. Bsp. Zitronensäure wird durch Pilze hergestellt Gründüngung: Stickstofffixierende Bakterien spielen hierbei große Rolle Vorkommen von Mikroorganismen (=MO’s): - auf Haut ( + ) - Oberflächen ( - ) -> praktisch überall Biogasproduktion: aus Reststoffen entsteht Metan in abgeschlossenen Tanks. Beispiel Mengen: - im Boden gibt es ca 10 9 MO/g - in Seen: 10 6 - 10 7 MO/ml - im Meer: 10 5- 10 6 MO/ml -> etwas weniger, weil hoher Salzgehalt das Leben erschwert - auf der Haut: 10 3 MO/ cm ² - im Darm (Dickdarm): 10 12 MO/ g -> Sehr hoch! Im Vergleich besteht der Mensch zur Hälfte aus menschlichen und zur Hälfte aus Bakterienzellen. Wichtig für: - Verdauung. ( + ) -> Kann man durch Antibiotikabehandlung zerstören und hat dann fatale Folgen für den Körper - Lebensmittelproduzenten (z.B Schimmelkäse) aber auch Kontaminanten ( - ) --> Hauptsächlich profitieren wir also von MO’s! Mehr als sie schaden! 1 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Definition von Mikrobiologie: Organismen, die mit dem bloßen Auge nicht erkennbar sind. van Leeuwenhoek entwickelte 1680 die erste Linse, durch die man Mikroorganismen sehen konnte. Replikat des van Leeuwenhoek Mikroskops van Leeuwenhoeks Zeichnungen beobachteter Bakterien menschlichen Blutausstrich fotografiert durch das oben abgebildete Mikroskop aus: Brock, Biology of Microorganisms, 2000 Vergleich von Biomasseanteil C (Kohlenstoff): N (Stickstoff): Pflanzen und Prokaryoten 560 Pg 350-550 Pg 12-20 Pg 85-130 Pg Pg = “Peta” = 10 15 auf der Erde: -> Vergleichbar großer Anteil Untersuchung von extremen Standorten auf der Erde und lebenwesen, die dort überleben, ist interessant für die Forschung des Alls. Extreme Standorte/Habitate, die besiedelt sind durch MO’s: psychrophil strahlenresistent thermophil anaerob halophil - thermophile MO: wärmeliebend. besiedeln z.B. vulkanische Zonen, heiße Tiefseequellen. Wachstum von MO’s bei 82-110 Grad, bekannte Spezies: “ Pyrodichium occultum” - anaerob: also ohne Sauerstoff. MO’s für die Sauerstoff toxisch ist! Vorhanden z.B. in abgeaschlossenen Gäranalgen für Metangasbildung. - strahlenresistente MO’s: Restistent gegen Gammastrahlen. Spezies: “ Deinococcus” - psychrophil: kälteliebend. Kälteanpassungen von MO’s an z.B Permafrostgebiete. Dort gibt es Wasser mit 16 % NaCl Gehalt, welches noch bis zu -12 Grad flüssig ist. In diesen aufgesalzenen Gewässern leben MO’s. Interessant ist z.B. der Don Juansee, welcher eingeschlossen unter der Antarctika ist und daher abgeschlossen von Umwelteinflüssen ist. Dort gibt es keine Kontaminierungen -> biologische Besonderheit. lebensraum-24 bis -3 Grad. 2 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 - halophil: salzliebend. Es gibt MO’s die leben in Gewässern mit 30 % NaCl Gehalt, genannt “Halobacterium” - extreme pH-Werte: 0-11. MO’s leben teilweise in sehr saueren Millieus. “Acidithiobacillus” setzt Schwefel in Schwefelsäure um und lebt in diesem pH-Bereich. “Picrophilus” wächst bei pH 0 und 65 Grad -> wächst tatsächlich in konzentrierter Schwefelsäure. - Es gibt bisher keinen bekannten Organismus der in pH 12-14 Bereich lebt. Links: Pyrodictium occultum, Wachstum bei 112°C Rechts: Mikroorganismen aus 120°C Habitat links: Salzkristalle gefärbt durch Halobacteria Unten links: Haloarcula japonica Unten rechts: Haloquadratum walsbyi Kristall mit eingeschlossenen Bakterien, die rote Färbung hervorrufen. viereckige Spezies! 24 Warum sind wir im Vergleich zu MO’s so schlecht angepasst? -> MO’s haben 2 Milliarden Jahre Entwicklungsvorsprung, da sie schon viel früher da waren! 3 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 nur der kleine grüneingekreiste Bereich sind Spezies mit Zellkernen. Also Eukaryoten (Pflanzen, Tiere, Menschen). Der großteil der existierenden Organismen sind also Prokaryoten!! Coprinus Homo Cryptomonas Zea Paramecium 26 Vorlesung 2: Größenordnungen der MO’s: 750 µm Thiomargarita namibiensis 300 µm Epulopiscium fishelsoni 30 µm Achromatium oxaliferum 7 µm Saccharomyces cerevisiae 2 µm Escherichia coli 0,35 µm Pockenvirus 0,03 µm Poliovirus - Viren sind die kleinsten - Größter Virus ist der Pockenvirus. - Für die selbstständig autonomen Bakterien sind 0,5 Mikrometer die minimalste Größe. Sonst kann man Zellkompatimente nicht unterbringen. - Achromatium oxaliferum: besitzt Schwefelkügelchen - Das größte ist Thiomargarita namibiensis: erst vor 20 Jahren entdeckt in Küstensediment. Organismus hat Schwefeleinlagen. Große Vakuole mit drumherum Cytoplasmamembran. Organismus ist nur so groß wegen der großen Vakuole. Viel Vakuole, wenig Zelle. - Größtes Lebewesen der Welt: ein Hallimasch Pilz 4 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Vorteil von dem kleinen Organismus: größeres Oberflächen/Volumen- Verhältnis. Je größer das Verhältnis, desto besser die Versorgungslage. http://www.mun.ca/biology/singleton/Topic%205/dTheProkaryotes.htm Nadelspitze mit Bakterien. Guter Größenvergleich Pflanzenzelle vs. Bakterienzelle Eukaryotische Zelle (Pflanze) Eukaryotische Zell: - Mit echten Zellkern! 5 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Prokaryoten = zelluläre Lebewesen, die keinen Zellkern besitzen = Bakterien, Viren.. -haben keinen Zellkern. Sie haben nur einen Bereich, indem sich die DANN anhäuft. - Enzyme etc schwimmen frei im Cytoplasma vorhanden. Keine lokale Organisation - keine membranumschlossenen Organellen, - einfachere Genome; Genomgröße liegt zwischen 0,5-8,0 MB („Megabasen“) - Plasmide (dort sind Enzyme codiert); Plasmide sind 1-200 kB („kilobasen“) groß. Um ein Enzym zu codieren braucht es ca. 1kB. Also passen auf ein Plasmid ca 200 Enzyme. Vergleiche: der Mensch hat 3000 MB - Kleinere Zellen: 0,5 – 5,0 microMeter (Vergleich: Eukaryonten: 10-100 micrometer) - Unterschiede in der DNA-Replikation, Proteinbiosynthese - Zellwandaufbau ist anders 6 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Die Morphologie der MO’s Micrococcus lysodechticus Kugelform kommt am meisten vor. staphyle = Traube auf Griechisch. Organismus heftet traubenförmig aneinander. Staphylococcus aureus 7 Escherichia coli http://www.ulb.ac.be/science s/biodic/EPageImages.html Stäbchenform Korkenzieherform (spirillum) Rhodospirillum photometricum Quelle: Brock, 2000 8 Chloroflexus aurantiacus langezogene Filamente, auch Stäbchen http://www.jgi.doe.gov/JGI_microbial/html/chlorofl exus/chloro_homepage.html Helle Punkte innerhalb der Zelle sind Endosporen. Sind besonders Resistenz gegen Umwelteinflüsse. Bacillus cereus http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/shape.htm 9 7 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Rhodomicrobium mit Fortsätzen. Dienen zur Oberflächenanheftung Anabaena, mit Heterocyste und Akineten Quelle: The Prokaryotes, online Quelle: The Prokaryotes, online Magnetospirillum gryphiswaldense Quelle: Schüler, 1999 10 „Magnetospirillum “ -> Magnetimus. Hat schwarze Kettenförmig angeordente Metallpartikel im Organismus. Funktioniert wie eine Kompassnadel. Vorkommen in marinen Habitaten. Kompassnadel richtet sich so aus, dass der Organismus automatisch in die Richtung zum Sediment schwimmt. Dort lebt er. photosynthetisch aktives Bakterium. „blau Alge“. haben sich zu langen Ketten zusammen geschlossen. Zellverbund. Aber einzelne Zellen übernehmen spezielle Aufgaben. Zelle in der Mitte ist dafür da Stickstoff zu fixieren. Diese Zellen tauschen sich gegenseitig aus und betreiben Arbeitsteilung. Heterozyste nennt man die spezialisierte Zelle. Aufbau der Zellhülle Zellhülle: 1) Cytoplasmamembran, Doppelschichtmembran. Besonderes Merkmal: als Bestandteil sind Fettsäuren eingebaut. (Lippiddoppelschicht: hydrophil außen, hydropphob nach innen gewandt). Phospholipid: Rückgrat besteht aus einem C 3 Körper. (Zeichnung 1 ) 2) Zellwand: mechanischer Schutz der Zelle. Bei Eukaryoten findet man dort in der Zellwand: Cellulose, Chitin Bei Prokayoten findet man Peptidoglycan (auch genannt „Murein“) 3) Äußere Membran: bzw. Lipopolysaccharid-Schicht, kurz LPS. E.Coli O157 H7 (bestimmter Erreger: e-Hekt-Erreger). Immunsystem erkennt Zuckerkette und weiß daher welches Bakterium es ist. Daher ist es wichtig für die Bakterien, dass ihre Zuckerketten so variable sind, so können sie sich tarnen. 4) Kapseln, Schleime, -> Polysaccharide: 5) Fimbrien (Pili), Proteinröhren: Dienen z.B. zur Anheftung an Oberflächen 8 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Zeichnung 1: Lippiddoppelschicht fluid = sozusagen eine zweidimensionale Flüssigkeit. Nicht fest, nicht flüssig. Wichtig für beweglichkeit und weil dort sich gelöste Ionen etc befinden. 9 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Stärke: Alpha,1-4-Glycosidische Bindung. Ist leicht wieder abzubauen, was bei Stärke wichtig ist. Bei Cellulose muss diese Bindung fester sein. sehr variabel Im Grundsatz sind die Zellwände immer gleich aufgebaut bei Bakterien, aber je nach Bakterium wird etwas varriiert. zu Punkt 3 der Auflistung: (S.5) oben diese Röhren sind eine Peptidoglycanschicht Hier: außerhalb der Zellwand liegt noch eine äußere Membran! 11 15 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Gram-Färbemethode: zum Sichtbarmachen der Bakterien. Besondere Farbe eingesetzt. Ergebnisse: Gram-negative Zellen sind Zellen, die den Farbstoff verlieren. Gram-negative Bakterien haben daher (Faustregel, gibt aber auch Ausnahmen) eher dünne Zellschicht, gram-positive haben eher mächtige Zellwand. o-Spezifische Seitenketten = Zucker, die nach außen gerichtet sind. In allen verschiedenen Varianten. (Das ist der Teil, den die Bakterien variabel gestalten können um nicht vom Imunsystem erkannt zu werden) Beim Kernpolysaccharid Teil: genau festgelegt, sehr wichtig für gram-negative Bakterien. Lipid Teil A: 3-Hydroxyfettsäure Existiert nur in dieser äußeren LPS Membran. Testes man die Bakterien und findet dieses Molekül, so ist das die Bestätigung für eine äußere Membran. LPS-Struktu: toxisch für die meisten Menschen. Teilweise starke Allergien. Toxisch sit nur der Lipid-A Teil. Endotoxisch = weil bestandteil der Zelle ansich! Tuschepräparate von Kapsel-bildenden Bakterien Kapsel: Grenze ist sehr deutlich zur Umgebung. (Zu Punkt 4 der Auflistung S.5) oben links: Amoebobacter roseus, rechts: Azotobacter chroococcum links: Bacillus megaterium Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 12 lOMoARcPSD|22121835 Zu Punkt 5) der Auflistung S.5: Haarige Strukturen. Zur Anheftung an den Wirt. Durch Pilus kann auch DNA von einer zur anderen Zelle gegeben werden. Vorgang: „Konjungation“ = weitergabe der DNA. oben: Escherichia coli Pilus mit Viruspartikeln sichtbar gemacht, Zellgröße ca. 0,8 µm links: Salmonella typhi Zelle mit Flagellen und Fimbrien, Zellgröße ca. 0,9 µm Flagellen dienen zur Fortbewegung aus: Brock, 2000 Vorlesung 3: Flagellendarstellung im Transmissionselektronenmikroskop, im Dunkelfeldmikroskop und im Phasenkontrastmikroskop Aus: Brock 2000 Fimbrien = Proteinanker. Zum Anheften an Wirtsgewebe Flagellen = Geißeln, dienen der Fortbewegung Bakterien mit einer Flagelle oder Bakterien mit rundherum gelegenen Flagellen. Diese Flagellen bewegen sich synchron. Tafelanschrieb: Bewegung von Bakterien, bzw. Taxis, also gerichtete Bewegung - Bewegung mit Hilfe der Flagellen : peritrich. - Taxis: gerichtete Bewegung. Bespiel: Chemotaxis, also Taxis entlang eines chemischen Gradienten. Zum Beispiel ein Lockstoff für die Bakterien. Bewegen sich zum Zucker oder zu Aminosäuren hin. Bewegen sich auf hohe Konzentration zu. Kann auch andersherum gehen: Negative Chemotaxis, z.b durch Schreckstoffe wie Schwermetalle oder Ethanol. Dann bewegt er sich in Richtung abnehmender Konzentration. Bakterien nehmen einen zeitlichen Gradienten wahr. Sie bewegen sich durch eine Flüssigkeit und nehmen die Unterschiede wahr. - Phototaxis: Bakterien bewegen sich auf eine Lichtquelle zu. - Aerotaxis: Bewegen sich in Richtung eines Sauerstoffgradienten. 13 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Video von sich bewegenden Baktrienzellen. Beobachtung: Lauf der Bakterien und Richtungsänderung: Laufen in eine Richtung, kurzes Verharren, dann plötzliche Richtungsänderung. Scheinbar wahllos. -> Laufrichtung kann also geändert werden. Flagellenbündel schlägt koodiniert. Dann schlägt es kurz auseinander und bewegt sich dann koordiniert weiter. Rutierende Bewegung machen Flagellen, nicht schlagende Bewegung. Normale Drehrichtung: Drehen alle gegen den Uhrzeigersinn. Richtung ändert sich manchmal kurzzeitig und geht dann wieder gegen den Uhrzeigersinn. -> Erkenntnis: Rotierende Bewegung kann Richtung ändern. Aufbau der Flagelle Bei gram-positiven Bakterien fehlt der äußere Ring, da die ja keine LPS Schicht haben 14 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Aufbau des Flagellenmotors aus: Brock Mikrobiologie, Pearsons Studium 7 Membran hat einen Protonengradient. Wird genutzt für Arbeit. Protonen fließen entlang des Protonengradiens über die Motorproteinen zurück in die Zelle. Ring wird in eine Drehbewegung versetzt, da Protonen dort vorbei laufen. Ladungsabstoßung.. 0,00017 km/h Geschwindigkeit eines Bakteriums, klingt wenig ist aber ca 60 Körperlängen pro Sekunde. Das ist also sehr schnell. Bakterien Zelle wäre in Relations gesetzt 3 mal schneller als ein Gepard. Wie Beobachtung im Film! Richtungsänderung bei peritrich begeißelten Zellen Wechsel zwischen Laufen und Taumeln: Lauf-Taumel-Verhalten. Ausrichtung nach Taumeln ist rein zufällig! Schwimmen, Bewegung: Flagellen schlagen gegen den Uhrzeigersinn. Innehalten, Taumeln: Flagellen schlagen mit dem Uhrzeigersinn 15 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Unten: Chemotaxis bei einem peritrich begeißeltem Bakterium Bewegung zu der Konzentration hin, dauert länger als bei uns. Alles in allem ist es aber eine Bewegung zum Lockstoff hin. Wenn Bakterium merkt, dass die Konzentration abnimmt, wird Taumelreiz schneller ausgelöst. Dadurch nähert es sich kontinuierlich der höheren Konzentration, wenn auch nciht auf direktem Wege. Kapillartest zum Nachweis chemotaktischen Verhaltens Test zur Feststellung ob etwas positiv chemotaxisch ist oder negativ. Konzentration innerhalb der Kapillare ist nach einiger Zeit höher, also ist es ein Lockstoff. Positiv-chemotaxisch (“Lockstoff ”) wären zum beispiel Zucker oder Aminosäuren, die Bakterien würden sich danna uf die Konzentration zu bewegen. Etahnol (“Schreckstoff ”) dagegen führt dazu, dass die Bakterien sich von der hohen Konzentration weg zu einer niedrigeren bewegen. Wachstum und Vermehrung von Bakterien = Zellzahl vermehrt sich Bestandteile eines Bakteriums: - Wasser (sehr wichtig! Bewegen sich dort drin) - Kohlenstoff. 50 % Trockengewicht, als Energiequelle - Stickstoff 12 % in TG, ->in Aminosäuren, Nukleinsäuren. Zum Beispiel Amoniumsalz als Stickstoffquelle (NH4+) oder auch NO-3, aber eher selten, weil es erst umgebaut werden muss von Bakterie Ausnahme N2 -> absolute Spezialisten, können den Stickstoff direkt verwerten -Phosphat 3% der TG eines Bakteriums. Z.B. Bestandteil von ATP. Phospholipide. Wenn man Wachstum fördern will, dann gibt man z.B. KH2PO4 in das Medium oder Po4 3+ - Schwefel 1 % der TG, ist in Cystein z.B. vorhanden. Zugabe als Sulfat: So4 2-, - Kalium 1 % TG, wichtig für den Turgordruck der Zelle. - Magnesium 0,5 % der TG, zur Stabilisierung von z.B. Ribosomen. - Calcium 0,5 % TG - Eisen Alles andere sind Spurenelemente und reichen als Konzentrationen im normalen Wasser, braucht man nicht extra dazu geben. Was muss in einem Medium drin sein, damit Bakterien gut wachsen können? -> Natürlich alle diese Stoffe, die Bestandteil eines Bakteriums sind 16 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Escherichia coli Kulturmedien für Escherichia coli Definiertes Medium Komplexes Medium K2HPO4 KH2PO4 (NH)4SO2 MgSO4 CaCl2 Glucose Spurenelemente (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) Aqua dest. pH Glucose Hefeextrakt Pepton KH2PO4 Aqua dest. pH 7g 2g 1g 0,1 g 0,02 g 4 – 10 g je 2 – 4 µg definiertes Medium: man gibt alle Bestandteile einzeln dazu. 15 g 5g 5g 2g 1000 ml 7 Komplexes Medium: Man gibt Glucose und hefe und weitere Stoffe dazu und die enthalten dann alles wichtige. 1000 ml 7 11 Wachstum hängt nicht nur von der chemischen Zusammensetzung des Mediums ab, sondern auch von weiteren Faktoren: - z.B der Temepratur (physikalische Bedinung), dem Sauerstoffbedarf alle Bakterien haben ein anderes Temperatur Optimum. Kein Bakterium kann über die ganze Spanne wachsen Tafelanschrieb: Temperatur: allermeisten Habitate für Bakterien!! 15 bis 45 Grad = mesophil > 45 Grad = thermophil >80 Grad = hyperthermophil Sauerstoffbedarf: - aerob - anaerob, für viele gilt Sauerstoff als Zellgift -aerotolerante MO’s: tolerieren Sauerstoff, brauchen ihn aber nicht. - mikroaerophil: brauchen nur sehr geringe Konzentrationen von Sauerstoff. Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 17 lOMoARcPSD|22121835 links: Schneefeld auf der Sierra Nevada mit Rotfärbung durch Schneealgen unten: Rot-pigmentierte Sporen von Chlamydomonas nivalis Chlamydomonas nivalis Bohrkern, Probe. Bereiche mit dunkler Färbung: Zeichen für Wachstum. 18 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 links: Heiße Quelle (101-102°C) im Yellowstone National Park mit Silikat und Schwefelablagerungen unten: Mikrokolonie auf exponiertem Objektträger Quelle: Brock, Biology of Microorganisms 16 unten: Heiße Quelle im Yellowstone National Park mit Carotenoid-haltigen Bakterien links: Abfluss einer heißen Quelle mit Wachstum von Cyanobakterien im Temperaturgradienten Quelle: Brock, Biology of Microorganisms rote Fläche: Sauerstoffindikatoren. (a) (b) (c) (d) (e) Obligate Aerobier Obligate Anaerobier Facultative Anaerobier Microaerophile Aerotolerante a) brauchen Sauerstoff b) brauchen die Abwesenheit von Sauerstoff c) nutzen Sauerstoff, falz er da ist, können aber umschalten, wenn er nicht da ist. d) brauchen nur geringe Mengen an Sauerstoff e) können mit und ohne Sauerstoff leben Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 19 lOMoARcPSD|22121835 Wachstum durch hinäre Teilung: Folge des Wachstums der Zellteilung: exponentielles Wachstum! Weil: 1,2,4,8,16,32,… Generationszeit (= g): Zeit, die die Zelle braucht um sich ein mal zu teilen. Wachstumsgeschwindigekeit, bzw. Rate (= v) 20 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Vorlesung 4: Wachstum von MO’s 1) 1) lag-Phase 2) exponentielle Phase 3) Stationäre Phase 4) Absterbephase 2) 3) 4) Zur Zeichnung: Typischer Wachstumsverlauf. Interessant sind die Reaktionen der MO’S in der stationären Wachstumsphase. Dort muss der Organismus mit einer Begrenzung kämpfen und wird dadurch offen für fremde DNA (genannt „Kompetenz“). Spektrum an Möglichkeiten wird durch Aufnahme der Fremd-DNA erhöht. Weiterentwicklung ist immer nur in der stationären Phase zu beobachten, da der Organismus dort gefordert wird. Methoden zum Bestimmen der Zellzahlen: 1) Direkte Zellzahlbestimmung per Mikroskop. Einfaches Auszählen. 2 21 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 2) Methode: zwei Kultivierungsmethoden - Petrischale mit Nährboden - Bebrütung findet statt Unterschied zur Direktzählung: -Bei der Direktzählung zählt man die toten und lebenden MO’s. Daher zählt man hier viel zu viele. Man kann sie nicht unterscheiden mit dem Auge. Kultivierungsmethoden sind also genauer. - Bei Direktzählung: man sieht hier auch noch andere Partikel, die man eventuell nicht von Bakterien unterscheiden kann. Zellkonzentration muss im zählbaren Bereich sein. Daher: Verdünnungsmethode anwenden 159 oder 17 ist in Ordnung. 2 ist nicht representativ genug , Pearsons Studium 22 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 3) Methode: Photometrische Bestimmung - Trübung wird bestimmt. Je mehr Wachstum, desto höher die Trübung. Streuung des Lichtes wird gemessen, nicht die Absorption. In der Stationäre Wachstumsphase: kann eine Spezialisierung zu einer Dauerform auftreten Tafelanschrieb: Differenzierung von Bakterien: Heterocysten Bildung bei Cyanobakterien zur N2-Fixierung. Konidion, ein Luftmycel, eine stabile Form zum Verbreiten von MO’s. Endosporen: sind Dauerformen, keine Verbreitungsformen Anabaena mit Heterocysten http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/images/images.html http://www.mun.ca/biology/singleton/Topic%205/27-11-AnabaenaHeterocyst.jpg Cyanobakterium („blau Algen“): - ist ein photosynthetischaktives Bakterium. Hat richtige Photosystem I und II wie Pflanzen. - Filamentöses Wachstum (länglich) - einige Zellen haben sich spezialisiert: Stickstofffixierung und Sauerstoffproduktion kann nicht gleichzeitig stattfinden. Daher gibt es extra Zellen, die nur das eine machen und Zellen, die das andere machen. Die Heterocysten produzieren also fixierten Stickstoff und transportiert diesen in die Nachbarzellen. Gegenseitige Versorgung. Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 23 lOMoARcPSD|22121835 Bakterien, die ein Mycel bilden. Haarige Strukturen. Sieht ähnlich aus wie bei einem Schimmelpilz. Luftmycel spezialisiert sich an der Spitze, genannt „Konidion“. Viele Sporen entstehen. Streptomyces Kolonien, Luftmycel und Sporen ca 1 µm Durchmesser http://www.jic.bbsrc.ac.uk/SCIENCE/molmicro/Strept.html http://www.mun.ca/biology/singleton/Topic%205/27T-03hStreptomyces.jpg http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_coelicolor/micro_ images4.shtml Bacillus cereus http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/shape.htm Bacillus cereus Endosporenbildung: Jede Bakterienzelle bildet nur genau eine Spore (kleiner weißer Punkt im Stäbchen). Spore bildet sich nur in einer stationären Wachstumsphase. Endospore wird irgendwann frei gesetzt. Dann stirbt die Bakterienmutterzelle. Autolyse: programmierter Zelltod. Es ist also keine Vermehrung, denn eine Zelle bildet eine Spore. Es dient in der stationären Phase als Überdauerungsform. Sporen sind viel robuster als Bakterien: sie sind resistent gegen Hitze, Austrocknung, Säuren, Desinfektionsmittel,.. Extreme Resistenz kommt daher, dass Endosporen stark dehydriert sind. 10-30 % Wassergehalt hat so eine Spore. Können bis zu 25-40 Mio Jahren überdauern!!! Man hat Bakteriensporen in eingeschlossenen Insekten in Bernstein gefunden, die noch lebten. Es gibt nur zwei Gattungen, die Sporenbilden können: 1. Bacillus (leben aerob) 2. Clostridium (sind strikt anaerob) -> beide gram-positive Bakterien 24 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Beispiele zur ersten Einteilung: Bacillus subtilis (harmloser Erreger), Bacillus anthracis (Erreger von Milzbrand), Bacillus cereus (kann zwei Toxine bilden: können zu Lebensmittelvergiftungen führen) Beispiele zur Gattung Clostridium: Clostridium tetanii (Tetanus, ubiquitäre Verteilung, kann nur unter Sauerstoffausschluss wachsen, kann schnell bei Stichwunden eintreten), C. botulinum (keine Infektion, aber kann Nervengift bilden. Führt zu Dauerhafter Entspannung der Muskeln. Problematisch für Atmung. Besonders anfällig sind Säuglinge) Endosporenbildung am Beispiel von Bacillus subtilis. - Gesamte Bildung dauert ca 8 h - Einteilung der Bildung in 6 Schritte: 25 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 hier sieht man die Spore links. Cortex kann auch angefärbt werden. Oben: Struktur einer Endospore Links: Auskeimung einer Spore Wenn wieder günstigere Wachstumsbedingungen vorliegen, tritt Auskeimung auf. Dafür ist eine Überwachung der Nährstoffe im Milieu außenherum nötig, damit das Signal zum Auskeimen wieder entsteht. Hypothese: Sporen detektieren Peptidoglycanteile, das würde bedeuten, dass irgendwo in der Nähe Wachsende Zellen vorliegen. Zeichen, dass Wachstumsbedingungen günstig sind. Sie keimen aus. Woher bekommen Bakterien die notwendige Energie zum wachsen? Thema: Bakterieller Stoffwechsel Tafelanschrieb: Vielfalt: -ATP (als Energiewährung der Zelle, Adenosintriphosphat). ATP-Senken - Energie wird benötigt für: Biosynthese, Bewegung, Transportprozesse über Membranen, Regulation der Stoffwechselprozesse einer Zelle, 26 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Möglichkeit des Energiestoffwechsels: - Phototrophe Lebensweise, nutzen von Lichtenergie, z.B. Pflanzen, Cyanobakterien, - chemotrophe Lebensweise: Energieproduzieren durch Redoxreaktionen. Zum Beispiel Reduzierung von Zucker zu Pyruvat. Zwei große Organsimengruppen: 1. Chemoorganothroph: Oxidation von organischen Moleküle (z.B Tiere, Menschen) 2. Chemolitothroph: Oxidation von anorgansichen Molekülen Tafelanschrieb: Gibbs-Energie (freiwerdende Energie): Edukt wird zu Produkt. Dabei entsteht ΔG (in kJ pro mol -1). ΔG = Freiwerdene Energie ΔG < 0 ΔG = 0 ΔG > 0 -> exergone Reaktion. Läuft freiwillig ab bei negativem ΔG -> reversibel, Gleichgewicht -> endergone Reaktion, laufen nicht freiwillig ab, nur unter Energieaufwand, Wird immer berechnet für Standartbedingungen. Alle Reaktionspartner sind in einer Konzentration von 1 mol beteiligt und Temperatur ist 25 °C. Genannt dann ΔG0 Wenn bei einer Reaktion H+ (Protonen) beteiligt sind, dann können keine Standartbedingungen herrschen. Dann hätten wir einen pH-Wert von 0 und da herrschen keine Standartbedingungen. Daher schaut man sich ΔG immer bei PH 7 an. -> genannt „ΔG‘ 0“ 27 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 ATP generieren: durch Phosphorylierung von Phosphat ADP + Pi -> ATP + H2O hier wäre: ΔG‘0 = 32 kJ mol -1 Reaktion kostet Energie, wir müssen also etwas reinstecken! Glc + 6 O2 -> 6 CO2 + 6 H2O ΔG‘0 = -2872 kJ mol-1 Insgesamt kann man daraus also 58 ATP generieren. In Wahrheit ist es bei einem optimalen System etwa 34 ATP, -> 59 % Wirkungsgrad Was passiert ohne Sauerstoff? Glucose Umsetzung ohne Sauerstoff: Glc -> 2 Ethanol + 2 CO2 ΔG‘0 = -235 kJ mol hoch -1 Vorlesung 5: Chemoheterothorphe Energiegewinnung: - Stoffwechselweg mit und ohne Sauerstoff möglich - Beruht auf Redoxreaktionen Energiegewinnung aus Licht 28 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 29 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Glycolyse: Glucose 1,3-Bisphosphoglycerat Glucose-6phosphat 3-Phosphoglycerat Fructose-6phosphat 2-Phosphoglycerat Fructose1,6-bisphosphat Glycerinaldehyd-3phosphat Phosphoenolpyruvat Pyruvat 30 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 im ersten Schritt der Glycolyse wird Energie verbaucht! Ebenso in der dritten! Phosphofructokinase In Reaktion 5 und 8 werden jeweils 2 ATP gewonnen! Der Zitronensäurezyklus Die wichtigste Funktion des Citratzyklus besteht darin, Acetyl-CoA, das aus der oxidativen Decarboxylierung, der β-Oxidation der Fettsäuren oder dem Aminosäureabbau stammt, in acht Reaktionen zu CO2 zu oxidieren. us: Brock Mikrobiologie, Pearsons Studium Zunächst überträgt Acetyl-CoA seine Acetylgruppe (C2) auf die C4-Verbindung Oxalacetat, wodurch die C6-Verbindung Citrat entsteht. Aufeinanderfolgende oxidative Decarboxylierungen setzen zwei CO2 frei, sodass letztlich wieder Oxalacetat gebildet wird, das wieder eine Acetylgruppe aufnehmen kann. Die dabei frei werdende Energie wird in Form der Reduktionsäquivalente NADH und FADH2 fixiert. Diese geben die aufgenommenen Elektronen an die Atmungskette ab, wo sie auf Sauerstoff übertragen werden. Außerdem wird im Citratzyklus ein GTP gebildet, das in ATP umgewandelt werden kann. Die Enzyme des Citratzyklus befinden sich, wie die der Atmungskette, im Mitochondrium. Die Energiebilanz für die Oxidation einer Acetylgruppe zu CO2 lautet: 3 NADH, 1 FADH2 und 1 GTP (bzw. ATP) 31 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Zn2+ / Zn 2 e- 1,11 V Cu2+ / Cu Potentiale unter Standardbedingungena Zn 2+ / Zn Fe 2+ / Fe H+ / ½ H2 Cu2+ / Cu Au 3+/ Au Mortimer, C. E.: Chemie; 6. Aufl. Stuttgart (Thieme) 1996 Elektrochemische Zelle a - 0,76 V - 0,44 V 0V +0,35 V +1,36 V 25°C, 1 atm, 1 molar Chemoorganoheterotrophie (Heterotrophie) Glucose CO2 NAD+ + H+ Atmungskette H2O NADH 2 e- ½ O 2 + 2 H+ CO2 / Glucose H+ / ½ H2 NAD+ / NADH CO2 / CH4 SO42- / HSNO3- / NO2Fe3+ / Fe 2+ O2 / H2O NO / N2O N2O / N2 - 0,43 V - 0,41 V - 0,32 V - 0,24 V - 0,22 V +0,43 V +0,77 V +0,82 V +1,18 V +1,36 V 25°C, 1 atm, 1 molar, pH 7 14 Bei dem Glucose Abbau in der Glycolyse wird NADH frei, dieses erhält 2 e-. Diese Ladung geht über die die Atmungskette, bei der nun Wasser entsteht. 32 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Atmungskette und ATP-Synthase NADH und FADH2 liefern Elektornen, welche die Protonenpumpe antreibt. -> Es entsteht ein Protonengradient Chemoorganoheterotrophie Glucose NAD+ CO2 + H+ Atmungskette NO2- NADH 2 e- NO3- H+ / ½ H2 NAD+ / NADH CO2 / CH4 SO42- / HSNO3- / NO2Fe3+ / Fe 2+ O2 / H2O NO / N2O N2O / N2 - 0,41 V - 0,32 V - 0,24 V - 0,22 V +0,43 V +0,77 V +0,82 V +1,18 V +1,36 V Glucose CO2 NAD+ + H+ Atmungskette NADH 2 e- N2 N2O NO NO2- NO3- 25°C, 1 atm, 1 molar, pH 7 MO’s die chemoorganoheterotroph leben, können auch mit den zwei Elektronen Nitrat zu Nitrit umwandeln. Das bringt allerdings weniger Energie (siehe Liste: liegen näher zusammen) 33 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Bilanzierung Substrate Produkte ATP [2H] Glycolyse Glucose 2 Pyruvat 2 2 Pyruvat-DH 2 Pyruvat 2 Acetyl-CoA, 2 CO2 - 2 Citratzyklus 2 Acetyl-CoA 4 CO2 2 8 30 - Atmungskette 12 [2H] 12 H2O Lactatbildung: - anaerobe Bedingungen homofermentativ: -> ein Typ der Milchsäuregärung bei dem als Hauptprodukt nur Milchsäure gebildet wird. 21 Aus: Brock, Mikrobiologie, Pearson Studium homofermentative Milchsäure Bakterien: - Lactococcus lactis - Streptococcus cremuris - Lactobacillus acidoptilus - Lactobacillus delbrueckii Milchsäurebakterien Vorkommen: in Milch,. Pflanzen, Tieren (Schleimhäute) Lactobacillus delbrueckii Streptococcus thermophilus Bildquellen: www.genomenewsnetwork.org/articles/10_02/bifido.shtml www unibas it/utenti/parente/Starter/gruppi html 22 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 34 lOMoARcPSD|22121835 Zusammenfassung aller möglichen Wege durch die Pyruvat verstoffwechselt werden kann COOH C PyruvatDehydrogenase O NAD+ + CoA NADH + CO2 CH 3 Pyruvat NADH NAD+ CO2 HC C O Citratzyklus CH 3 HC O CH 3 COOH CoA AcetylCoA PyruvatDecarboxylase Lactatdehydrogenase S Alkohol- Acetaldehyd dehydrogenase OH H2 C NADH CH 3 NAD+ Milchsäure OH CH 3 Ethanol 23 Chemoorganoheterotrophie ohne Atmungskette!  Gärung  ATP Glucose NAD+ + H+ Ethanol Pyruvat NADH CO2 Acetaldehyd Quellen: http://www.bier-lexikon.lauftext.de/ober-untergaerig.htm http://www.gctw-halle.de/rossini/speiseundgetraenkekarten/weinkarte/ http://www.plamosa.com/toc.htm http://www.ethlife.ethz.ch/articles/CHfoods.html http://www.fromagesdesuisse.com/default.asp?url=/fromage/emmentaler.asp http://www.alcisa.com/salami.html http://www.fraunhofer.de/fhg/archiv/presseinfos2003/pflege.zv.fhg.de/german/press/pi/pi2003/06/md_fo3.html 24 35 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Vorlesung 6: Chemolithoautotrophie NO2- NO3- Atmungskette H2O 2 e- O2 H+ / ½ H2 NAD+ / NADH CO2 / CH4 SO42- / HSNO2- / NO NO3- / NO2Fe3+ / Fe 2+ O2 / H2O NO / N2O N2O / N2 - 0,41 V - 0,32 V - 0,24 V - 0,22 V +0,36 V +0,43 V +0,77 V +0,82 V +1,18 V +1,36 V 25°C, 1 atm, 1 molar, pH 7 36 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Nitrosococcus oceanii NH4+ + 1,5 O2 NO2- + 2 H+ + H2O Nitrobacter winogradskyi NO2- + ½ O2 NO3- Direktnachweis von Nitrifizierern in Belebtschlamm rot: Ammonium-Oxidierer grün: Nitrit-Oxidierer 37 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 38 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Anabaena mit Heterocysten http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/images/images.html http://www.mun.ca/biology/singleton/Topic%205/27-11-AnabaenaHeterocyst.jpg Rhizobium http://www.mun.ca/biology/singleton/Topic%205/27T-03a-Rhizobium.jpg http://pagesperso.laposte.net/jul/images/especes/ 39 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Stickstoffkreislauf: 40 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 41 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 durch die Koch’schen Postulate (4 Stück): 10 s: Brock, Mikrobiologie Reise durch den Körper, Beginn im Mund: 42 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Streptococcus mutans Pellicel ist die Schicht auf den Zähnen, an denen Stepococcus mutans bindet. Dann wiederrum bin ganz viele weitere Bakterien sich an dieses Bakterium. Es entsteht eine dicke Schicht von zusammenhängenden Bakterien. Oft sogar anaerob,weil so Strukturmodel dichteines besiedelt. Biofilms auf der Zahnoberfläche Strukturmodel eines Biofilms auf der Zahnoberfläche A.: Actinobacillus, Actinomyces; C.: Capnocytophaga; E.: Streptococcus Eikenella; H.: Haemophilus; P.: Porphyromonas, Prevotella; Propionibacterium; S.: Selenomonas, Streptococcus; V.: Veilonella Quelle: Kolenbrander et al., 2002 13 In-vitro mit Streptococcus mutans besiedelte okklusale Zahnfläche nach Inkubation mit Mitis-salivarius-Bouillon mit Bacitracin links: Kariesdefekte in verschiedenen Stadien Quellen: http://www.ftvost.odont.se/porslin.html http://www.schollesmed.de/html/article.php?sid=10 http://www.ftvost.odont.se/porslin.html http://www.uib.no/pedodonti/Pedodontisk%20kari ologi/Karies%20ved%20papilla%20incisiva%20bil der htm 43 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Vorlesung 7: Der Weg durch den Körper: 1) KARIES: 44 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 2) MAGEN: Bakterium spaltet Harnstoff beim schwimmen und setzte dadruch Ammoniak frei. Durch diese Ammoniakwolke kann Ammoniak er geschützt durch die Magensäure schwimmen, da Ammoniak in dieser kleinen Wolke neutralisierend wirkt Helicobacter pylori - Gram-negatives Stäbchen - säureresistent 45 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 3) IM DARM: Cholera Krankheit bekämpft man in dem man hauptsächlich dafür sorgt, dass der Körper des Erkrankten nicht austrocknet. genügent Wasser Zugabe. Vibrio cholerae Choleratoxin (AB-Typ) S-S = Schwefelbrücken -> Geringe Konzentration von Toxin nur nötig, da es eine Reaktionskaskade auslöst! B B B A1 -S-S- A2 B AB-Toxine sind ein beispiel der Exotoxine und gehören zu den Enterotoxinen (von außen wirkend) B Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 46 lOMoARcPSD|22121835 Reaktionskaskade: FOLGE: cAMP wird in hohen Dosen ausgeschüttet. Als Folge versucht das Wasser im Gewebe den osmotischen Unterschied zu regulieren und strömt aus. -> in sehr großen Mengen. Durchfall Quelle: Brock, Mikrobiologie, 11. Auflage 47 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 4) IM DARM: Staphylococcus aureus typischer Ausbruch von Staphylococcus aureus: - Druch Kochen wird alles unschädlich gemacht, dann jedoch durch Kontakt mit den Händen wieder kontaminiert. Nun stehen gelassen bei Raumtemperatur. Da kein anders MO überlebt hat, ist es der perfekte Nährboden. Erneutes erhitzen töten zwar die MO’s ab, aber inaktiviert nicht das Toxin. Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 48 lOMoARcPSD|22121835 Neues Thema: PILZE Schimmelpilze Aspergillus niger: Konidien, Konidiophore Hefen Rhizopus: Sporangium Sporangiospore 49 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Vorlesung 8: Thema: Mycotoxine = Toxine der Pilze Besonders bekannte Mycotoxine: (im LM-Bereich) -Penicillium -Aspergillus -Fusarium Mykotoxinproduzenten hauptsächlich Pilze der Gattungen Penicillium, Aspergillus, Fusarium rechts oben: Penicillium Rechts unten: Aspergillus Links: Fusarium Zwei Substanzgruppen der Mycotoxine: -Aflatoxine -Trichothecene Aflatoxine: -sehr hitzeresistent, -Ring Strukturen, 5 Heterozyklen, -Großbuchstaben beziehen sich auf die Floreszenz Eigenschaften, B = blau flureszierend, G = grün, -Wenn Aflazoxine in den Stoffwechsel eines Tieres kommen, dann entsteht eine Verstärkung der Giftwirkung.Es entsteht M-Afaltoxine durch den Abbau von Aflatoxin. Toxin wird dann noch giftiger -Vorkommen vor allem bei Aspergillus 50 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Heterocyclische Verbindungen Hauptgruppen: B1,B2, G1, G2, M1, M2 (B = blaue Fluoreszenz, G = grüne Fluoreszenz, M = Metabolite) B1-kontaminiertes Futter wird als Entgiftungsreaktion hydroxyliert es entsteht M1 gelangt bei laktierenden Tieren (auch Mensch) in die Milch Problem: akute Vergiftungssymptomatik fehlt. Eher chronische Auswirkungen: Krebsbildung. Stärkste natürlich vorkommende kanzerogene Verbindungen Chronische Toxizität: Leberzirrhosen, -fibrosen, -Tumore Teratogen (Missbildung / Absterben von Föten) Cancerogen (Leberkrebs) Hitzestabil (100-120°C), aber empfindlich gegenüber stärkeren Säuren und Laugen (Pflanzenöle) Zulässiger Höchstgehalt von B1 in Lebensmitteln: 2 µg/kg, mit Ausnahmen, z. B. Ölsaaten vor Verarbeitung: 8 µg/kg; Beikost für Säuglinge: 0,10 µg/kg Aspergillus flavus Pilzbefall heißt nicht unbedingt, dass auch Toxin gebildet wird. Toxin wird nur unter bestimmten Bedingungen hergestellt. Aflatoxin-Bildung: Kontaminierte Lebensmittel:  tropische und subtropische Nüsse (Erdnüsse)  Schalenfrüchte (Pistazien, Mandeln)  Früchte (Feigen)  Gewürze (Chillies)  Getreide (Mais) mag warme Temperaturen um besser wachsen zu können. In EU weniger ein Problem. 51 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Trichothecene: -Gebildet von Fusarium -Vierer Ring System typisch -T-2 Toxin besonders bekannt -Verbindung die am häufigsten vorkommt: „ Deoxynivalenol“ (= DON) Trichothecene Abb: Krämer: Lebensmittel-Mikrobiologie, Ulmer 150 Verbindungen mit tetrazyklischem Epoxyringsystem Produzenten: Vor allem Pilze der Gattung Fusarium Phytopathogene Pilze Infektion: Getreide (Weizen, Mais, Hafer), Nutzpflanzen (Tomaten, Spargel, Bananen) Pilze, die schon auf dem Feld aktiv sind und das korn vor der Ernte beeinfussen. - Verweigerung der Nahrungsaufnahme bei befallen Tieren als Symptom. -> Gewichtsverlust auch bei Pflanzen zu sehen - Virulenzfaktor für die Pilze beim Befallen der Pflanze (wissenschaftlich noch nicht genau erforscht) Bei Getreide: Infektion der Pflanzen auf dem Feld ( Feldpilze) durch Konidien oder Ascosporen; Übertragung durch Wind und Wasserspritzer Ährenbleiche, Ährenfusariose, Bildung von Kümmerkörnern (Abbau von Speicherstärke/-proteinen) u. Toxinen 52 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 ab hier: Neues Thema: VIREN Diskussion ob Viren überhaupt ein Lebewesen ist.Immer noch offen. (Merkmale des Lebendigen: Stoffwechsel (trifft teilweise zu), beweglich, Fortpflanzung (trifft zu), Wachstum, bzw. die Entwicklungsgeschichte, Alterung?..) Grundform von ganz einfachen Viren. Proteinmantel genannt Capsid, besteht aus Capsomeren. Viren - Alles Viren, die in Tieren vorkommen: 20 – 300 nm Größe DNA oder RNA 5 – 230 kB Genom Kein Stoffwechsel extrem klein. - es gibt nicht DNA und RNA, sondern nur eins von beidem. Wenige Genome 5-230 KiloBasen. Faustregel: 1 Base pro Enzym Bildung nötig. Also können sie etwa bis zu 230 Enzyme kodieren. - in dieser Form ist der Stoffwechsel des Virus aktiv. Wenn er jedoch in einen Wirt gelangt, wird der Stoffwechsel aktiv. Viren werden unteranderem eingeteilt nach dem Aussehen. Hier Einteilung nach Vorhandensein von DNA oder RNA Zwei große Gruppen: DNA basierende und RNA basierende Viren. Weitere Unterscheidung : mit oder ohne Hülle. Ds= Doppelstrang DNA (ist keine Selbstverständlichkeit bei Viren. Können auch einsträngig vorliegen!) Diversität tierischer Viren Aus: Brock, Mikrobiologie, Pearson Studium 13 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 53 lOMoARcPSD|22121835 Diversität tierischer Viren Aus: Brock, Mikrobiologie, Pearson Studium RNA-Viren: - noch virulenter (vorallem die mit Hülle rechts) - Rhabdovirus = löst Tollwut aus - Togaviren = lösen Gelbfieber aus - Retroviren: für Aids verantwortlich. Kann RNA in DNA umschreiben! (Kann ein Tier/Mensch nicht!) -Orthomyovirus: Erkältungen, greifen Schleimhäute an - mit Hülle: gegen meistens nicht durch die Luft. Übertragung bei Körperkontakt. Sind Empfindlicher. - ohne Hülle: unempfindlicher. - Picornavirus: Hepatitis A Vieren, Noroviren gehören dazu. Weitere Unterscheidung zwischen: tierischen Viren, pflanzlichen Viren und Bakteriphargen ( Verzehren Bakterien) Symmetrie: (Aufbau der Viren) - Linear - Ikosaeder - Komplex -> vorallem bei Bakteriophargen linear: Ikosaeder: Icosahedrale Symmetrie, menschliches Papillomavirus 54 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Komplexe: Komplex: DNA im Kopfbereich, Kontaktplatte die die Wirtszelle findet und Strukturen erkennt. Nach Kontanktbindung kontrahiert der Kopf und die DNA wird in die Zelle des Wirtes gepumpt T4 Bakteriophage Quantifiziereung: (Anzahl bestimmen) Quantifizierung von Bakteriophagen mit Plaquetest Quantifizierung: da wo Löcher in der Agarplatte entstehen, befindet sich ein Phargenpartikel, denn sie hinterlassen Lysenhöfe. Quantifizierung von tierischen Viren mit Monolayer-Zellkulturen 55 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 21 Replikation: Ausgelöst durch Anheftung des Viruspartikels an eine Wirtszelle. Durch Kontraktion gelangt Genom in die Zelle. Proteinhülle bleibt draußen. Schritte: -DNA wird in die Zelle gepumt. - DNA in der Zelle wird repliziert durch die Wirtszelle. - am Ende stirbt die Zelle und die neuen Viren treten aus - Strukturen werden neu aufgebaut - Ist die Konzentration hoch genug, dann tritt die Zelllyse ein. So werden die Viren wieder frei gesetzt latente Periode: die Zeit in der man nichts nachweisen kann, weil nur DNA in Wirtszelle ist und noch nicht nach gebaut wurde Menge der neuen Viren heißt „Wurfgröße“. Das ganze bildet einen Fortpflanzungskreislauf. Virulente Phagen nutzen diesen “lytischen” Kreislauf zur Fortpflanzung. 56 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Weitere, spezielle Art der Forpflanzung: Temperente Phagen können diesen Weg nutzen: sind in der Lage einen lytischen oder einen lysogenen Kreislauf zur Fortpflanzung zu nutzen Beginn läuft gleich ab Dann “lysogener” Weg: Virus DNA wird in die Wirts DNA eingebaut. Nun ist die Phage eine „Prophage“. Diese veränderte Zelle nennt man nun Lysogene Zelle. Bei jeder Zellteilung der Wirtzelle, repliziert sie die Phargen DNA mit. Sehr praktisch. Prophage kann sich auch wieder selbständig machen, seine DNA wird wieder ausgeschnitten aus Wirts DNA. Das passiert, wenn die Nährstoffversorgung der Zelle nicht mehr gut gegeben ist. Aus: Brock, Mikrobiologie, Pearson Studium Herpes funktioniert so. Bricht aus, wenn es der Zelle schlecht geht. Z.B. nach Sonneneinwirkung Grippevirus/ Influenzavirus: -gehört zu den RNA- Viren - negativ-Strang (muss erst in plus-Strang RNA übersetzt werden vor Nutzung möglich) - Virus muss besonderes Enzym selbstmit bringen um Umwandlung machen zu können: nämlich eine RNA-abhängige RNA-Polymerase!! (Das gibt es bei keinem anderen Organismus!) - Gruppe: Orthomyovirus: weil es die Schleimhäute in den Atemwegen angreift. - segmentiertes Genom, 8 Segmente - polymorph (eher unförmig) -Hülle besteht aus Proteinen und Lipiden - Hülle beinhaltet das Protein „Hämagglutinin“. Es erkennt bestimmte Zielsequenzen/Strukturen, nämlich Sialinsäure. Dies Säure gibt es in den Schleimhautzellen unserer Atemwege. Koppelt den Virus an Atemschleimhaut - ebenfalls enthält die Hülle das Protein „Neuraminidase“. Sie baut Sialinsäure ab. Wichtig, damit der Viruspartikel die Zelle auch wieder verlassen kann, denn sonst würde Kopplung bestehen bleiben. Influenzavirus 57 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 diese beiden Proteine liegen außen auf der Hülle Grippeviren werden oft unterschätzt. 2012/2013 gab es fast 29.000 Tote durch Grippe. Extrem große Dunkelzahl. Influenzavirus NEUES THEMA: GENETIK bei Prokaryoten 4 mögliche Basen: A = Adenin T= Thymin G= Guanin C= Cytosin nicht viele Chromosomen, sondern das Genom ist zyklisch in einem Chromosom geformt. Plasmide: sind auch zyklisch, aber nicht gebunden an das große Genom. Es sind extrachromosomale Elemente 58 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 im Eukaryoten!!!! RNA muss prozessiert werden! Sinnlose Abschnitte werden aussortiert. Das passiert bei Prokaryoten nicht. direkte transibieren. Es gitb hier keine Extrons und Introns Mehrere codieren ebereiche werden gleichzeitig abgelesen. Immer bis zu einer Schnittstelle. Wesentlicher Unterschied: Thymidin wird durch Uridin in RNA ausgetauscht. Alle weiteren 3 bleiben gleich. Zweiter Unterschied liegt im Zucker. In RNA ist es eine Ribose, also ein fünffach Zucker. In der DNA ist es ein modifizierter Zucker. Zählung im Zuckerring immer mit Strich! Ansonsten ohne Strich RNA ist instabiler als DNA 59 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Doppelstrang ist antiparallel. Dadruch gibt es eine Richtung des Stranges. Benannt mit 3’Ende bzw. 5‘ Ende. Doppelhelix: im Inneren liegen die Basen semikonservative Replikation: nur ein Strang wird erneuert, der Tochterstrang. Der andere dient als Matritze (Elternstrang, Vorlage). Replikationsrichtung des DNAeinzelstarnges setzte immer am 3’C-Atom an. Das Nukleotid wird genau da angesetzte. Die Kette wächst am 3’Ende! 60 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Vorlesung 9: Ergänzung /Wiederholung vom letzten mal: -DNA Doppelstrang läuft antiparallel. -Rückrat aus Zucker und Phosphat, Basen sind in der Mitte angeordnet mit Partnerbase. -Insgesamt ergibt sich eine Doppelhelix. -Semikonservativ = weil immer nur einer neu repliziert wird und der andere bleibt bestehen, konserviert. -Der DNA Doppelstrang wächst nur an einem Ende des 3‘-C-Atoms. Eine Verlängerung um ein Nukleotid kostet zwei Phosphate. Das dritte wird eingebaut. Für Verlängerung ist das DNA-Polymerade Enzym notwendig. Eigenschaft dieses Enzyms: Es gibt keine De-Novo-Synthese. Das heißt, sie können nicht einfach aus dem nichts heraus synthetisieren, sondern müssen immer an einem Primer ansetzten. RNA-Polymerasen lösen das Problem, sie können de-Novo-Synthese betreiben. DNA ist dadurch gekennzeichnet dass es am 2’C Atom keine OH-Gruppe gibt. RNA hat dort eine OH Gruppe. RNA-Primer wird synthetisiert und kann dann von der DNA-Polymerase genutzt werden um anzusetzen. REPLIKATION: Replikation: Strang wird aufgetrennt von einer Helikase. Einzelstrangbindeproteine stabilisieren den instabilen Einzelstrang. DNA-Polymerase läuft direkt hinterher und synthetisiert die neue DNA. Am Partnerstang ist das ein Problem: Da dieser ja verkehrt herum gebaut ist. Problem wir dadurch gelöst indem kleine Stücke in der Gegenrichtung repliziert werden. Leitstrang: wird durchgängig synthetisiert. Folgestrang: wird gestückelt repliziert. Bruchstücke müssen aber noch geflickt werden. Lücke zwischen Teilsträngen werden durch das Enzym „Ligase“ gefüllt. (siehe nächste Seite) 61 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 DNA-Polymerase III = ist das „Arbeitstier“, sie repliziert. Tauscht mit DNA-Polymerase I: diese kann den Primer in der Lücke beseitigen. Ligase tauscht den Platz und schließt endgültig die Lücke. Danach fällt die Ligase ab. Bakterien/Prokaryoten haben kreisförmige Genome: Replikation ist schneller, da sie in beide Richtungen ablaufen kann. Ori = „Origin of Replication“ (Definierter Bereich auf dem Strang bei dem die Replikation beginnt) Nennt man „Theta-Replikation“. Es können theoretisch mehrere dieser Replikationsgabeln sich bilden. Das beschleunigt die Replikation, denn es setzt eine neue an, bevor die alte abgeschlossen ist. Gestrichelter Pfeil bedeutetet immer Gestückelte Replikation im Folgestrang 62 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 MUTATION: - Motor für die Evolution - Nicht perfekt laufende DNA-Polymerasen bauen selten falsche Tripletts ein und somit entstehen DNA-Varianten - Grundlage: 3 Basen codieren eine AS - Fehler bei Replikation führt zu Austausch einer Base. Ein anderes Protein/AS entsteht. „Punkt Mutation“: Mutation durch genau eine Base, die einen andere Funktion des Produktes erzeugt. 3 Arten: - „Stille Mutation“ : Es wird zwar eine andere Base eingebaut, aber es ist nicht bemerkbar, weil trotzdem das selbe Protein heraus kommt. - „Nonsense-Mutation“: ein Stoppcodon wird erzeugt durch Autausch einer Base. Das Stoppcodon führt zu einem unvollständigen Bau eines Proteins. - „Missense Mutation“: Eine Base wird getauscht, dadurch entsteht ein etwas anders funktionierendes Protein. -> Evolution. Insertion-/Deletionsmutation: Eine Base wird ausgelassen oder fehlerhaft eingefügt. Damit wird alles was danach abgelesen wird ist dann komplett falsch und das Protein ist vollständig unbrauchbar. -> Können ausgelöst werden durch Chemikalien (z.B. Aflatoxine) oder auch UV-Licht. Schäden durch UV-Licht: innerhalb von 260 nm 63 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 „Ames-Test“: zum prüfen ob eine Chemikalie mutationsauslösend ist oder nicht. Vorgehen: Agarplatte mit bakteriellem Teststamm: Salmonella. Dieses Bakterium kann kein Histidin herstellen, da er eine Punktmutation hat. Histidin muss also im Medium dazu gegeben werden. Platte ohne Histidin!! Stamm kann nur wachsen, wenn er eine Rückmutation macht um Histidin wieder herstellen zu können. Links Blindprobe: einzelne Kolonien entstehen. Können nur dank Rückmutation entstehen. Rechts: Rückmutationsrate ist deutlich erhöht! Zeigt, dass zusätzlich dazugegebene Substanz die dazu gegeben wurde einen Rückmotierenden Effekt hat! HORIZONTALER DNA-TRANSFER (3 Mechanismen) - Gene werden nicht nur von Mutter auf Tochterzelle übertragen, sondern auch innerhalb einer Generation! Vor allem problematisch bei Antibiotikaresistenzen 1) Transformation: - am Beispiel des “Griffith-Experimentes”: Vorgehen: Pneumokokken, die eine Schleimhülle bilden können um sich gegen das Immunsiystem des Wirtes zu schützen, werden in einen Wirt gegeben. Der Wirt stirbt von dieser Infektion. Wird der Wirt infiziert mit abgetöteten Bakterien, dann stirbt er nicht. Er stirbt aber auch nicht, wenn er von R-Zellen ohne Schleimschicht infiziert wird. Griffirth hat nun die lebenden, nicht-schleimbildenen Zellen zusammen gepackt mit den abgetöteten schleimbildenen Zellen und den Wirt infiziert. Ergebnis: Tier stirbt. Theorie: Lebende Zellen haben Fähigkeit von toten Zellen übernommen und konnten so Kapseln bilden! 64 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Transformation: Kennzeichen dafür ist freie DNA die von einem lebenden Bakterium aufgenommen wird. Dafür hat es extra Erkennungsbereiche. Es geschieht eine homologe Rekombination. Neues DANN-Fragment wird eingebaut in die Alte. -> Rekombination. Protein „Rec A „ ordnet neue DNA so an, dass sie neben dem alten Strang liegt, welcher eine ähnliche Basenabfolge hat. Nun wird die DNA teilweise aufgeschmolzen und mischt sich dadurch. Es können auch nicht passende Bereiche entstehen, Fehlpaarungen, wo Basen keine passenden Partner findet. Im nächsten Schritt wird das Rückrat der DNA-Stränge getrennt. Neuer Doppelstrang ist eine Hybrid aus beiden. Nun kommt die Zellteilung und beide Stränge werden wieder getrennt. Die beiden Tochterstränge haben an den Stellen, bei den es Fehlpaarungen gibt, aufgefüllt. Der eine Tochterstang ist nun der alte, unverändert. Im zweiten Tochterstrang gibt es neue Basen. Es gibt nun die neue und die alte Variante der DNA in einer Zelle. Die jenige Variante der die besser ist, wird sich schneller fortpflanzen und wachsen und somit wird entschieden, ob die Transformation sinnvoll war oder nicht. Transformation ist also ein Prozess schnell sich an wechselnde Umwelteinflüsse anpassen zu können. Transduktion: - lytischer Pharge infiziert eine Bakterienzelle - Es kann passieren, dass fälschlicherweise Wirts DNA eingekaplselt wird, statt Phargen-DNA. Pharge mit WirtsDNA infiziert nun ein anderes Bakterium. Doch die DNA ist nicht virulent, da es ja ähnliche DNA ist. Es kommt nicht zur Lyse, sondern die DNA wird eingebaut. Transduktion: Übernahme der DNA, fälschlicherweise transportiert durch Phargen. Nennt man „Allgemeine Transduktion“. 65 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Spezielle Transduktion: - Lysogene Phargen ist hier beteiligt. -Rechte Spalte (Seltenes Ereignis): Ausschneidevorgang läuft nicht perfekt und nimmt Teile der WirtsDNA mit (Galactosegen ist hier auch dabei). Spezielle Transduktion findet nun statt. -links: Normaler Vorgang. -Am Ende (rechts): fehlerhafte Phargenpartikel entstehen. Als Partikel sind sie wieder infektiöse und infizieren neue Wirte. Dadurch ist nun auch das Galactosegen in der neuen Wirtszelle. Konjugation: - Merkmal ist: direkter Zellkontakt. Zwei Bakterien tauschen absichtlich DNA aus. - Bakterien können über Pilus verbunden sein. - Nicht jede beliebige Zelle kann mit jeder in Kontakt treten. Es gibt F+ und F- Zellen. Und nur F+ mit F- können zusammen treten. F+ und F+ geht nicht, F- und F- auch nicht. - F steht für “Fertilitätsplasmid” 66 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 - “tra”-Region: hier liegen alles Gene die dafür da sind einen Pilus auszubauen, eine F- Zelle zu detektieren und Kontakt mit ihr aufzunehmen. - Nur F-Plasmid wird ausgetauscht bei Kontakt, nicht gesamte DNA-Information - Daher ist entscheidend, was auf Plasmid kodiert ist. - F-Plasmid ist eine Doppelstrang, der aufgebrochen wird. Ein Strang davon wird über Pilus übertragen. Abgerolltes F-Plasmid in der Geberzelle kann direkt als Leitstrang nachrepliziert werden. Das 5’Ende gelangt in die Empfängerzelle und muss dort daher als Folgestrang stückchenhaft nachrepliziert werden. Nach dem Prozess sind beide Zellen F+! (Logisch:vorige F- Zelle hat ja nun auch das F-Plasmid bekommen) -nennt man auch „Rolling-circle“-Replikation Plasmid kann auch wieder verloren gehen: nennt man „Kurierung“. Zellen ohne Plasmid können sich schneller teilen, da sie ja ein Plasmid weniger replizieren können. Daher entstehen immer wieder FZellen. Wenn die Eigenschaft des F-Plasmides gerade in den Umweltbedingungen nicht nötig ist, ist es eher Ballast und wird wieder aussortiert, bis sie wieder genutzt wird. 67 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 RESTRIKTION: gezieltes Schneiden von DNA, Modifikation striktionsendonukleasen illus globigii herichia coli mophilus influencae rmus aquaticus ↓ ↓ ↓ ↓ Restriktionsendonukleasen Bacillus globigii Escherichia coli Haemophilus influencae Thermus aquaticus BgIII EcoRI HindIII TaqI A↓GATCT G↓AATTC A↓AGCTT T↓CGA Restriktionsenzym schneidet die DNA Restriktion wird in der Biologie der Schutzmechanismus von Bakterien gegen Viren bzw. Bakteriophagen-Infektionen genannt. Die bakterielle DNA ist durch Methylierung vor dem Abbau durch eigene Restriktionsenzyme geschützt. Nichtmethylierte Viren-DNA, die in die Zelle eingedrungen ist, wird durch das Enzym zerschnitten und so eine Infektion verhindert. 68 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Vorlesung 10: (letzte) Thema: IDENTIFIZIERUNG Identifizierung von Mikroorganismen: oft mals liegt ein Isolat vor und wir wollen wissen um welche MO‘s es sich handelt. Allgemeines Vorgehen: Muster ergibt sich, Datenbasis prüfen Grundsätzlicher Unterschied zum „Nachweis“: Bei einem Nachweis haben wir eine bestimmte Probe und suchen gezielt nach einer Gruppe von MO’s. Vorgehen: wir kennen eine bestimmte Eigenschaft eines MO’s und prüfen ob sie vorhanden sind ja oder nein. Identifizierungstechniken: 1)Erhebung der Morphologie des Organismus (Blick durch ein Mikroskop): Zellmorphologie weißt bestimmte Eigenschaften auf zur Unterscheidung: z.B Kokke oder Stäbchenform, Bacillus cereus Sporen (S.2) http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/shape.htm Micrococcus lysodechticus Escherichia coli http://www.ulb.ac.be/science s/biodic/EPageImages.html Rhodospirillum photometricum Quelle: Brock, 2000 2) Schnellmethoden: 2.1) „Gram-Färbung“: lässt sich ein Bakterium anfärben oder nicht? Sagt aus ob es eine LPS besitzt oder nicht. Kristallviolett „Kv+“ als basischer Farbstoff lagert sich an Phosphaten an. Als zweites wird Iodid dazugegeben. Kv+ und Iodid (I-) lagern sich zu seinem stabilen Substrat zusammen (Kristallviolettiodkomplex). Nun extrahiert man die Zellen mit Alkohol. Nun verlieren die gram-negativ Bakterien die Farbe und die gram-positiven behalten die Farbe. Für die Bakterien, die sich wieder entfärben gibt man Gegenfärbung dazu um sie sichtbar zu machen. Gram-positiv = haben dicke Peptidoglykanschicht. Gram-negativ = haben nur dünne Peptidoglykanschicht, aber dazu eine LPS Schicht. (Ist aber nicht zu 100 % so!! Denn es gibt auch noch andere Faktoren, die den Farbstoff zurückhalten) rechts: Mischkultur aus beiden. Man kann Kokken und Stäbchen sehen. Es ist nicht nötig eine Kultur anzulegen, ein Isolat zu erzeugen. Man kann einfach eine Matrix nehmen, die so besteht. Staphylococcus Stunden alte a:a: Staphylococcus aureus, 24 aureus, Stunden alte24 Kultur b:b: Escherichia coli, 24 Stunden alte Stunden Kultur Escherichia coli, 24 alte Kultur c: Staphylococcus aureus / Escherichia coli Mischkultur Kultur c: Staphylococcus aureus / Escherichia coli Mischkultur Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 69 lOMoARcPSD|22121835 4 2.2) Oxidase-Test: Testes auf Anwesenheit auf Cytochrom-C-Oxidasen in Atmungskette von Bakterien, die Sauerstoff als endgültigen Elektronenakzeptor verwenden. Man bietet Bakterieum auf Agarplatte eine künstliches Substrat an. - Ring wird oxidiert von Cytrochrom C und gibt zwei Elektornen ab - Diese Verbindung vor der Elektronenabgabe ist farblos. Nach Abgabe der Elektronen, also nach Oxidation, liegen DB vor, und es färbt sich blau. TMPD = Tetramethyl-para-phenylndiamin: mit diesem Enzym kann man Substrat nachweisen. Oxidasereaktion, positiv: Pseudomonas coli Oxidasereaktion, positiv: Pseudomonas aruginose, negativ: Escherichia aruginose, negativ: Escherichia coli Quelle: Alexander, Strete: Mikrobiologisches Quelle: Alexander, Strete: Mikrobiologisches Grundpraktikum. Ein Farbatlas, Pearson Pearson Studium Studium Grundpraktikum. Ein Farbatlas, Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 70 lOMoARcPSD|22121835 TMPDred Weg über Cytrochrom-C. Ist dieses Enzym vorhanden, kann blau Färbung eintreten. Ist es nicht vorhanden, dann auch keine Färbung. Geht nur mit Reinkultur, keine Mischkultur 2e- TMPDox 7 3)Bunte-Reihe-Tests: Kann man nur während dem Wachstum einsetzen, daher Inkubation nötig. Daher nicht als Schnelltest geeignet. von links nach rechts: Harnstoff-Agar Citrat-Agar Kligler-Agar (H2S-Bildung) ganz links: Harnstoffagar. Zeigt ob Organismen Harnstoff hydrolysieren kann oder nicht. Indikator hierbei ist Phenolrot. Es zeigt eine Alkalisierung an. Anzeige ab PH-Wert größer als 8,2. Schlägt dann von gelb nach rot um. Hintergrund: Harnstoff wird gespalten in CO2 und 2NH3, daher Farbumschlag. Mitte: Citrat-Agar: Prüft ob MO Citrat abbauen kann um es als Energiequelle zu nutzen. Wenn ja, dann entsteht Ammoniak. Indikator ist hier: Bromthymolblau. Farbumschlag von grün nach blau, wenn der PH über 7,6 steigt. Rechts: „Klinger-Agar“: prüft ob H2S-Bildung vorliegt. Bei Anwesenheit von Sulfiden fällt Eisen aus. Fe2++H2S -> FeS Physiologische Differenzierung Harnstoff abbau Citrat abbau H2SBildung Indolbildung Escherichia coli - - - + Salmonella enterica - + + - Shigella dysenteria - - - +/- Serratia marcescens - - - - Proteus mirabilis + +/- + - wenn man diese bunten Test auswertet, erhält man „plus“ oder „minus“ (wenn Eigenschaft zutrifft oder nicht) und kann nun in der Datenbank nachgucken. Typisches Plus-Minus-Muster für Bakterien. Allerdings gibt es auch Eigenschaften, die nicht immer plus sind oder minus. Das macht die Auswertung schwierig 71 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Harnstoff abbau Citrat abbau H2SBildung Indolbildung Escherichia coli - - - Salmonella enterica - + + - Shigella dysenteria - - - +/- + Serratia marcescens - - - - Proteus mirabilis + +/- + - Escherichia coli 1 1 1 98 Salmonella enterica 1 95 95 1 Shigella dysenteria 0 0 0 45 Serratia marcescens 0 30 0 0 Proteus mirabilis 98 65 98 2 %-Zahlen, der Stämme, die die Eigenschaft ahben von einer Art! -> nicht jeder Stamm hat die Eigenschaft! Daher muss man mit Wahrscheinlichkeiten rechnen Vorgefertigte Teststreifen. Numerische Indentifizierung: Man nimmt die Daten „Plus“ und „Minus“ und lässt vom PC ausrechnen, wie wahrscheinlich es ist, dass ein bestimmtes Bakterium vorliegt. Denn es hat ja nicht jeder Stamm die Eigenschaft Bunte-Reihe Test kann man nur machen, wenn Organismen auch kultivierbar sind. Daher wurden weitere Test eingeführt: Diversität von Zellmembran-Fettsäuren OH 18 COOH COOH 2- oder 3-Hydroxyfettsäuren Palmitat (16:0) 9 6 -Linolensäure (18:3 cis 6,9,12) 18 9 COOH COOH 12  15 12 COOH 9 COOH   -Cyclohexylfettsäure COOH COOH 19:0 cyclo 11-12 Paracoccus alkenifer 14:0 16:0 2 3 34 Bacillus circulans 14 9 zeigt Diversität 9 7 11 87 Tuberculostearinsäure Pseudomonas Rhodococcus aeruginosa globerolus 30 COOH 18 1 10 14 32 15:0 iso 15:0 anteiso 17:0 anteiso 18:0 10methyl COOH -> jedes Fettsäureprofil ist typisch für ein Bakterium, wegen hoher Diversität Ölsäure (18:1 cis 9) 9 11 17:0 anteiso (14methyl 16:0) 16:1 cis9 16:1 cis10 18:1 cis9 18:1 cis11 9 Vaccenic acid (18:1 cis 11) COOH 10:0 3OH 12:0 3OH 18 11 COOH 17:0 iso (15methyl 16:0) Fettsäure [%] -Linolensäure (18:3 cis 9,12,15) Palmitoleinsäure (16:1 cis 9) 18 4)Chemotaxonomie: Prüfen auf Vorhandensein von bestimmten chemotaxischen Komponenten. Z.B. Fettsäureprofil in der Bakterien Membran 15 50 6 14 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) 72 lOMoARcPSD|22121835 MIDI System - Fettsäureanalyse Computer analysiert & wertet aus -> “Gaschromatographie” 5) Genetische Methoden: z.B. PCR (Polymerasekettenreaktion) -> Nachweismethode. Polymerase Kettenreaktion (PCR) - Aufschmelzen der Ziel-DNA - Spezifische Primer für beide Stränge der Ziel-DNA 3' 3' - Hybridisierungs-Bedingungen 5' 3' - Polymerisation mit TaqPolymerase bei 72°C - Aufschmelzen des neuen Doppelstranges bei 95°C - Wiederholung des Zyklus: - Anlagerung (40-60°C) - Polymerisation (72°C) - Aufschmelzen (95°C) 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 5' Nachweis des PCRProduktes durch AgaroseGelelektrophorese RealtimePCR 2x! passende Primer werden dazugegeben, dadurch wird Polymerase so eingeschränkt, dass sie nur einen bestimmten Bereich synthetisiert. Hybridisierung-Bedingungen müssen passen: z.B optimale Temperatur für den Primer Taq-Polymerase ist sehr hitzestabil. Wichtig, das sie auch die 95° überstehen müssen. Methode um gezielte DNA-Abschnitte zu amplifizieren. Nun wird DNA-Probe aufgetragen um nachgewiesen werden zu können. entsteht das richtige Bild, gilt es als Nachweis. Standards Penicillium-DNA 568 ng/µl Penicillium-DNA 56,8 ng/µl Penicillium-DNA 5,68 ng/µl Penicillium-DNA 0,568 ng/µl Penicillium-DNA 0,0568 ng/µl Es gibt auch die „Real-Time-PCR. -> geht sehr schnell. Während DNAProbe durch das gel läuft bekommt man schon Ergebnisse. Jemehr Ziel-DNA drin ist, desto schneller beginnt der Eintritt in die exponentielle Phase. Nachteil: Nachweis von vorhandener DNA, d.h. können auch tote Zellen sein, die nachgewiesen werden 73 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 6) Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung (FISH): keine Aufschmelzung nötig (wie davor), da Methode auf natürliche einzelstrang DNA abzielt. Nämlich mRNA rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden (FISH) 5S rRNA 23S rRNA 32 Proteine 16S rRNA 21 Proteine Ribosom (103 - 105 pro Zelle) ca. 1600 Basen 19 rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden Cy3-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' |||||||||||||||||| 3‘-CGACGGAGGGCAUCCUCU-5‘ | | 338 355 ca. 1600 Basen 20 74 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Fixierung/ Permeabilisierung Permeabilisierung: d.H. die Membran wird durchlöchert, so dass man mit “Sonden” (Cy3) in die Zelle vordringen kann um Basensequenzen zu makieren Fixierung/ Permeabilisierung Cy3 Hybridisierung/ Waschen Hybridisierung/ Waschen 21 MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorptionionisationtime-of-flight mass spectrometry) 7) „MALDI-TOF“- Methode: Proteine sichtbarmachen mit physikalisch-chemischer Methode. Kann Proteine auf Grund ihre Massen von einander Trennen. Identifiziert also Proteinmuster von Bakterien. Bruker MALDI Biotyper Probe wird mit Laserstrahl beschossen. Laserstrahl schießt dadurch Fragmente heraus. Fragmente fliegen nun im Flugrohr. Unterschiedlichen Massen werden bestimmt und eine Liste mit Massenfragmenten werden erstellt. Prinzip MALDI-TOFMassenspektrometrie aus: Stryer, Biochemie, Springer Spektrum Elsevier, 7. Auflage, 75 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) Intens. [a.u.] lOMoARcPSD|22121835 x10 4 0_C5_1SLin 4363.706 1.50 E. coli 1.25 5381.126 1.00 6254.549 0.75 0.50 7272.673 9534.653 3128.331 8368.182 Intens. [a.u.] 0.25 0.00 0_K5_1SLin 6886.619 5000 S. aureus 4000 Vorteil: fast kein Materialverbrauch Nateil: Massenspektrometer ist sehr teuer in der Anschaffung. 3000 5524.344 2000 3444.895 9622.480 4813.505 unterschiedliche Massen sind zurück zu führen auf ribosomale Proteine. Daher sind die Diagramme (Massenspektogram) bekannt für bestimmte Bakterien. Der PC vergleicht die Datenbank und sagt, welches Bakterium vorliegt 1000 6422.355 2763.332 8087.417 4046.326 8887.390 10479.875 0 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z 8) Ribotyping: : jedes Fragment wird markiert, welches eine 16-S-Gen trägt. Muster entsteht, je nach Spezies oder Stamm. Prinzip: Verteilung von Schnittstellen und rRNA Genen im Gesamtgenom Restriktionsverdau Fragmenttrennung Hybridisierung DuPont Qualicon RiboPrinter® System automatisiert: DNA Präparation Restriktionsverdau mit EcoRI Elektrophoretische Trennung nach Molekulargewicht Transfer auf eine Membran Hybridisierung mit einer markierten Sonde Inkubation mit einem chemi luminiszierenden Substrat Nachweis der Fragmentmuster mit einer CCD Kamera Dauer ca. 8 Stunden 28 76 Downloaded by purma firewolf ([email protected]) lOMoARcPSD|22121835 Für welche Methode entscheidet man sich nun? Das kommt darauf an...: Bewertung der Identifizierungsmethoden - Zeitbedarf (z.B. zusätzliche Inkubationszeiten) Kultivierung notwendig Lebend/Tot-Differenzierung Target (Gene, Genom, Membran etc.) Investitionsmittel (Gaschromatograph, Realtime-PCR etc.) Verbrauchsmaterial (Medien, Enzyme etc.) Automatisierbarkeit (RiboPrinter) Verfügbarkeit von Datenbanken Auflösungsgrenze (Spezies/Stamm) § 64 LFGB-konform -> gesetzliche Vorgaben, welche Tests z.B glaubwürdig sind 77 Downloaded by purma firewolf ([email protected])