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FISIOLOGIA GENERALE Introduzione Fisiologia: studio delle funzioni degli organismi viventi ai vari livelli di organizzazione, per funzione si intende l’insieme dei processi che consentono il raggiungimento di uno scopo definito e utile...

FISIOLOGIA GENERALE Introduzione Fisiologia: studio delle funzioni degli organismi viventi ai vari livelli di organizzazione, per funzione si intende l’insieme dei processi che consentono il raggiungimento di uno scopo definito e utile per l’organismo. Relazione struttura-funzione: la funzione svolta da una cellula dipende dalla sua struttura; dalla struttura di conseguenza posso fare ipotesi sulla funzione svolta da quella cellula. 1. Esempio a livello molecolare: canale del potassio. Il canale del K+ presenta in corrispondenza del poro una sequenza di aa che ricostruisce intorno allo ione una rete di interazioni simile a quella che lo ione K+ forma con le molecole di H2O. È questo un esempio di come la struttura di una specifica porzione di una proteina sia collega ad una funzione fondamentale, la permeabilità ionica delle membrane cellulari. Per questo Na+ non passa, perché interagisce con l’acqua in modo diverso, gli AA riescono a spiazzare i dipoli acquosi del potassio ma non del sodio che rimarrà più grande e non passerà dal canale del potassio. 2. Esempio a livello sopramolecolare: sarcomero Nel sarcomero le proteine sono organizzati in filamenti sottili e spessi parzialmente sovrapposti e nella contrazione scorrono gli uni sugli altri determinando l’accorciamento del sarcomero e conseguentemente del muscolo. Omeostasi: capacità degli organismi di mantenere una relativa stabilità interna anche se all’esterno avvengono dei cambiamenti. Negli organismi unicellulari è controllata dalla membrana permeabile, negli organismi pluricellulari è controllata anche da liquidi interstiziali e sangue. Ci sono due meccanismi di regolazione: 1. Feed-forward, il sistema prevede il disturbo che avverrà e crea in anticipo una soluzione di risoluzione 2. Feed-back, la risposta avviene dopo che un elemento del sistema lo ha allontanato dal suo stato stazionario La condizione di mantenimento dell’ambiente interno non è una condizione di equilibrio (quando un sistema rimane invariato senza dispendio di energia), lo stato stazionario non significa equilibrio perché è costante ma con dispendio di energia. Feed-back negativo L’omeostasi viene mantenuta grazie alla regolazione delle variabili mediante un sistema di controllo che annulla gli effetti di eventuali perturbazioni. La variabile regolata è mantenuta a un certo valore di riferimento (set point) dai recettori che dicono continuamente il valore della variabile al sistema di controllo. Il sistema di controllo è una struttura che è in grado di confrontare il valore della variabile con il valore di riferimento. Dal confronto viene generato un segnale d’errore che viene amplificato e costringe il sistema controllato a portare la variabile al valore di riferimento. Un esempio di feed back negativo è la regolazione della pressione arteriosa (pressione arteriosa media: 100mm/hg). Le variazioni della PA sono registrate dai barocettori aortici e carotidei che inviano afferenze al centro cardiovascolare bulbare (sistema di controllo) dove avviene il confronto con il punto di riferimento e viene generato il segnale di errore che agisce sugli effettori autonomi che regolano cuore e vasi sanguigni. Il valore delle resistenze periferiche (arteriole) dipende dalla vasocostrizione, controllano la quantità di sangue che fluisce; il valore della gittata cardiaca indica la quantità di sangue immessa in circolo nell’unità di tempo e dipende dalla forza con cui si contrae il cuore e dalla frequenza del battito cardiaco. (nell’immagine quello in rosa è il sistema di controllo e quello azzurro è il sistema controllato). Il centro cardiovascolare bulbare confronta la pressione arteriosa misurata e quella di riferimento. Plasticità: capacità delle varie funzioni biologiche di modificarsi in maniera permanente a fronte delle mutate condizioni ambientali (non cambiano il genoma). Il concetto di plasticità deve essere distinto dal concetto di adattamento: infatti con adattamento si identifica il processo mediante cui la selezione naturale, nell’ambito di una popolazione, in un particolare ambiente, modifica la frequenza di geni codificanti caratteri che massimizzano la sopravvivenza e la riproduzione degli individui (esempio: capacità di resistenza ad agenti microbici, acclimatazione all’altitudine, plasticità sinaptica) , mentre con plasticità si evidenzia la possibilità dello spostamento del punto di riferimento in un sistema controllato.  Membrana Cellulare Barriera selettiva e permeabile che separa l’ambiente intracellulare da quello extracellulare, garantendo il mantenimento di un ambiente interno costante e, allo stesso tempo, permettendo gli scambi di nutrienti, gas, energia e informazioni necessarie alla vita cellulare. L’ambiente intracellulare è caratterizzato da basso cloro e sodio mentre quello extracellulare è il contrario. La membrana non è soltanto una zona passiva di confine e di transito ma è anche una zona attiva di riconoscimento di molecole, quando i recettori riconoscono una sostanza la membrana si modifica e può comunicare con cellule vicine (riconosce molecole, genera segnali per il riconoscimento cellulare). Funzioni Separazione liquido intra-extra cellulare Regolazione degli scambi con l’ambiente esterno Comunicazione tra cellula e ambiente, grazie ai recettori di membrana Stabilizzazione della struttura dei tessuti, grazie all’interazione con proteine del citoscheletro e la formazione di giunzioni tra cellule adiacenti Struttura modello a mosaico fluido, matrice lipidica in cui sono inserite molecole proteiche. Storia dello sviluppo dei modelli di membrana inizio: Alla fine del XIX secolo Overton ipotizzò la presenza di una membrana cellulare di natura lipidica in base all’osservazione che le sostanze apolari passavano all’interno delle cellule Nei primi anni del XX secolo Langmuir dimostrò che i fosfolipidi si dispongono sull’acqua formando un monostrato in cui le teste polari sono a contatto con l’acqua e le code idrofobiche verso l’aria. Nel 1925 Gorter e Grendel fecero un esperimento dove dimostrarono che i fosfolipidi si organizzano in doppio strato. Estrassero i fosfolipidi dalla membrana e li disposero su una superficie acquosa a formare un singolo stato (quando formano un monostrato non si registra variazione di forza, se comprimo ulteriormente invece si registra una variazione di forza e anche quando i fosfolipidi occupano il maggior spazio possibile si registra una variazione di forza). Con una bilancia (bilancia di Langmuir) misurarono la forza del monostrato di lipidi, e quindi l’area occupata dal monostrato di lipidi. Quest’ultima era doppia di quella occupata dalla cellula quindi i fosfolipidi dovevano essere disposti per forza in doppio strato. Misura dello spessore del doppio strato (non con il microscopio ma con un metodo elettrico) Esperimento Gorter e Grendel (1925) misurarono con una bilancia di Langmur l’area occupata dal monostrato di fosfolipidi estratti da globuli rossi sottoposti a lisi osmotica. Il doppio strato di lipidi funziona come un condensatore. I condensatori sono elementi elettrici in grado di accumulare la carica; senza condensatore le cariche fluiscono, mentre se c’è un condensatore c’è una parte che non conduce e le cariche si fermano sull’armatura, ciò porta ad un accumulo di carica. Più cariche si aggiungono più aumenta la differenza di potenziale, quando questa differenza raggiunge quella che aveva dato il caricatore, il condensatore è carico e non si ha più il passaggio di corrente e questa si ferma. C=Q/V capacità del condensatore C=ε*S/d Misura dello spessore del doppio strato: Cm=1uF/cm2 capacità di membrana, è la stessa per tutte le membrane (tranne cell. muscolari) Cm/S = 10-6 F/cm2 Cm = εlipidi *S/d con: εlipidi =5*10-13F/cm d = εlipidi *S/Cm = 5*10-7cm = 50 Å spessore doppio strato fosfolipidi Rm*S = 2 kΩ*cm2 εlipidi costante dielettrica dei lipidi, S superficie, d distanza tra le armature La capacità elettrica della membrana, 1μF/cm2, è quella attesa da un doppio strato lipidico dello spessore di 50 Å Sviluppo dei modelli di membrana continuo: 1935 Davson e Danielli, proposero il modello a sandwich della membrana, in cui le teste polari dei due foglietti esterni sono rivestite di proteine. Successivamente ipotizzarono anche la presenza di pori proteici nella tela fosfolipidica per giustificare il passaggio di ioni attraverso le membrane. 1960 Robertson, propose il modello di membrana unitaria, in cui tutte le membrane avevano due foglietti elettrondensi esterni separati da una porzione chiara centrale. 1972 Singer e Nicolson, proposero il modello a mosaico fluido, in cui le proteine erano inserite in maniera discontinua in un doppio strato lipidico fluido. Negli anni successivi la struttura di alcune proteine di membrana è stata definita a livello atomico. Freeze etching o criodecappaggio della membrana La digestione enzimatica con un enzima proteolitico provoca la perdita progressiva di particelle immerse nella membrana, messe in evidenza con la tecnica del congelamento e frattura. Lipidi di membrana Fosfolipidi, barriera impermeabile alle molecole polari e permeabile alle apolari. I glicerofosfolipidi sono costituiti da glicerolo esterificato con 2 acidi grassi (saturi o insaturi) e 1 molecola di acido fosforico che contrae un altro legame estereo con un alcool (inositolo/glicerolo), con un AA (serina) o con una base azotata (colina/etanolamina). La presenza di doppi legami nelle catene alifatiche determina deviazione dalla linearità della catena. Sfingolipidi, al posto del gicerolo c’è la sfingosina legata ad un acido grasso e fosforilcolina nella sfingomielina (fosfosfingolipidi) o ad un acido grasso e residui saccaridici nei cerebrosidi e nei gangliosidi (glicosfingolipidi). Colesterolo, costituito da un nucleosteroideo con un gruppo alcolico, aumenta la resistenza meccanica e la viscosità I lipidi sono molecole mobili (si muovono da un foglietto all’altro, uno con l’altro e provocano agitazione termica). La composizione in lipidi dei due foglietti non è la stessa: fosfatidilcolina e sfingomielina si trovano preferenzialmente nel foglietto esterno, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilinositolo in quello interno. L’asimmetria dei due foglietti permette la distinzione tra cellule vive e cellule morte. Infatti, quando la cellula va incontro a morte cellulare programmata (apoptosi) la fosfatildiserina viene traslocata rapidamente dal monostrato citosolico al monostrato extracellulare, costituendo un segnale che permette alle cellule vicine (per es. i macrofagi) di riconoscere le cellule morte da fagocitare. La fluidità della membrana dipende dalla temperatura (più è alta più aumenta), dalla lunghezza delle catene alifatiche (acidi grassi lunghi diminuiscono la fluidità) e dalla presenza di doppi legami (aumentano la fluidità). Il colesterolo stabilizza la membrana a alte temperature mentre fluidifica la membrana a basse temperature. Proteine di membrana Estrinseche (periferiche), non attraversano il doppio strato, sono legate alla superficie interna o esterna della membrana attraverso legami non covalenti (es. legami a H), oppure sono ancorate alla superficie della membrana attraverso un legame covalente con la testa idrofilica o le catene di acidi grassi dei fosfolipidi (secondo alcuni queste proteine sono classificate integrali). Intrinseche (integrali), attraversano il doppio strato e stabiliscono legami idrofobici con le catene alifatiche dei fosfolipidi. Le proteine si muovono nel doppio strato lipidico Esperimento di recupero della fluorescenza dopo sbiancamento in mioblasti trattati con una proteina fluorescente in grado di legarsi alle glicoproteine di membrana, dimostra che le proteine non sono fisse ma si muovono. La ricomparsa della fluorescenza in un’area circoscritta della membrana permette di definire la percentuale di glicoproteine mobili e la velocità con cui diffondono. Nel grafico c’è il tempo e l’intensità della fluorescenza, si ha un andamento esponenziale con arrivo ad un plateau (sotto alla colorazione iniziale). Il tempo di 1/2 è il tempo al quale l’intensità raggiunta è metà rispetto all’intensità finale Funzioni delle proteine di membrana Trasporto: canali ionici, trasportatori, pompe ioniche Stabilità strutturale: proteine strutturali (giunzioni, molecole di adesione, citoscheletro) Trasduzione di segnali: recettori di membrana Attività enzimatica: enzimi  Trasporti di membrana Tipi di trasporto nella membrana cellulare Trasporti passivi (equilibranti): diffusione semplice, trasporto per canali, diffusione facilitata. ΔG≤0 secondo gradiente, la forza è data dalla differenza di concentrazione. Trasporti attivi (non equilibranti): trasporto attivo primario, trasporto attivo secondario. ΔG≥0 contro gradiente, la forza è data dall’ATP e dal trasporto secondo gradiente di una sostanza. La differenza di energia libera (ΔG) ai due lati della membrana per una sostanza X elettricamente carica, considerando un trasporto diretto verso l’interno della cellula, è data dalla seguente equazione: ΔG=RTln[xi]/[xo] +ZXF(EI-EO) in cui RTln[xi]/[xo] è la differenza di energia potenziale chimica e ZXF(EI-EO) la differenza di energia potenziale elettrica. Nel caso in cui la sostanza X fosse elettricamente neutra ΔG diventerebbe: ΔG=RTln[xi]/[xo] (R, costante universale dei gas, T, temperatura in gradi Kelvin, z, carica, F, costante di Faraday, E, potenziale elettrico [fuori+, dentro-]) Diffusione semplice (passivo) Trasporto passivo nel quale solo piccole molecole parzialmente polari e molecole più grandi apolari possono attraversare liberamente il doppio strato fosfolipidico della membrana cellulare (acqua, azoto, ossigeno…) In questo caso il trasporto non si serve di alcun apparato di membrana e le sostanze si diffondono liberamente per osmosi, ovvero spostandosi in base al gradiente di concentrazione, da dove è più alta a dove è più bassa → senza dispendio di energia. Il flusso netto (ds/dt) è proporzionale al gradiente di concentrazione (dc/dx) e all’area (A) della superficie attraverso cui la sostanza diffonde secondo la costante di proporzionalità D (coefficiente di diffusione, di solito espresso in cm2/s). Legge di Fick: 𝐝𝐬 𝐝𝐜 flusso= = −𝐃 ∗ 𝐀 ∗ 𝐝𝐭 𝐝𝐱 𝐝𝐬 𝐝𝐜 Flusso per unità di superficie: = −𝐃 ∗ 𝐝𝐭∗𝐀 𝐝𝐱 D=(Kb*T) /(6πηr) è direttamente proporzionale alla temperatura e inversamente proporzionale al raggio delle molecole e alla viscosità della soluzione. (kb= costante di Boltzmann, 1.38·10-23J/K; T= temperatura assoluta (K); η= viscosità (Pa·sec) r= raggio della particella) Non abbiamo considerato la membrana permeabile, le sostanze che passano nella membrana devono sciogliersi in essa, ciò dipende dalla solubilità, le sostanze devono avere quindi un certo grado di liposolubilità. Nella membrana dc/dx è dato da: 𝒅𝒄 (𝑪𝒎𝟐 − 𝑪𝒎𝟏) (𝑪𝟐 − 𝑪𝟏) = =𝜷 𝒅𝒙 ∆𝒙 ∆𝐱 Dove β=[s]olio/[s]acqua è il coefficiente di ripartizione olio- acqua, quindi le sostanze possono attraversare le membrane mediante diffusione semplice se sono solubili nel doppio strato lipidico e l’equazione di Fick diventa: 𝒅𝒔 ∆𝒄 = −𝑫 ∗ 𝑨 ∗ 𝜷 ∗ = −𝑷 ∗ 𝑨 ∗ ∆𝑪 𝒅𝒕 ∆𝒙 Dove P (= Dβ/Δx) = cm/s è il coefficiente di permeabilità e Δx è lo spessore della membrana non mostra saturazione con l’aumentare del gradiente non c’è competizione tra sostanze diverse La permeabilità delle sostanze aumenta all’aumentare del coeff. β (liposolubilità), che è il fattore principale della diffusione. Spessore membrana Δx=50*10-8cm (?) Quando si ha un passaggio di molecole cambia solo la concentrazione intracellulare perché fuori il volume è troppo grande per sentire variazioni. Velocità di permeazione: Le curve mostrano come cresce la Ci delle sostanze A, B….F che attraversano la membrana con permeabilità decrescenti. La Ce è costante e la Ci iniziale è zero. Le Ci crescono con legge esponenziale: 𝑽 𝑪𝒊, 𝒕 = 𝑪𝒆(𝟏 − 𝒆−𝒕/𝝉 ) dove 𝝉= 𝑨∗𝑷𝒙 costante di tempo V= volume della cellula A= Area della membrana Px= Permeabilità alla sostanza x 𝑽 𝑪𝒊, 𝒕 = 𝑪𝒆(𝟏 − 𝒆)−𝒕/(𝑨∗𝑷𝒙) La costante di tempo (τ, il tempo necessario affinché la Ci abbia raggiunto il 63% del valore finale) è inversamente proporzionale a P e direttamente proporzionale al rapporto volume/superficie (V/A). Sostanze con P più grande e rapporto V/A più piccolo penetrano più velocemente nella cellula. Se il rapporto V/A è più grande, è più grande anche il tempo e la sostanza quindi passa più lentamente; per questo le cellule sono piccole (Es. sfera V/A=1/3r). Esercizi 1. Due sostanze A e B diffondono attraverso una membrana. DA= DB= 10-5 cm2/s, coefficienti di ripartizione βA= 0.001 e βB= 0.01. Quale delle due sostanze raggiungerà prima l’equilibrio? Perché? La sostanza B perché ha un coefficiente di ripartizione olio/acqua 10 volte più grande e quindi una P 10 volte più grande. 8P=β × D/Δx PA=10-5 cm2/s × 0.001/50 × 10-8 cm= 0.02 cm/s PB=10-5 cm2/s × 0.01/50 × 10-8 cm= 0.2 cm/s 2. Acetamide e urea hanno lo stesso coefficiente di diffusione in soluzione acquosa (1.35 x 10- 5cm2/s) mentre il coefficiente di ripartizione olio/acqua dell’acetamide (2.1 x 10-5) è 6 volte più grande di quello dell’urea (0.35 x 10-5). Calcolare la costante di permeabilità P delle due sostanze attraverso la membrana cellulare. P=β×D/Δx Pacetamide= 2.1 ×10-5×1.35 ×10-5cm2/s /50 ×10-8 cm= 5.67 ×10-4cm/s Purea= 0.35 ×10-5×1.35 ×10-5cm2/s /50 ×10-8 cm= 9.45 ×10-5cm/s 3. Il grafico (vedi slide) mostra l’andamento temporale del passaggio di un soluto in una cellula sferica del raggio di 100 μm. Calcolare la permeabilità della membrana alla sostanza. Si misura τ, il tempo al quale la Ci è diventata il 63 % del valore finale (Ce= 0.15 M), τ =0.55 minuti= 33 s P= V/(A×τ). V/A nella cellula sferica è r/3= 100×10-4/3 cm P= 100×10-4/(3×33)= 10-4 cm/s Osmosi Diffusione dell’acqua da una soluzione più diluita ad una soluzione più concentrata (l’acqua segue il proprio gradiente di concentrazione). In presenza di un gradiente di acqua, il movimento dell’H2O cambia il volume (o la pressione) intracellulare fino al raggiungimento dell’equilibrio osmotico. π= pressione osmotica 𝝅𝑽 = 𝒏𝑹𝑻 𝝅 = 𝒄𝑹𝑻 𝒏𝑹𝑻 ∆𝝅 = ∆𝑪𝑹𝑻 𝝅= 𝑽 Con: c= 1M e T= 273K: π= 1 mol/l 0.082 l*atm/mol*K 273K= 22.4 atm Esempio GLU 2M GLU 1M diventa 1,5 M a destra e a sinistra 2mol/x= 1,5mol x=1,33l Osmolarità e tonicità Osmolarità: una proprietà colligativa delle soluzioni, equivale al numero di particelle nell’unità di volume, non tiene conto delle caratteristiche di permeabilità della membrana. Isosmotica: due soluzioni che esercitano la stessa pressione osmotica attraverso la membrana permeabile all’acqua Iposmotica: soluzione che esercita pressione minore Iperosmotica: soluzione che esercita pressione maggiore Tonicità: concetto fisiologico che tiene conto della effettiva permeabilità della membrana ai diversi soluti (comportamento di cellula e tessuti quando vengono immersi in una soluzione). Isotonica: la cellula se inserita in una soluzione mantiene inalterato il volume cellulare Ipotonica: il volume cellulare aumenta Ipertonica: il volume cellulare diminuisce I soluti permeabili non contribuiscono alla tonicità di una soluzione. Variazione di volume in un globulo rosso (sistema a pressione costante) in relazione alla tonicità del mezzo esterno. Una soluzione salina 0.25 M è una soluzione ipoosmotica e ipotonica in quanto il numero di particelle di soluto non permeante è inferiore a quello del citosol e provoca rigonfiamento cellulare. Una soluzione isoosmotica può essere ipotonica Una soluzione con 0.25 M di sali e 0.5 M di glicerolo è isoosmotica ma ipotonica. La soluzione extracellulare ha la stessa osmolarità del citosol, ma il glicerolo (che contribuisce per il 50% all’osmolarità extracellulare) è un soluto permeabile e non contribuisce alla tonicità extracellulare: la cellula si rigonfia e quindi la soluzione è ipotonica, come nell’esempio riportato nella figura in alto, perché la concentrazione di soluto non permeante è minore di quella citosolica. L’aggiunta di un soluto a cui la membrana è permeabile non cambia la tonicità del mezzo, ma ha solo effetti osmotici transitori. Una soluzione iperosmolare può essere isotonica L’aggiunta di glicerolo 1 M alla soluzione extracellulare ne raddoppia l’osmolarità, ma non ne cambia la tonicità e determina solo una diminuzione transitoria del volume cellulare. La concentrazione di soluti non permeanti è la stessa di quella citosolica. La Tonicità di una soluzione dipende dalla concentrazione osmolare dei soluti non permeanti. Volume osmoticamente inerte: Esperimento Modificazione del volume della fibra del muscolo sartorio di rana in seguito alla variazione di concentrazione della soluzione di Ringer, espressa come tonicità in rapporto ad una soluzione di Ringernormale. Ordinata: rapporto tra volume finale della fibra Wf e volume iniziale, Wi. Vengono testati gli effetti quando l’osmolarità viene raddoppiata aggiungendo: Glicerolo (meno permeabile dell’acqua) Xilosio (non permeante) Etanolo (molto permeabile) La tonicità è inversamente proporzionale al volume. Intercetta l’asse y su un valore di 0,2 se fosse su 0 vorrebbe dire tonicità infinita, il 20% del volume cellulare non è mobile, non si scambia, è il volume osmoticamente inerte. Quindi, non tutta l’acqua presente nella cellula partecipa agli scambi. La parte di acqua legata ai soluti costituisce un volume osmoticamente inerte, che deve essere sottratto al volume cellulare per verificare che la cellula si comporta come un osmometro. Effetti osmotici permanenti e transitori: π=CRT ∆π=∆CRT C data da soluti con P simile a 0 → effetti osmotici permanenti C data da soluti con P molto maggiore di 0 → effetti osmotici transitori Il soluto permeabile si distribuisce all’equilibrio secondo l’equazione 𝑪𝒊, 𝒕 = 𝑪𝒆(𝟏 − 𝒆−𝒕/𝝉 ) dove τ= V/(A*Px) V = volume della cellula A = area della membrana Px= permeabilità alla sostanza x Il processo è più rapido (τ più piccola) quando P e il rapporto A/V sono più elevati Risposta della singola fibra muscolare ai cambiamenti di osmolarità del mezzo esterno: (a) in 2 la fibra viene immersa in soluzione fisiologica (Ringer) con osmolarità doppia; in 3 la fibra viene riportata in Ringer normale; in 4 l’osmolarità viene raddoppiata aggiungendo un non-elettrolita (alcool etilico) e in 5 la fibra viene riportata in Ringer normale. (b) e (c) stessa serie di cambiamenti effettuata con soluti diversi: (b) xilosio, non permeante e (c) glicerolo, permeante. In 6 (c) la fibra viene posta in Ringera osmolarità doppia e in 7 viene riportata in Ringer normale. Quando raddoppio osmolarità con etanolo (molto permeabile) non si ha variazione di volume quando raddoppio osmolarità con xilosio (ipertonica) si ha richiamo di acqua all’esterno e quindi si ha una riduzione di volume che si mantiene finché è presente xilosio. Quando raddoppio osmolarità con glicerolo (permeabile meno dell’acqua, si raggiunge lo stesso volume iniziale perché il glicerolo è uguale dentro e fuori, l’acqua entra con la velocità con cui il glicerolo permea la membrana) si ha una riduzione di volume che nel tempo lentamente ritorna al valore che aveva prima della perturbazione. Esercizi 4. In quale direzione ci sarà movimento di H2O in ciascuna delle seguenti situazioni? 1. 0.1M glucosio (PM 180) 2. 0.1M saccarosio (PM 342) Nessun movimento netto. Le due soluzioni sono isoosmolari 1. glucosio 1g/l 2. saccarosio 1g/l Verso sinistra. Le concentrazioni infatti sono 5.56 mOsm nel compartimento 1 e 2.92 mOsm nel compartimento 2. 1. 100 mM NaCl(PM 58) 2. 100 mM glucosio Verso sinistra. L’NaCl si dissocia e quindi il numero di particelle osmoticamente attive nel compartimento 1 è doppio rispetto al compartimento 2 1. 10 mM albumina (PM 66000) 2. 10 mM glicina(PM 75) Nessun movimento netto. Le due soluzioni sono isosmolari 1. Insulina 10 g/l (PM 5800) 2. glicina1g/l Verso destra. La concentrazione osmolare di glicina(13 mOsm) è circa 8 volte più grande di quella dell’insulina (1.7 mOsm) 150 mM KCl(PM 74) 210 mM glucosio, 20 mM saccarosio, 40 mM glicina Verso sinistra. Nel compartimento 1 l’osmolarità è 100 mOsm, mentre nel 2 è 70 mOsm 5. Una fibra muscolare di mammifero, assumibile come un cilindro perfetto, ha raggio r =60 μm. La lunghezza è tale che l’area della superficie di base è trascurabile rispetto a quella della superficie laterale. Dopo aggiunta di glicerolo 300 mM alla soluzione fisiologica, la fibra mostra una rapida diminuzione di volume e quindi un recupero del volume iniziale con un andamento esponenziale con τ= 2 min. Calcolare il valore di P glicerolo(cm/s). τ=V/(A×P) V= π×r2×l A= 2π×r ×l V/A= r/2 P=V/(A ×τ)= r/(2 τ) Pglicerolo= 60 ×10-4cm/(2 ×120) s= 2.5 ×10-5cm/s 6. Se sottoponiamo allo stesso trattamento una fibra nervosa con r quattro volte minore e P glicerolo due volte minore: a: la τ del recupero di volume diventa la metà b: la τ non cambia c: la τ raddoppia a è la risposta giusta, infatti τ=V/(A×P) = r/2P diventa 2 ×r / (4 ×2 ×P) = r/4P 7. Cosa succede se per fondiamo l’uovo di Arbacia (riccio di mare) con una soluzione ottenuta mescolando acqua di mare ad un ugual volume di acqua di mare contenente glicerolo 2M, sapendo che: Pacqua= 10-3cm/s, Pglicerolo= 10-5 cm/s (dove P è la costante di permeabilità) La cellula dapprima diminuisce di volume (la P dell’acqua è maggiore di quella del glicerolo e quindi l’acqua esce per osmosi dalla cellula) e successivamente torna al volume iniziale (via via che il glicerolo entra nella cellula, l’acqua lo segue per osmosi) 7. Se aggiungiamo all’acqua di mare che bagna l’uovo di Arbacia(riccio di mare) un uguale volume di soluzione acquosa 1M di glicerolo (P = 10-5cm/s) il volume della cellula aumenta, perché? Il glicerolo permea la membrana Considerando la cellula dell’uovo di Arbacia sferica (raggio = 70 μm), definire l’andamento temporale (con calcolo della τ) dell’aumento di volume. τ= 70 ×10-4cm/3 ×10-5cm/s= 233 s 9. Una fibra muscolare di rana, assimilabile ad un cilindro di lunghezza infinita, ha un diametro =160 μm. Raddoppiamo il volume della soluzione fisiologica esterna (osmolarità normale 300 mM): (1) con acqua distillata (Pacqua=10-3cm/s) (2) con una soluzione isosmotica di glicerolo Pglicerolo= 10-5cm/s). Quale diametro (approssimativo) assume la fibra nei due casi? Lo stesso, pari a circa 1.4 volte quello nella soluzione fisiologica, infatti il volume raddoppia in entrambe le soluzioni (la loro tonicità è dimezzata): Calcolare la τ della variazione del diametro nei due casi (soluzione slide) 10. Una fibra muscolare e una nervosa di mammifero, assumibili come cilindri perfetti, hanno rispettivamente raggio rM=100 μm e rN= 20 μm. La lunghezza è tale che l’area della superficie di base è trascurabile rispetto a quella della superficie laterale. Dopo aggiunta alla soluzione fisiologica di glicerolo 300 mM, le fibre mostrano una rapida diminuzione di volume e quindi un recupero del volume iniziale con un andamento esponenziale con τM = 2 mine τN = 1 min. Calcolare il valore di Pglicerolo(cm/s) nei due casi. (soluzione slide) Migrazione nei canali (passivo) Il flusso con cui la sostanza entra nella cellula è proporzionale alla concentrazione fuori dalla cellula. La diffusione semplice non è saturante (si possono avere parziali saturazioni ma solo teoricamente). Extracellular substrate concentration I canali sono proteine interne di membrana, sono pori acquosi nella membrana che mettono in contatto l’ambiente cellulare con quello extracellulare. Gli ioni si muovono liberamente attraverso questi ultimi secondo gradiente di concentrazione. Maggiore permeabilità per uno ione significa un maggiore numero di canali per quello stesso ione. I canali non sono sempre aperti ma l’apertura è controllata da vari fattori. Classificazione dei canali in base al meccanismo di attivazione: 1. Voltaggio dipendenti, si aprono al cambiamento di ddp ai due lati della membrana (int. negativo), è chiuso in condizioni normali e si aprono quando il ddp si riduce (depolarizzazione, flusso di ioni); sono presenti nelle cellule eccitabili; sono altamente selettivi (es. Na+, Ca2+, K+, Cl-) 2. Attivazione da ligandi, attivazione attraverso il legame con ligandi nel lato extracellulare della membrana, sono anche proteine recettori perché riconoscono il ligando che le attiva; sono meno specifici, esistono canali cationici (Ca, Na, K) e anionici (Cl); sono presenti per esempio nella membrana postsinaptica 3. Attivati da secondi messaggeri, attivati da messaggeri intracellulari (es. ligandi, AMPciclico, GMPciclico); sono per lo più cationici, sono presenti per esempio nei fotorecettori e nelle cellule olfattive 4. Attivati da stimoli meccanici, attivati grazie a deformazione della membrana (rigonfia o raggrinzita), sono meccanorecettori; sono presenti in organi nervosi deputati a percepire segnali meccanici dall’esterno, segnalano le variazioni di volume 1 2 3 4 Selettività ionica dei canali Molti canali sono altamente selettivi, esempio canale voltaggio dipendente del K: Rappresentazione della struttura molecolare del canale voltaggio-dipendente del K+ e dell’ipotesi corrente sulla selettività ionica. L’ansa P in rosso che unisce i due segmenti idrofobici transmembranari 5 e 6 è affondata nella membrana. Quando le quattro subunità che formano il canale del K+ si dispongono “in cerchio” le rispettive regioni P si trovano rivolte verso l’interno del canale formando un imbuto che termina con il filtro di selettività. In C è mostrato come le cariche negative presenti nelle porzioni apicali delle anse P riescono a rimuovere la sfera di idratazione dello ione K+, ma non dello ione Na+, che pertanto non può attraversare il canale. Trasporti mediati La presenza di proteine carriers permette il passaggio di sostanze che non possono diffondere liberamente attraverso la membrana. Il trasporto mediato è caratterizzato da: Specificità, ciascuna proteina carrier opera solo su determinate sostanze Saturazione, anche in condizioni fisiologiche, il numero di proteine trasportatrici è finito, non supera un certo valore Competizione, due sostanze affini possono competere per lo stesso trasportatore Classificazione: Uniporti: viene trasportata una molecola di un solo tipo Simporti: due sostanze diverse vengono trasportate nello stesso verso Antiporti o contro-trasporti: due sostanze vengono trasportate in senso opposto Passivi: diffusione facilitata Attivi: primario e secondario Confronto diffusione semplice-migrazione nei canali-trasporti mediati → Modalità di azione: modello flip-flop La proteina trasportatrice, ancorata alla membrana, ha un carattere bistabile, esiste cioè in due stati in cui i siti di legame per la molecola da trasportare sono esposti alternativamente sui due versanti opposti della membrana. Legandosi ad un lato della membrana e liberandosi dall’altro, le sostanze superano la membrana rimanendo all’interno della proteina carrier senza che questa presenti un canale permanente attraverso cui le molecole possano transitare liberamente. La sequenza di eventi che dà luogo al trasporto dal lato extracellulare a quello intracellulare è contrassegnata da un pallino azzurro. A e B indicano i due stati della proteina carrier, AB lo stato intermedio che «occlude» la molecola trasportata nella proteina. Cinetica del trasporto La reazione che descrive il trasporto di un substrato (S) dall’ambiente esterno a quello interno tramite un trasportatore (X) può essere scritta come S+X ↔ SX ↔ SX’ ↔ S+X’ Il passaggio da SX a SX’ corrisponde alla transizione conformazionale (flip-flop) della proteina carrier durante il trasporto della sostanza. Il flusso mediato da trasportatori è espresso da un’equazione simile a quella di Michaelis-Menten per la cinetica enzimatica v=Vmax[S]/(KM+[S]) 𝑽𝒎𝒂𝒙∗[𝑺] 𝟏 𝑲𝒎 𝟏 𝑽= = + 𝑲𝒎+[𝑺] 𝑽 𝑽𝒎𝒂𝒙∗[𝑺] 𝑽𝒎𝒂𝒙 (grafico inverso per linealizzarlo) Vmax è il trasporto massimo e KM (la concentrazione di ligando alla quale la velocità di trasporto è ½ Vmax) è una stima dell’affinità del carrier per il ligando (minore è il valore di KM, più grande è l’affinità). Il doppio plot degli inversi permette di linearizzare l’equazione di Michaelis-Menten in modo da ricavare più facilmente i parametri che descrivono il trasporto. Se il trasporto avviene più lentamente Km è più grande, se avviene più efficientemente Km è più piccolo. Nel trasporto passivo la sostanza ha la stessa affinità per il carrier ai due lati della membrana. Da una parte la sostanza ha concentrazione maggiore quindi si lega più facilmente e passerà dall’altra parte. Nel trasporto attivo la proteina carrier ha affinità diversa per la sostanza ai due lati della membrana. L’affinità deve essere maggiore dove la concentrazione è più bassa (contro gradiente). Diffusione facilitata (passivo) Avviene secondo gradiente di concentrazione, è quindi passiva, e riguarda quelle molecole che da sole non riescono ad attraversare il doppio strato fosfolipidico, necessitano infatti di proteine transmembrana che ne permettono il passaggio → non richiede energia. Le proteine trasportatrici dette permeasi sono proteine integrali di membrana con 12 segmenti transmembranali che sono i siti di legame per le molecole da trasportare. Questa diffusione presenta 3 caratteristiche: Fenomeno della saturazione (quando la concentrazione della sostanza è tale che tutte le proteine trasportatrici sono impegnate nel trasporto) il fenomeno della specificità (capacità che ha la molecola di riconoscere una struttura, è l’affinità sul sito di legame), e il fenomeno della competizione (due sostanze affini possono competere per lo stesso trasportatore). Rappresentazione schematica della glucosio permeasi eritrocitaria (GLUT1). I cerchi rossi indicano i siti ai quali si presume si leghi il D-glucosio Trasporto del glucosio – esempio di diffusione facilitata Il glucosio può seguire la via della diffusione facilitata grazie alle permeasi del glucosio che aumentano la permeabilità del glucosio attraverso la membrana. Esistono diverse isoforme per la stessa permeasi. Per il glucosio esistono: Glut 1 (costitutiva) Km=5 mM Glut 2 (epiteliale) Km=7 Glut 3 (neuronale) Km=1,8 Glut 4 (muscolo, tessuto adiposo) Km=4,6, è insulina dipendente, ovvero il numero di trasportatori sulla membrana dipende dall’insulina Glut 5 intestinale Km=6, serve anche per il trasporto del fruttosio, glucosio e fruttosio competono, ha più affinità per il fruttosio La cinetica enzimatica ci dice che esiste un trasporto massimo (velocità di reazione massima), e che esiste una costante (Michelis Menten) che ci dice l’affinità della proteina trasportatrice al trasportatore. Le diverse isoforme della glucosio permeasi hanno diverse Km, (è la concentrazione di substrato al quale la velocità di trasporto è pari a 1/2 rispetto alla velocità massima, è indice di affinità tra proteina carrier con il trasporto, alta Km significa minor grado di affinità) tra loro, sono adattate alla funzione delle cellule: l’isoforma presente nelle cellule nervose (GLUT3) ha una KM bassa: nell’ambito fisiologico della glicemia il trasporto di glucosio nelle cellule nervose è sempre vicino al massimo, le cellule nervose non sono sensibili alle variazioni della glicemia (è più affine la glut3 perché è semisatura a 1,8millimolare); l’isoforma delle cellule β del pancreas (GLUT2) ha una KM elevata: nell’ambito fisiologico della glicemia il trasporto di glucosio nelle cellule β varia significativamente, le cellule β secernono insulina (ormone ipoglicemizzante) in funzione della concentrazione extracellulare di glucosio. L’insulina promuove l’inserimento della permeasi del glucosio GLUT4 nella membrana delle cellule adipose e del muscolo scheletrico aumentandone la permeabilità allo zucchero. La velocità di trasporto è praticamente saturata nelle cellule neuronali, mentre subisce variazioni significative nelle cellule β. Specificità e competizione nel trasporto del glucosio negli eritrociti Studi fatti su Glut 1, trasporta anche altri zuccheri, ha una Km più alta. La specificità è la capacità che ha la molecola di riconoscere una struttura, è l’affinità sul sito di legame. Esperimento: il mannosio inibisce la penetrazione di glucosio, altri zuccheri (con Km più distanti da quella del glucosio) invece inibiscono poco la penetrazione del glucosio. A sua volta il glucosio inibisce atri zuccheri →inibizione reciproca. Calcolo dell’energia implicata nella diffusione facilitata di glucosio G = RT ln([glucosio]i/[glucosio]e) ΔG, variazione di energia libera R, costante universale dei gas, 8.314 J/mol/K T, temperatura assoluta Con T = 310 K (= 37 °C), [glucosio]i= 0.5 mMe [glucosio]e= 5 mM ΔG = 8.314 x 310 x ln (0.5×10-3/5×10-3) = -5935 J/mol= -5.93 kJ/mol ΔG è negativa e quindi il processo è spontaneo Trasporto attivo primario È un trasporto mediato, le proteine trasportatrici sono enzimi/pompe ATPasiche, ovvero idrolizzano ATP per trasportare i soluti contro gradiente, dalla soluzione meno concentrata alla più concentrata Esempi: Na-KATPasi, presente in quasi tutte le cellule, pompa 3 ioni Na+ fuori dalla cellula contro 2 ioni K+, che sono trasportati dentro la cellula. Ca ATPasi, contribuisce a mantenere bassa la [Ca++]i, pompando lo ione fuori dal citoplasma. H-K ATPasi, interviene nei meccanismi di acidificazione. Il trasporto attivo primario consente alla cellula o agli organelli di mantenere precise concentrazioni interne di ioni specifici, in una situazione di non equilibrio: in questo modo viene bilanciato l’effetto del trasporto passivo, che tende a eguagliare le concentrazioni di soluti. Pompa del calcio Il calcio è uno dei messaggeri più importanti, ha una concentrazione di 10-7M, si può avere un aumento di 100 volte ed è sufficiente una piccola variazione assoluta per avere grandi variazioni relative (10- 7 *100→promuove la contrazione) Modello meccanico del trasporto attivo di uno ione eseguito da una pompa ionica che utilizza l’energia dell’ATP. Il canale di leakage limita il gradiente generato dalla pompa. Il flusso passivo infatti aumenta con l’aumentare del gradiente fino a diventare uguale al flusso attivo; da questo momento il gradiente ionico rimane costante. Struttura pompe ioniche Hanno tutte strutture simili tra loro: 2 macrodomini → 3 domini α (citoplasmatico) + 2 domini β (intramembranario) Domini α A: attivatore, attività fosfatasica N: nucleotidico, avviene il legame con l’ATP, attività chinasica (fosforila un substrato) P: fosforilazione, è presente un AA e un dominio di fosforilazione Domini β T: 6 segmenti transmembranali dove sono presenti siti di legame (verso intra e extra) per gli ioni S: dominio di supporto Pompa sodio potassio (Na/K) 3 Na fuori e 2 K dentro. Risente della temperatura, a 37° la pompa funziona regolarmente, a temperature più basse rallenta o si arresta e non mantiene più lo stato stazionario di questi ioni La pompa esiste in due stati: E1, elevata affinità per il sodio, viene fosforilato in seguito al legame con 3 ioni sodio allo stadio E1-P, la molecola in questo caso passa spontaneamente allo stadio E2-P, questo stato ha una bassa affinità per il sodio che viene rilasciato all’esterno e un elevata affinità per il potassio che si lega alla pompa. Il legame con il potassio induce la defosforilazione della proteina che passa allo stato E2 per poi tornare E1 alla liberazione del potassio. Esperimento ▪ Globuli rossi a 2°, la pompa si arresta ma i flussi passivi no, questi sono influenzati dalla temperatura assoluta (in kelvin) e questo cambiamento è piccolo in kelvin ▪ Il sodio si accumula all’interno e diminuisce il potassio, si altera la composizione delle cellule, non cambiano la soluzione fisiologica, intracellulare=extracellulare ▪ Cambio soluzione extracellulare e metto in soluzione fisiologica dove ho tolto il potassio, la riporto a 37°, misuro la concentrazione, i globuli rossi rimangono in equilibrio (privo di K la pompa non funziona) ▪ Aggiungo potassio all’esterno, ora la pompa funziona →→trasporto accoppiato Il rapporto tra pendenza (velocita) di sodio/potassio è 1,5 cioè 3Na-2K. Essendo un ciclo si può partire da qualsiasi punto, per semplicità si parte dalla configurazione E1. Questa presenta la proteina ha un varco per l’ingresso degli ioni sodio (3) all’interno del dominio T, in cui sono presenti i siti di legame (alta affinità sodio in questo caso). Il sito N, nella configurazione E1, ha un elevata affinità anche per l’ATP, che si lega al sito catalitico sottoforma di Mg-ATP, il magnesio va a schermare le cariche negative del gamma-P e rende possibile il legame tra sito N e P. In questa conformazione viene garantita la fosforilazione del residuo aspartato sul sito P e si ha conseguentemente il passaggio allo stato E1-P. La fosforilazione determina l’occlusione degli ioni sodio all’interno del dominio T (si chiude il varco). L’idrolisi di ATP e la fosforilazione del dominio P hanno effetto sulla posizione reciproca di N, P e T e sulla rotazione di A. Infatti N e P ruotano rispetto a T e determinano la rotazione del dominio A che cambia i rapporti con il dominio P, in pratica si generano tensioni tra A e il dominio T, più precisamente nei segmenti transmembranari M1 M2 e M3, che determinano un ulteriore rotazione di A. L’ADP viene liberata nel mezzo. La rotazione del dominio A, muovendo le tensioni tra M1 M2 e M3, determina un cambiamento dell’affinità dei siti presenti all’interno del dominio T, in pratica l’affinità di T per il sodio diminuisce e aumenta quella per il potassio, viene a formarsi un varco attraverso cui escono gli ioni sodio e entrano gli ioni potassio. Inoltre la rotazione di A fa entrare in contatto la porzione indicata in E1-P come TGE con l’aspartato fosforilato presente nel sito P. Il legame del potassio con T determina un ulteriore rotazione di A, che esercita la sua azione fosfatasica (riduce la forza legame a idrogeno fra magnesio e aspartato) permettendo l’ingresso di una molecola di acqua che determina l’idrolisi del legame del fosfato con l’aspartato. Il processo di rotazione del dominio A è il più lento di tutto il processo di trasporto, infatti è detto rate limiting. A questo punto si ha la transizione da E2-P a E2, il fosfato e il magnesio vengono liberati nel citoplasma, e tale liberazione è associata con il raddrizzamento del sito P (stato E2). Con il passaggio a E2 si chiude il varco per il potassio che rimane nel dominio T. Il dominio A torna alla sua configurazione iniziale e il sito N si allontana dal P per repulsione elettrostatica, si ha così il ripristino dello stato E1. Le caratteristiche del trasporto attivo del Na+: è contro il gradiente elettrochimico, usa come energia quella liberata dall’idrolisi di ATP è sensibile ai veleni metabolici (es dinitrofenolo (DNP), cianuro (CN)) e dipende dall’ATP; è sensibile anche al K+ esterno, se abbiamo K+ esterno vedo un rallentamento dell’attività della pompa (traporto accoppiato) è dipendente anche dalla temperatura (Q10>3 [rapporto tra un parametro fisiologico a una temperatura t e quel parametro alla temperatura t-10°, stabilisce se un processo avviene attivamente se >>1, o passivamente se vicino a 1], se riduco la temperatura della soluzione riduco all’efflusso di Na+ è inibito dalla ouabaina perché compete con i siti di legame con del K+ Le caratteristiche del trasporto attivo dell’Na+ sono state studiate nell’assone di seppia, questo perché è un preparato facilmente reperibile e maneggevole: Esperimento misurare l’uscita di sodio dalla cellula → uso sodio radioattivo L’assone viene posto in una vaschetta arricchita di sodio radioattivo, viene quindi reso tracciabile. Dopo il trattamento l’assone viene messo in una vaschetta che è collegata a due pompe, una che fa entrare acqua di mare e l’altra che la fa uscire, così da mantenere un livello stabile. L’assone viene fatto passare attraverso un tubo capillare, di modo che si possa prelevare da questo, campioni di liquido extracellulare a tempi prefissati, così da poter misurare l’eventuale fuoriuscita di sodio marcato dalla cellula e quindi valutare se esiste o no il trasporto attivo. La quantità di fuoriuscita di ioni sodio è piccola e se venissero dispersi non sarebbe possibile rilevarne la radioattività, ecco la necessità dell’uso di un capillare. Le caratteristiche del trasporto attivo sono state studiate usando manovre diverse per mettere in evidenza la sensibilità della pompa a bloccanti del metabolismo (T, farmaci, conc. extracellulare di potassio). Nel grafico viene evidenziata la natura controgradiente del trasporto di sodio, si vede che quando si misura il flusso del sodio radioattivo dall’assone di seppia, questo ha un valore diverso da zero, quindi si misura un flusso di sodio dalla cellula verso l’esterno. Questo perché il potenziale negativo intracellulare e la bassa concentrazione intracellulare di sodio determina no un’entrata passiva di questo. Poi si vede che bloccando il metabolismo(con DNP o cianuro) della cellula vi è l’arresto della fuoriuscita di sodio dall’assone, per cui il trasporto necessita di energia metabolica. Inoltre, bloccando il metabolismo con cianuro, si dimostra che la fonte di energia è l’ATP, in quetso caso infatti dopo il blocco si va a aggiungere una certa quantità di ATP ad un determinato tempo e si osserva che il trasporto viene ripistinato, ma per un tempo limitato, ovvero fino a che l’ATP iniettata non viene completamente idrolizzata dall’azione della pompa. Esercizio 1. [Na+]i= 10 mM, [Na+]e= 140 mM, il Na+ ha una carica positiva, per cui la ΔG associata con il trasporto del Na+ deve tener conto anche del gradiente elettrico, quindi per Na+ ΔG = RT ln([Na+]e/ [Na+]i) + zF(Ee-Ei) Dove z è la carica dello ione, F è la costante di Faraday = 96500 coulombs/mol, Ee è il potenziale esterno, posto =0 V, Ei è il potenziale interno = -0.07 V quindi ΔGNa= 8.314 ×310 ×ln(140×10-3/10×10-3) + 1 x 96500 x (0.07) = 13.5 kJ/mol 2. [K+]i= 140 mM, [K+]e= 2.5 mM, anche per K+ la ΔG associata con il trasporto deve tener conto del gradiente elettrico, ma K+ si muove in senso opposto a Na+ quindi per K+ ΔG = RT ln([K+]i/ [K+]e) + zF(Ei-Ee) quindi: ΔGK= 8.314 ×310 ×ln(140×10-3/2.5×10-3) + 1 x 96500 ×(-0.07) = 3.6 kJ/mol Poiché vengono trasportati 3 ioni Na+ e 2 ioni K+ l’energia totale in gioco è (3×13.5+2×3.6)=47.7 kJ Questo valore è compatibile con l’energia liberata dall’idrolisi di una molecola di ATP, circa 60 kJ/mol a 37°C Trasporto attivo secondario - È un trasporto mediato che avviene contro gradiente di concentrazione, l’energia non deriva direttamente dall’ATP, ma dal contemporaneo trasporto con un'altra sostanza. - Trasporto accoppiato (cotrasporto): il gradiente di un soluto permette il trasporto contro gradiente del soluto accoppiato. Rende perciò possibile l’assorbimento di sostanze nutritive (es. aminoacidi, glucosio) dall’ambiente anche quando le loro concentrazioni sono basse rispetto a quelle dentro le cellule e permette la rimozione di sostanze metaboliche di rifiuto quando la loro concentrazione all’esterno è più alta che nella cellula. Il flusso secondo gradiente di un soluto (sferette rosse) determina il flusso contro gradiente di un soluto accoppiato (sferette blu). Il modello meccanico (figure A e D) ha solo funzione didattica, non esiste nella realtà, mentre i modelli flip-flop rappresentano le due modalità (simultanea o consecutiva) con cui il trasporto può essere effettuato. Si distinguono due tipi di soluto: Soluto motore → stessa affinità ai due lati della membrana. Soluto da trasportare → affinità bassa dove la concentrazione è elevata, affinità alta dove la concentrazione è bassa, così è più facile che si stacchi dove la concentrazione è alta. Trasporto simultaneo → la molecola carrier, quando è in posizione flip, presenta due siti di legame, quello per il soluto motore (stessa affinità nelle due configurazioni flip-flop) e per il soluto da trasportare (affinità elevata stato flip e bassa in flop). L’affinità per il soluto da trasportare cambia in base al legame del soluto motore al carrier. L’elevata affinità del carrier per il soluto da trasportare in presenza di soluto motore determina il legame con l’altro soluto anche se la concertazione del soluto da trasportare è bassa. I due soluti vengono chiusi nella proteina carrier che passa in conformazione flop, il soluto motore si libera (concentrazione intracellulare bassa) e il soluto trasportato si libera perché l’affinità diminuisce, nonostante la concentrazione intracellulare è elevata. Il soluto viene quindi trasportato controgradiente. Trasporto consecutivo → Prima avviene il movimento secondo gradiente del soluto trasportato passivamente, e questo determina la modifica strutturale necessaria per il cambiamento di affinità per il soluto trasportato attivamente, che quindi potrà legarsi alla proteina carrier e attraversare la membrana controgradiente. Esempio di trasporto attivo secondario → trasporto di AA, trasporto alanina all’interno della cellula Qui è mostrata la relazione della concentrazione intracellulare di alanina in funzione del tempo. La concentrazione extracellulare di alanina è rappresentata dalla linea tratteggiata. Quando la concentrazione extracellulare di sodio è zero, la concentrazione di alanina può diventare al massimo uguale a quella esterna (diffusione facilitata, trasporto passivo), funziona come una permeasi. Se invece la concentrazione di sodio è quella fisiologica, la concentrazione all’interno della cellula può diventare molte volte più grande rispetto a quella esterna. L’alanina viene accumulata nella cellula, quindi viene trasportata controgradinte, e il trasporto è accoppiato al trasporto del sodio secondo gradiente. Facendo il doppio plot degli inversi, si vede che la velocità massima del trasporto è la stessa sia in presenza che in assenza di sodio, quindi per concentrazioni extracellulare infinite di alanina, si raggiunge sempre lo stesso trasporto massimo (blu), però per concentrazioni non infinite di alanina, tutte le volte che il sodio è presente in ambiente extracellulare la velocità di trasporto è più elevata (arancione). La traccia arancione è più bassa della blu perché sulle ordinate è riportato il reciproco della velocità di ingresso. Calcolo dell’energia implicata nel trasporto attivo secondario Occorre considerare il valore delle variazioni di energia libera associate con il trasporto del soluto motore e le variazioni dell’energia libera del soluto motore. Si somma poi il tutto, e valutare se il deltaG globale è negativo (trasporto può avvenire) o positivo (trasporto non può avvenire, devono essere necessari il trasporto di un numero più elevato di ioni perché il trasporto avvenga). Calcolo dell’energia implicata nel trasporto attivo di glucosio: Il carrier è una proteina che accoppia il trasporto secondo gradiente di Na+ a quello contro gradiente di glucosio. Il gradiente di Na+ è generato e mantenuto dalla Na-KATPasi. Assunzioni [glucosio]i= 0.5 mM, [glucosio]e= 0.005 mM, T = 310 K ΔGglucosio= 8.314 x 310 x ln(0.5×10-3/0.005×10-3) = +11.8 kJ/mol [Na+]i= 10 mM, [Na+]e= 140 mM, il Na+ ha una carica positiva, per cui la ΔG associata con il trasporto del Na+deve tener conto anche del gradiente elettrico, quindi per Na+ ΔG = RT ln([Na+]i/ [Na+]e) + zF(Ei-Ee) Dove z è la carica dello ione, F è la costante di Faraday = 96500 coulombs/mol, (Ei-Ee) è la differenza di potenziale (-0.07 V) ai lati della membrana, quindi ΔGNa= 8.314 x 310 x ln(10×10-3/140×10-3) + 1 x 96500 x (-0.07) = -13.5 kJ/mol Quindi l’energia libera fornita dal trasporto secondo gradiente del sodio è sufficiente per il trasporto contro gradiente del glucosio. Trasporto attivo secondario di Ca2+ Antiporto Na+/Ca2+ (NCX) Come abbiamo già visto, nel citosol, la concentrazione di calcio deve essere mantenuta bassa (