Enzimler - Medical Biochemistry - PDF

T.C. HALİÇ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI DR. ÖĞR. ÜYESİ HÜLYA IRMAK AKSAN Enzim nedir? Enzimler, metabolizma reaksiyonlarını hızlandıran, biyolojik katalizörlerdir. ▪Protein yapısında maddelerdir ( Ribozimler hariç). ▪Hücrenin gereksinimine uygun kataliz yaparlar. ▪Hücr...

T.C. HALİÇ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI DR. ÖĞR. ÜYESİ HÜLYA IRMAK AKSAN Enzim nedir? Enzimler, metabolizma reaksiyonlarını hızlandıran, biyolojik katalizörlerdir. ▪Protein yapısında maddelerdir ( Ribozimler hariç). ▪Hücrenin gereksinimine uygun kataliz yaparlar. ▪Hücre içindeki yerleşimleri metabolik olayların özelliğine göre düzenlenmiştir. 2 Enzimler, organizmada kimyasal reaksiyonlarda, • • • • • • Dengenin yönünü değiştirmezler. Dengeye ulaşılacak süreyi kısaltırlar. Tepkimeden değişmeden çıkarlar. Aktivasyon enerjisini düşürürler. Denge sabitini değiştirmezler. Farklı enerjilerin birbirine dönüşünü sağlarlar. 3 Substrat nedir? • Enzimlerle katalizlenen tepkimeye giren maddeye substrat (reaktan) denir. • Her enzimin belli bir substratı vardır ve bunlardan belirli bir ürün veya ürünler oluşur. • Enzim-substrat ilişkisi oldukça seçici ve karakteristiktir. 4 5 ENZİMLERİN İSİMLENDİRİLMESİ Etkiledikleri maddelerin (substratlarının) sonuna -az- takısı eklenerek isimlendirilir. Madde Hidroliz Enzimi Nişasta(Amilon) Amilaz Yağ (Lipos) Lipaz Protein Proteaz Üre Üreaz Bu kurala uymayanlar: Pepsin, tripsin, pityalin Katalizledikleri reaksiyon tipine göre: oksidaz, dekarboksilaz, transaminaz 6 ENZİMLERİN İSİMLENDİRİLMESİ Günümüzde bu tür karışıklıkları önlemek amacıyla Uluslararası Biyokimya Birliğinin (IUB) Enzim Komisyonu tarafından Sistematik isimlendirme önerilmiştir. Bu sistemde her enzim, katalizlediği reaksiyon tipine ve mekanizmasına göre isimlendirilmektedir. Günlük kullanımda önerilen kısa isme ilaveten daha detaylı sistematik ismin kullanılması öngörülmüştür. 7 SİSTEMATİK İSİMLENDİRMENİN TEMEL ÖZELLİKLERİ 1. Reaksiyonlar ve bu reaksiyonları katalizleyen enzimler, reaksiyon mekanizmalarına göre 6 sınıfa bölünürler. Bu sınıflarında alt sınıfları vardır. 2. Her enzimin bir kod numarası vardır (EC). Bu kod, dörtlü sayı grubu ile gösterilir. Tepkimenin tipini birinci sayı, vericinin etkilediği grubu ikinci sayı, alıcı olarak yararlanılan grubu üçüncü sayı ve adlandırılan enzimi dördüncü sayı belirlemektedir. Örnek verecek olursak; • 1.1.1.1 abcd • a: Ana sınıf • b: Subklas • c: Subsubklas • d: Subsubklas seri no 8 9 ULUSLARARASI ENZİM SINIFLAMASININ ALTI ANA SINIFI 1.OKSİDOREDÜKTAZLAR • Oksidasyon (yükseltgenme) ve redüksiyon (indirgenme) reaksiyonlarını katalizleyen enzimlerdir. • Dehidrogenaz ve oksidazlar, substrat olarak, hidrojen ve elektron vericileri kullanırlar. AYÜK + BİND AİND + BYÜK oksido-redüksiyon 10 1.OKSİDOREDÜKTAZLAR Bir molekülden H+kopararak, o molekülün yükseltgenmesini; bir başka moleküle H+’i aktararak o molekülün indirgenmesini katalizlerler. Örnek: CH3 LDH (Laktat Dehidrogenaz) CH COO‫ ־‬+ NAD+ CH3 C OH O Laktat Piruvat COO‫ ־‬+ NADH +H+ 11 2.TRANSFERAZLAR • Molekülden H+ dışında, başka grupları (C, N ve fosfor taşıyan gruplar) aktaran enzimlerdir. AB + C A + BC Örnek: CH2 CH OH COO‫ ־‬+ THF NH3 Serin Serin hidroksimetil transferaz CH2 COO‫ ־‬+ THF CH2 NH3 Glisin 12 3.HİDROLAZLAR • Değişik bağların hidrolizini sağlayan enzimlerdir. • Bağlara su ekleyerek koparılmalarını katalizlerler. 13 4.LİYAZLAR • C-C, C-O, C-N ve C-S bağlarını yükseltgeme ve hidroliz dışında bir mekanizma ile kıran enzimlerdir. AB A + B 5.İZOMERAZLAR Optik ve geometrik izomerlerin rasemizasyonunu katalizleyen enzimlerdir. ABC ACB Molekül-içi düzenleme yaparlar. 6.LİGAZLAR Yüksek enerjili fosfatların enerjisini kullanarak, karbon ile C,O,S,N arasında bağ oluşumunu katalizleyen enzimlerdir. A + B + ATP AB + ADP + Pİ • ATP ve benzeri trifosfatları kullanarak iki molekülü birleştirirler. 16 Uluslararası EC sınıflandırmasına göre bilinen tüm enzimlerin dağılımı ve reaksiyon özellikleri 17 Sentaz ve sentetaz arasındaki fark Sentetazlar ATP bağımlı enzimlerdir, Sentaz doğrudan ATP‛ye gerek duymaz. 18 Sistematik İsimlendirme: Örn: HK ATP + D-Glukoz ADP + D-Glukoz-6-Fosfat Önerilen kısa isim: Hekzokinaz Enzim kodu: EC (2.7.1.1) Sistematik isim: ATP: glukoz fosfotransferaz EC (2.7.1.1): İlk sayı: Reaksiyon tipini açıklar (Major sınıf) Transferaz sınıfı İkinci sayı: Alt sınıf Fosfotransferaz Üçüncü sayı:Alt alt sınıf Hidroksil grubunun alıcı olduğu fosfotransferaz Dördüncü sayı: Enzim için spesifiktir. Fosfat grubunun D-glukoza aktarıldığını açıklar. Enzimin listeye girdiği seri numarasıdır. 19 ENZİMLERİN ÖZELLİKLERİ 1.Enzimler protein yapısında maddelerdir: •Protein yapısına istisna olarak bazı RNA tipleri gösterilebilir. •Bunlar, fosfodiester bağlarının yıkımı ve sentezi esnasında enzim gibi davranabilirler. Katalitik etkiye sahip RNA’ya Ribozim denir. Primer transkriptinden matür mRNA sentezini sağlarlar. ➢Enzimler kolaylıkla denatürasyona uğrarlar: Denatürasyon, proteinlerin doğal yapılarının bozulması sonucunda aktivitelerinin kaybolmasıdır. Enzim denatüre olduğunda aktif bölgesi de denatürasyona uğrayarak substratını bağlayamaz, bundan dolayı da etkili olamaz. 20 Başlıca denatürasyona yol açan faktörler: ▪ Isı ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Işınlar (X ışınları, UV ışınları, vs) Çalkalama Dondurup eritme Derişik asit ve baz Alkol, eter, benzen, vs gibi organik çözücüler Üre, guanidin çözeltileri 21 2.Enzimler özgül moleküllerdir. Enzimler yalnız belirli reaksiyonları katalizledikleri ve sadece substratları ile etkileştiklerinden dolayı spesifik (özgül) maddelerdir. 3.Enzimler katalitik etkinliğe sahiptir. ▪ Enzimle katalizlenen reaksiyonların çoğu katalizlenmeyen reaksiyonlara göre 103 –108 kere daha hızlı olarak gerçekleşmektedir. ▪ Bir enzim molekülü saniyede ortalama 100-1000 substrat molekülünün ürüne dönüşümünü sağlamaktadır. 22 Enzimin dönüşüm sayısı (Turnover sayısı): Enzim molekülü tarafından bir saniyede ürüne çevrilen substrat molekülü sayısıdır. Karbonik anhidraz CO2 + H2O H2CO3 Karbonik anhidraz, 1 saniyede 105 molekül CO2’e, H2O’yu bağlayarak karbonik asid oluşturur. 23 • Enzim aktiviteleri, enzim ünitesi cinsinden verilir. • 1 enzim ünitesi, optimal şartlarda (optimal ısı ve optimal pH) 1 mikromol substratı 1 dakikada ürüne dönüştüren enzim aktivitesidir; buna internasyonal ünite (IU) adı verilir. • Günümüzde enzim ölçüm birimi olarak genelde bu ünite kullanılır; IU veya kısaca U şeklinde kısaltılır. • 1 saniyede 1 mol substratı ürüne dönüştüren enzim aktivitesine 1 katal veya 1 SI ünitesi denir. • Çeşitli enzimler için özel aktivite birimleri de tanımlanmıştır: Bodansky ünitesi, 37oC’de pH=8,6 ortamında 100 mL serumda sodyum gliserofosfattan 1 saatte 1 mg fosfor oluşumunu katalize eden fosfataz enzimi aktivitesidir. • King-Armstrong ünitesi, 37oC’de, 100 mL serumda fenilfosfat’tan 15 dakikada 1 mg fenol oluşumunu katalize eden fosfataz enzimi aktivitesidir. 24 4. Substrat-ürün dönüşümleri çift yönlü olabilmektedir. Dihidroksi aseton fosfat (DHAP) Gliseraldehid-3-fosfat (G3P) Bu iki madde arasındaki izomerizasyon glikoliz yolunda rastlanır. Enzim iki yöne doğru reaksiyon hızını arttırmaktadır. 25 5.Enzim moleküllerinde aktif bölge ismi verilen özel bir boşluk ya da cep kısmı bulunur. ▪ Aktif bölgedeki aminoasidlerin yan zincirleri, substratın yapısına uyumlu, üç boyutlu bir yapı oluşturmaktadır. Enzim Substrat Enzim-Substrat kompleksi Aktif bölge 26 ▪ Aktif bölgenin substratı bağlamasıyla oluşan enzim-substrat kompleksi (ES), önce enzim-ürün kompleksine, daha sonra ise serbest enzim ve ürüne dönüşmektedir. E+S ES EÜ E+Ü ▪ Enzim ile substrat biribirlerine hidrojen, elektrostatik ve Van der Waals bağları gibi non kovalent (zayıf) bağlarla bağlanır. ▪ Zayıf bağlar ve bazı kuvvetli bağlar, aktif bölgelerin aminoasidlerini biribirlerine yanaştırmada önemli rol oynarlar. 27 28 • Genellikle Bir Nükleofil Olarak Hareket Eden Amino Asit R-Grupları. Bir nükleofil görevi görebilen reaktif amino asitler, genellikle enzimlerin aktif bölgesinde bulunur ve reaksiyon mekanizmasına katılır. 29 ▪ Enzimlerin substrat bağlama yeri olan aktif bölgedeki aminoasidler, substratın ürüne dönüşmesini sağlayan pek çok kimyasal mekanizmayı kullanır. ▪ Bu aminoasidlerden bazıları substratın aktif merkeze bağlanmasını, bazıları ise kataliz olayını sağlamaktadır. Aktif merkezde yer alan iki bölgeden birincisi bağlanma bölgesi, diğeri ise katalitik bölgeyi oluşturur. 30 Enzim ile substrat bağlanmasında iki model ileri sürülmektedir. 1.Model: Anahtar-kilit modeli (Fischer modeli) 2.Model: Katalitik bölgenin “uyum oluşturma modeli” (Koschland modeli) 31 1.MODEL: ▪ Kilit anahtara olan benzerliğe dayanılmıştır. ▪ Bu modelde enzimin aktif merkezindeki bir bölge ile substrat yapılarının biribirini tamamlayıcı olmaları gerekmektedir. a b Substrat c + a b Enzim a b c c ES kompleksi Kilit-anahtar modeli 32 2. MODEL: ▪ Katalitik bölgenin “Uyum-oluşturma” modelidir. ▪ Başlangıçta enzim ve substrat biribirlerine uygun değildirler. ▪ Ancak substrat enzimin aktif bölgesine yaklaştıkça, enzim buna uymaktadır. ▪ Substrat, enzimde biçimsel değişiklik meydana getirir. Substrat a b c a + a b c c b ES kompleksi Enzim 33 Enzimlerin hücresel lokalizasyonu Sitozol: Glikoliz, pentoz fosfat yolu, glikojen metabolizması, üronik asit yolu, yağ asidi sentez enzimleri gibi Mitokondri: TCA siklusu, yağ asidi oksidasyonu, piruvat dekarboksilasyon, yağ asidi sentezi zincir uzatma, amino asit oksidasyonu Lizozom: Proteaz, glukozidaz, asit maltaz Nukleus: DNA ve RNA sentezi enzimleri Golgi: Glikozilasyon ve sülfatasyon reaksiyonları enzimleri 34 35 6. Bazı enzimler, enzimatik reaksiyon için gerekli olan bir non-protein kofaktör ile birleşirler. ▪ Sıklıkla karşılaşılan kofaktörler arasında metal iyonları (Zn2+,Fe2+,Cu2+, Mn+2… vs) ve koenzim olarak adlandırılan bir organik molekül, genellikle vitamin türevleri (NAD+, FAD, CoA..gibi) yer alır. ▪ Koenzimlerin pek çoğu genellikle B grubu vitaminlerden türevlenmektedir. ▪ Kofaktörle birleşik durumda olan ve katalitik aktivite gösteren enzim holoenzim olarak bilinmektedir. ▪ Holoenzimin protein kısmına apoenzim adı verilir. ▪ Apoenzim kofaktörün yokluğunda biyolojik aktivite gösteremez. ▪ Protein kısmına sıkıca bağlı olan koenzime prostetik grup denir. 36 37 Kofaktör olarak metal iyonu kullanan enzimlere metalloenzim denir. Kofaktörü metal iyonu olan bazı metalloenzimler: Kofaktör Enzim Fe2+ Sitokrom oksidaz Fe+3 Peroksidaz, Katalaz, Triptofan pirolaz, miyeloperoksidaz, homogentisik asit oksidaz, p-hidroksifenilpiruvat hidroksilaz Cu2+ Sitokrom oksidaz, tirozinaz, seruloplazmin, dopamin βhidroksilaz, super oksit dismutaz (SOD), lizil oksidaz, tirozinaz, ürat oksidaz, monoamin oksidaz (MAO). Mg2+ Fosfohidrolaz, fosfotransferaz, heksokinaz, glukoz 6fosfataz, piruvat kinaz 38 Kofaktör Enzim Mn2+ Arginaz, piruvat karboksilaz, mitokondiyal SOD Zn2+ Alkol dehidrogenaz, karbonik anhidraz, DNA polimeraz, karboksipeptidaz A ve B. Mo2+ Aldehit oksidaz, ksantin oksidaz, sulfit oksidaz Ni+2 Üreaz K+ Piruvat kinaz Se Glutatyon peroksidaz (GPx), 5'-deiyodinaz, tiyoredoksin redüktaz 39 ▪ Metal iyonları substrat bağlanmasını ve katalizi kolaylaştırır. ▪ Aşağıdaki 4 form da, metal iyonları ile katalizlenen enzimatik reaksiyonlar için geçerlidir. Enz S M Substrat-köprü kompleksi Enz M Metal-köprü kompleksi S M Enz S Enzim-köprü kompleksi Enz M S Siklik metal-köprü kompleksi 40 Koenzimler; • NAD+, NADP+, FMN, FAD, Lipoik Asit, Koenzim Q, Tiyamin, Koenzim A, Folik asit, B12 koenzimleri, Biyotin, B6 gibi suda erir vitaminler koenzimleridir. 41 KOENZİMİ VİTAMİN OLAN BAZI ENZİMLER: Enzim Vitamin Koenzim Katalizlenen reaksiyon Dekarboksilaz B1 vitamini TPP (Tiamin pirofosfat) ………………...R-CO-COOH (Tiamin) RCHO + CO2 (Dekarboksilasyon) Dehidrogenaz B2 vitamini FMN (Flavin mononukleotid ve…………..Hidrojen (Riboflavin) FAD Flavin adenin dinükleotid) transferi Transaminaz B6 vitamini (Pridoksal) Pridoksal fosfat ……………….Amino asidlerden aldığı -NH2 grubunu α-keto asidlere transfer eder. Karboksilaz Biotin Biotin Transformilaz Folik asid THF…………………………… -CHO, -CH2 OH, -CH3 (Tetrahidrofolat) gruplarının transferi Transmetilaz İzomeraz B12 vitamini Kobamid…………………………-CH3 grubu transferi koenzim Transasetilaz B5 Pantotenik asit …………………………α-keto asidlere CO2 ‘i bağlar (Karboksilasyon) Yapısında açil gruplarının taşınmasını sağlayan KoA’yı bulundurur. 42 Spesifik atomlar veya fonksiyonel grupların geçici taşıyıcıları olarak görev yapan bazı koenzimler 43 Laboratuvarda enzimlerin kullanımı • Enzimlerden klinik analizlerde reaktif olarak yararlanır. • Enzimlerin aktivitelerinin ölçümünde kullanılır • Enzim kullanılan analizler hızlı, spesifik, güvenilir ve kısa sürede sonuç verir. • Daha az serum/plazma gibi örnek kullanımına yol açar. • Renk reaksiyonları oluşturabilirler. • Bunun için ortama indikatör denilen bileşikler konulur. • Koenzim olarak FAD, NAD+ ve NADP+ kullanan enzimlerin ölçülmesinde FADH, NADH ve NADPH'ın optik özelliklerinden yararlanılır. • Okside FAD 450 nm'de ışığı absorbe ederken, NADH'ın absorbsiyonu 340 nm'de gerçekleşir. 44 45 7. Enzimler hücrenin metabolik gereksinimlerine uygun şekilde aktive veya inhibe edilerek ürün oluşum hızı kontrol edilebilir. Bu olaya enzim aktivitesinin düzenlenmesi denir. 8. Enzimler enerji türlerini birbirine dönüştürürler. ▪ Mitokondrideki küçük moleküller içinde bulunan serbest enerji, ATP enerjisi şekline dönüşür. ▪ Kasta ise ATP enerjisi, kasılma esnasında mekanik enerjiye dönüşür. 9. Enzimler tranzisyon (geçiş) durumunu stabilize ederek reaksiyonları hızlandırırlar. ▪ Moleküllerin reaksiyona girebilmeleri için enerji tüketilmektedir. ▪ Substrat ürüne dönüşürken tranzisyon (geçiş) durumundan geçer. S T* Ü 46 ▪ Tranzisyon durumu, S ve Ü’nün serbest enerjisinden çok daha yüksek enerjiye sahiptir. ▪ Reaksiyon tranzisyon durumundan itibaren başlar. ▪ Enerji düzeyinin tepe noktasında bulunan yüksek enerjili geçiş ürünleri daha sonra son ürüne dönüşmektedir. ▪ Enzimlerin yokluğunda, tranzisyon durumuna ulaşabilen çok az sayıda molekül, ürüne dönüşebilmektedir. ▪ Reaksiyon hızı ise, bu yüksek enerjiye sahip moleküllerin sayısı tarafından belirlenmektedir. 47 Ea = Aktivasyon enerjisi Ea1 = Enzimle katalizlenmemiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi T * enerjisi Ea2 = Enzimle katalizlenmiş reaksiyonun aktivasyon Serbest enerji Ea1 S Başlangı ç durumu E a Ea2 ∆G Ü Bitiş durumu (ürünler) Reaksiyon akış yönü Ortama salınan serbest enerji 48 ▪ Bir kimyasal reaksiyon ortama enerji salıyor ise, tranzisyon durumuna geçebilmesi için, önce aktivasyon enerjisinden enerji borç alır, sonra bu enerjiyi sarfeder. ▪ Sarfedilen enerjiden geri kalanı ise ortama serbest enerji şeklinde salınır. Ea= Tranzisyon durumu serbest enerjisi – substrat serbest enerjisi ▪ Aktivasyon enerjisi düşük olan reaksiyonların hızı yüksek olmaktadır. 49 “ Enzimle katalizlenen reaksiyonlarda, enzimler aktivasyon enerjisini azaltarak reaksiyonları hızlandırırlar. Böylece enzim ve substratı, tranzisyon enerjisi daha düşük olan yeni bir reaksiyon yolu oluşturur.” ∆G kalori Ea Tranzisyon durumu Başlangıç durumu Bitiş durumu ❑ Spontan reaksiyon ❑ Spesifik enzim ❑ Kimyasal katalizör varlığındaki reaksiyon 50 ENZİMLERİN KATALİZ HIZINA ETKİ EDEN FAKTÖRLER Kataliz Hızı, birim zamanda oluşan ürün ya da kaybolan substrat miktarıdır. Enzimle katalizlenen reaksiyonların hızını etkileyen faktörler: 1.Enzim Konsantrasyonu 2.Substrat Konsantrasyonu 3.Sıcaklık 4.pH 51 1. ENZİM KONSANTRASYONU Reaksiyon hızı ▪ Enzimle katalizlenen reaksiyonlarda substrat konsantrasyonu yüksek miktarlarda ise, reaksiyonun başlangıç hızı (Vİ),enzimin konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak artmaktadır. Vİ Enzim konsantrasyonu 52 2. SUBSTRAT KONSANTRASYONU ▪ Enzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızı (V), ortamda enzim konsantrasyonunun sabit olması koşuluyla, substrat konsantrasyonu ile [S] birlikte hızla artar ve maksimal hız (Vmax) değerine varıncaya kadar artış devam eder. ▪ Ancak Vmax’ta substrat konsantrasyonu ne kadar artarsa artsın, kataliz hızı artmaz. VMAX V VO [S] ▪ Yüksek substrat konsantrasyonlarında reaksiyon hızının yavaşlaması, enzim üzerindeki substrat bağlama bölgelerinin doygunluğa ulaşmasını göstermektedir. 53 ▪ Enzimlerin çoğu Michaelis-Menten Kinetiği gösterirler. ▪ Belli sıcaklıkta ve sabit enzim konsantrasyonunda, bu kinetiğe uyan enzimler, değişen substrat konsantrasyonu ile başlangıç hızı (VO) arasında hiperbolik bir eğri çizerler (A). ▪ Buna karşılık allosterik enzimlerde, bu eğri sigmoidal özellik taşımaktadır (B). VMA X A B VO [S] 54 3.SICAKLIK ▪ Kimyasal reaksiyonlarda ısının artması moleküllerin hareketini arttırarak reaksiyon hızının da artmasına yol açar. ▪ Reaksiyon hızının sıcaklık ile artışı, belli bir enerji düzeyini aşabilecek molekül sayısı ile ilgilidir. ▪ Bu durum, enzimlerle katalizlenen reaksiyonlar için de geçerlidir. “Enzimle katalizlenen bir reaksiyonda sıcaklığın yükselmesi reaksiyon hızını arttırmaktadır.” Ancak enzimler protein yapısında maddeler olduklarından, belirli bir ısı derecesinden itibaren (genelde 45ºC) enzimin denatürasyonu söz konusu olacağından, reaksiyon hızında da bir azalma meydana gelecektir. 55 Optimum Temperatür: ▪ Enzimin en iyi etkilediği ısı derecesidir. ▪ Bu ısı derecesi, reaksiyon hızını maksimal arttırırken, daha ilerisinde enzimin denatürasyonuna yol açar. “Enzim etkinliği düşük ısıda az, tepe noktasında en fazla, sıcaklık arttığında ise hızla düşer.” Genellikle, başlangıçta sıcaklığın her 10 ºC artışı, reaksiyon hızının iki katına çıkmasını sağlamaktadır. 56 • Enzim aktivitesinde, optimum temperatür 2 faktörle belirlenmektedir (Kırmızı eğri). • Reaksiyon hızı, gerek spontan gerekse katalizör varlığında, sürekli olarak artar (mavi eğri). • Belirli bir ısı derecesinden sonra, enzim proteini denatüre olur (siyah eğri). 50 O 20 30 40 50 60 O denatüre olmamış protein yüzdesi reaksiyon hızı (v) 100 sıcaklık (ºC) 57 Termik İnaktivasyon: Enzim çözeltisi hazırlandıktan sonra enzim aktivitesi ölçülür (Eo). Daha sonra çözelti termostata konarak her 2-3 dakikada bir ısı derecesi arttırılır ve çözeltiden bir kısım alınarak aktivite ölçülür (E). Isıtma süresi arttıkça aktivitede giderek azalma gözlenir. İnaktivasyon, zamanın logaritmik fonksiyonudur. Log E Eo 30ºC 45ºC 55ºC 60ºC zaman(dak) 58 4. pH Enzimatik reaksiyonlar ortamın H+ iyonu konsantrasyonundan kolaylıkla etkilenirler. ▪ Enzim etkinliğinin en yüksek olduğu pH , optimum pH’dır. ▪ Her enzimin etki ettiği pH farklıdır. Enzimler pH değişikliklerine bağlı olarak başlıca 2 tip aktivite eğrisi gösterirler: a) Dar sınırlar içinde etkiyi gösteren çan eğri b) Geniş sınırlar içinde etkiyi gösteren plato eğri enzimatik aktivite b a pH 4 5 6 7 8 9 10 59 Çoğunlukla enzimlerin optimum pH’ı 5-8 arasında değişmektedir. Nötral pH’da çalışan enzimler asidik ortamda denatüre olurlar. Optimum etki Enzimatik aktivite Optimum etki TRİPSİN 4 6 8 1012 pH Alkali ortamda en iyi etkiyi gösterir. Maksimum aktiviteyi pH= 2’de gösterir. PEPSİN 2 3 456 7 pH 60 pH değişikliklerinin enzimatik aktivite üzerindeki etkileri aşağıdaki faktörler tarafından belirlenmektedir. 1. Ortamın çok yüksek ve çok düşük pH düzeyleri, enzimin denatürasyonuna yol açarak, yapısında geri dönüşümsüz değişiklikler yapar. 2. Apoenzim ile koenzim arasındaki bağlar etkilenir. 3. Bir protein olan enzimin yapısındaki amino ve karboksil gruplarının iyonizasyon durumu, ortamın pH değerine bağlı olarak değişir. Aktif bölgedeki iyonizasyon değişikleri, enzim-substrat reaksiyonunu ve buna bağlı olarak katalizi bozar. 61 Örnek: Katalitik aktivite için ortamdan H+ iyonu kazanılması gerekiyor ise, moleküldeki amino gruplarının protonlaşması gibi: - NH2 H+ -NH3+ Alkali pH ‘da proton kaybı olacağından, verilen örnekte enzimatik aktivite hızı düşer. 4. Büyük çoğunlukla pH değişikliklerinden substratın da iyonizasyon durumu etkilenir. 62 ENZİM KİNETİĞİ Reaksiyon Hızı (v): Enzim etkisiyle birim zamanda kaybolan substrat miktarı veya oluşan ürün miktarı ile ölçülür. Enzim Moleküler Aktivitesi: Optimum reaksiyon şartlarında, 1 molekül enzim tarafından 1 dakikada ürüne dönüşen substrat miktarıdır. Spesifik Enzim Aktivitesi: mg protein başına düşen enzim ünite sayısıdır. Enzim Ünitesi: Optimal şartlarda, 1 dakikada 1 mikromol (µmol) substratı ürüne dönüştüren enzim miktarıdır. 63 Enzimlerin katalizledikleri reaksiyonlarda genel kimyasal reaksiyon kinetikleri geçerlidir. Michaelis ve Menten isimli araştırmacılar, enzimlerle gerçekleşen reaksiyonlar için basit bir tanımlama yapmışlardır. Enzim kinetiklerinin kantitatif analizleri için geliştirilen bu model, tek substratlı reaksiyonlar için geçerlidir. E +S k1 ES k3 E +Ü k2 k1, k2 ve k3 : reaksiyonların hız sabitleri 64 ▪ Tersinir olarak sabit bir hızla (k1) substratla [S] birleşen enzim [E], önce enzim-substrat [ES] kompleksini oluşturur. [ES] kompleksi daha sonra başlıca 2 akıbete uğrayabilir: 1. Sabit bir hızla (k2) yeniden E ve S’a dönüşür. 2. Yahut k3 sabit hızıyla ürün [Ü] oluşurken enzim de serbestleşerek ilk yapısını kazanır. ES oluşum hızı = k1[E] [S] ES yıkılım hızı = (k2 +k3) [ES] 65 Reaksiyon hızı ile substrat konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi tanımlayan Michaelis-Menten denklemi kurulurken aşağıdaki varsayımlar gözönüne alınmıştır: 1. Substrat konsantrasyonu [S], enzim konsantrasyonun [E]’dan çok daha fazladır. Böylece belirli bir zamanda enzime bağlı olan substrat miktarı ihmal edilebilir. 2. Reaksiyonun denge durumunda ES kompleksinin oluşum ve yıkılım hızları birbirine eşittir. 66 Reaksiyonun denge durumunda : k1 [E] [S] = [k2 + k3] [ES] [ES] Km [E] [S] =k2 + k3 k1 (1) (2) k2 + k3 k1 67 Michaelis-Menten denklemi hiperbolik bir eğrinin denklemidir. Reaksiyon hızı V VMAX VMAX 2 0 [S] (mol/L) Km 68 VMAX : • Katalizin ulaşabileceği en yüksek hız değeridir. • Enzim bölgeleri substrat ile tam doygunluğa geçince VMAX’a ulaşılır. 69 Km : (Michaelis-Menten Sabiti) • En yüksek hız (VMAX) değerinin yarısına ulaşmak için gerekli substrat miktarıdır. • Ortamda bulunan tüm enzim moleküllerinin aktif bölgelerinin yarısını dolduran substrat miktarıdır. • Km değerini tam olarak bulabilmek için farklı konsantrasyonlarda substrat kullanılmalıdır. 70 • Enzim konsantrasyonu Km değerini etkilemez. • Substrat konsantrasyonu, pH, temparatür ve iyonik güce bağlıdır. • Km değeri enzimin substratına karşı gösterdiği afiniteyi ifade eder; • Km küçük ise enzimin substratına karşı ilgisi yüksek. • Km büyük ise enzimin substratına karşı ilgisi düşüktür. • [S]< Km ise: Tepkime hızı [S]'nin artırılması ile doğru orantılı olarak artar. "1. derece kinetik" olarak ifade edilir. • [S]> Km ise: Tepkime hızı V max'a eşittir. Substrat konsantrasyonlarının kinetiği etkilemediği bu basamağa "0. derece kinetiği" denir. 71 • Km , bir enzime ve substratına özgüldür. • Enzimin substratına ilgisini (affinitesi) ni yansıtır. • Km , enzim-substrat ilişkisinde bir ölçüdür. • • • • • Km’i düşük olan bir enzim, substratına yüksek ilgi (affinite) gösterir. Enzim, aşağı substrat konsantrasyonunda doyar. Tersine büyük KM , enzimin substratına düşük ilgisini tanımlamaktadır. Km = mol/L olarak ifade edilir. Bir çok enzim için bu değer 10-3 – 10-5 mol/L arasında değişir. Km = k2 + k3 (mol/L) k1 72 Reaksiyon hızı V a VMAX b VMAX 2 [S] Kma Kmb ▪ Enzim a’nın küçük Km ‘i, enzimin substrata ilgisinin yüksek olduğunu yansıtır. ▪ Enzim b’nin büyük Km’i, enzimin substrata olan ilgisinin az olduğunu yansıtır. 73 Yüksek substrat konsantrasyonlarında [S] > Km reaksiyon hızı sıfırıncı basamaktıryani, substrat konsantrasyonundan bağımsız ve sabittir. vmax Vmax 2 Düşük substrat konsantrasyonund a [S] < Km, , reaksiyon hızı birinci basmaktıryani, substrat konsantrasyonuyla orantılıdır. o Km [S] [S]= Km : Substrat Kmdeğerine eşitse, başlangıç hızı, V maksimal hızın yarısına eşittir. Vi = max 2 74 Belirli bir andaki kataliz hızı: Vo = VMAX [S] Michaelis-Menten Eşitliği [S] + Km ▪ Michaelis-Menten denklemi hiperbolik bir eğrinin denklemidir. ▪ Bu denklem tersine çevrildiğinde düz eğri elde edilir. ▪ Düz eğrinin (doğru) çizilmesi ile Km ve VMAX değerlerinin duyarlı bir biçimde belirlenmesi kolaylaşmaktadır. ▪ Bu doğru ayrıca enzim inhibitörlerinin etki mekanizmalarının saptanmasında da kullanılır. 75 Lineweaver-Burk denklemi Michaelis-Menten eşitliği, hiperbolik bir eğrinin denklemidir. Bu denklem tersine çevrildiğinde, Lineweaver-Burk denklemi ve doğrusal grafik elde edilir. 1 K m + [S ] = Vo Vmax + [ S ] Km 1 [S] = + Vo Vmax Vmax [S] Km 1 1 1 = + Vo Vmax [ S ] Vmax (Doğru denklemi: y= ax + b) 76 1 ile 1 arasında bir grafik çizildiğinde, doğrunun y eksenini [S] [Vo ] 1 , x eksenini ise Vmax değerlerinde kestiği görülür Lineweaver - Burk grafiği doğrusal olduğundan, Km ve Vmax değerlerinin doğru olarak belirlenmesi mümkün olur. Bu grafik ayrıca enzim inhibitörlerinin etki mekanizmalarının araştırılmasında da kullanılır. 77 Lineweaver-Burk çift-resiprok Eğrisi 1 V0 Km VMAX . 1 Km . Eğim 1 VMAX 1 [S] 78 Enzimlerin tek bir Km değeri mi bulunur? • • • • Enzimleirn Km değerleri birbirinden çok farklılık gösterir. Ancak birden fazla enzim aynı Km’e sahip olabilir. Birçok enzim için bu değer 10-5-10-3 M arasındadır. Km değeri enzimin substrata olan ilgisini gösterir, enzim konsantrasyonuna bağlı değildir. • Metabolik ardışık reaksiyonlarda Km değeri hız kısıtlayıcı basamağı gösterir. • Yüksek Km değeri kabaca en yavaş basamağa aittir. • Yine enzim üzerine bir inhibitörün etkisi varsa Km bize bu etki tarzı hakkında da bilgi verir. 79 Km Değerinin Bilinmesinin Önemi ▪Enzimlerin Saflaştırılması ▪Dokularda enzim aktivitesinin saptanması ▪İlaç imalatında ▪Enzim inhibitörlerinin belirlenmesi 80 • Bu grafiğin sonuçları düşük substrat konsantrasyonlarında kesin olmadığı için matematiksel olarak Michaels-Menten denklemine alternatif Eadie-Hofstee, Hanes-Woolf ve Eisenthal-Cornish-Bowden denklemleri geliştirilmiştir. En yaygın kullanılanı Linewieaver-Burk denklemdir. • Eadie and Hofstee grafiği; Vo/ [S] (y-ekseni)'e karşı çizilen Vo grafiğidir. yeksenini kesen nokta Vmax/ Km; x-eksenini kesen nokta V max değerini verir. Eğim = -1/ Km'dir. • Hill eşitliği; Kooperatif bağlanma kinetiği gösteren enzimlerde kullanılır. Eğim "n" ile gösterilir. • n=1 ise bağlama bölgeleri birbirinden bağımsızdır, • n>1 ise bölgeler kooperatif olup sigmoid bir kinetik gösterirler, değer arttıkça kooperatiflik daha güçlüdür, • n < 1 ise bölgeler negatif kooperative gösterir. 81 Enzim aktivitesinin düzenlenmesindeki yollar • • • • • • • Substratın bulunması (hızı artırır) Ürün birikim (hızı azaltır) Genetik kontroller (transkripsyonel düzenleme) Allosterik düzenleme Çeşitli formlarda enzimler mevcudiyeti (izoenzimler) Kovalent modifikasyon Proteolitik bölünme gibi çeşitli şekillerde modüle edilir. 82 ENZİM AKTİVİTESİNİN İNHİBİSYONU ▪ Enzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızını azaltan ya da engelleyen maddeye inhibitör adı verilir. İnhibitör, bir molekül yada iyon olabilir. ▪ Enzim katalizinin engellenmesi olayına ise inhibisyon denir. 83 Enzim Katalizinin İnhibisyonu (engellenmesi) 1. Enzimlerin yapısal özelliklerinin ve katalitik aktivitelerinin incelenmesinde önemli rol oynar. 2. Hücre içindeki metabolik yolların belirlenmesinde yol gösterir. 3. Biyolojik sistemlerin temel kontrol mekanizmasını oluşturur. 4. Pek çok ilaç ve zehirli bileşik tarafından ortaya çıkabilir. 84 Enzimlerin inhibisyonu; ▪ reversibl (tersinir, geriye dönüşümlü) veya ▪ irreversibl (tersinmez, geriye dönüşümsüz) olarak iki grupta incelenir. 85 1-Geriye dönüşümlü (reversibl) inhibisyonlar: • Bu tip inhibisyonlarda substrat konsantrasyonunun ya da inhibitöre oranla enzim konsantrasyonunun arttırılması ile enzim inhibitör ilişkisi tersine çevrilebilmektedir. 86 a)Yarışmalı (kompetitif) inhibisyon: ▪İnhibitör (İ) enzimin aktif bölgesine substratla (S) yarışarak bağlanmaktadır. ▪İnhibitör molekülünün yapısı substratın yapısına benzediğinden dolayı enzim ile inhibitör kolaylıkla bağlanırlar, ancak ürün oluşamamaktadır. Bu tip inhibitörler, enzime asıl substratın bağlanmasını engelleyen maddelerdir. ▪Bu tür inhibisyonda Vmax’a ulaşmak için daha fazla substrat gereklidir. ▪Ortamda substrat moleküllerinin arttırılmasıyla enzimin inhibitöre olan ilgisi azalmakta ve inhibisyon ortadan kalkmaktadır. 87 Kompetitif İnhibisyon E +S + İ ES E+Ü ES, İ bağlayamaz. Eİ, Ü oluşturamaz. Eİ VMAX DEĞİŞMEZ. Km 88 İnhibitörsüz VMAX Yarışmalı İnhibitör ile Reaksiyon hızı (Vo) VMAX 2 Km ▪ İnhibitör varlığında VMAX değişmez, buna karşılık Km değişir. [S] Km ▪ İnhibitör varlığında Km değeri büyür, enzimin substrata olan ilgisi azalmıştır. 1 Vo Yarışmalı inhibitör ile 1 VMAX 1 Km 1 Km inhibitörsüz 1 [S] 89 • Bir molekülün, belirli bir enzimin inhibitörü olup olmadığı, yahut inhibisyonun tipi, kinetik analizlerle ortaya konulur! • Metanol zehirlenmesinin tedavisinde yarışmalı inhibisyondan faydalanılır. • Metanol, alkol dehidrogenaz etkisiyle FORMALDEHİD’e dönüşür. • Formaldehid körlüğe yol açar. • Etanol, alkol dehidrogenaza bağlanmada metanol ile yarışır. Böylece formaldehid oluşumu yarışmalı olarak engellenir. • Metanol zehirlenmesinde damar-içi etanol uygulanır. 90 b)Yarışmasız (nonkompetitif) İnhibisyon: ▪ Substratla yapısal benzerliği olmayan inhibitör, substratla aynı bölgeye bağlanmaz. ▪ Yarışmasız inhibitör, ya serbest enzime ya da ES kompleksine bağlanarak reaksiyonu yavaşlatır. ▪ Substrat konsantrasyonu arttırılarak inhibisyon ortadan kaldırılamaz. E +S +İ Eİ + S ES E +Ü Km DEĞİŞMEZ +İ EİS VMAX Ü 91 Nonkompetitif İnhibisyon 92 İnhibitörsüz VMAX VMAX V2 Yarışmasız İnhibitör MAX 2 [S] Km 1 V o Yarışmasız inhibitör 1 VMAX 1 Km 1 VMAX inhibitörsüz 1 [S] 93 c)Yarışmasız (unkompetitif) inhibisyon: ▪ İnhibitör, sadece ES kompleksine bağlanır. ▪ İnhibitör bağlandığında ürün oluşumu sonlanır. E +S ES E+Ü + İ EİS Ü VMAX Km 94 Unkompetitif İnhibisyon 95 VMAX Unkompetitif inhibitör VMAX 2 ½ VMAX Km [S] Km 1 V o İ 1 VMAX 1 Km 1 Km 1 VMAX 1 [S] 96 Kinetik sabiteler üzerine reversibl inhibitörlerin etkileri 97 2- Geriye dönüşümsüz (tersinmez, irreversibl inhibisyon) ▪ Bu tip inhibisyonlarda aktif bölgeye kovalent olarak bağlanan inhibitör, enzim yapısını bozduğu için geriye dönüş olmamaktadır. ▪ İnhibitör, enzim aktivitesi için gerekli olan fonksiyonel gruplara bağlanır veya bunların yapısını bozar. ▪ İnhibitörün yapısı substrata benzemez ve substrat konsantrasyonunu artırmak inhibisyonu gidermez. ▪ Kinetik olarak nonkompetitif inhibisyonlarla aynı özellikleri taşır. ▪ İrreversibil inhibitörlerin özel bir sınıfı intihar (suisid) inhibitörlerdir. ▪ Ankompetitif inhibitör, substrattan farklı bir yere ve daima ES kompleksine bağlanır. ▪ Enzim-inhibitör substrat kompleksi, hiçbir zaman ürünlere dönüşmez. ▪ Vmax azalır ve Km azalır. 98 ▪Sinir gazlarından DIPF (diizopropil fosfofluoridat) asetilkolin isimli nörotransmittörü parçalayan asetilkolin esteraz’ ın tersinmez inhibitörüdür. ▪Asetilkolin bir sinir hücresindeki uyarıyı diğer bir hücreye aktaran maddedir. Bu etkisi sona erdikten sonra, asetilkolin esteraz tarafından hidrolize uğrar. ▪Asetilkolin esteraz’ın aktif bölgesinin DIPF tarafından tersinmez inhibe edilmesi hidroliz olayını engeller ve bunun sonucunda felç meydana gelir. ▪ Tarımda kullanılan insektisidler (böcek öldürücüler) de asetilkolin esterazın tersinmez engelleyicisidir. ▪ Birçok insektisidin bileşiminde bulunan fosforlu organik yapı aktif bölgesinde serin amino asidini içeren enzimlerle geriye dönüşümsüz inhibisyon yapar. 99 Kurşun zehirlenmesi ▪Kurşun, proteinlerin yapısında yer alan sistein isimli aminoasidin sülfhidril grubuyla (-SH) kovalent bağlar oluşturur. ▪Hemoglobin sentezinde, protoporfirin isimli maddeye Fe+2 girişini katalizleyen ferrokelataz ve yine bu sentezde yer alan δ-aminolevülinat dehidraz isimli enzimler kurşunun geri dönüşümsüz inhibisyonuna duyarlı enzimlerdir. 100 3-Bazı ilaçlar da enzim inhibitörü olarak etki ederler. ➢ Penisilin ve amoxicillin gibi yaygın olarak kullanılan antibiyotikler, bakteri duvarı sentezine ait enzimleri inhibe ederek etki gösterirler. ➢ ACE (angiotensin-konverting enzim) inhibitörleri (captopril, enapril gibi) kan basıncını düşüren ilaçlardır. ➢ Bu etkilerini, angiotensin I’i vazokonstriktör (damar büzücü) etkili angiotensin II’ye çeviren ACE’yi bloke ederek gösterirler. Angiotensin I ACE captopril, enapril (inhibitör etki gösteren ilaçlar) Angiotensin II (Damar büzücü etkili) 101 İnhibisyona örnek çeşitli ilaçlar Fosfodiesterazlar https://doi.org/10.3390/ijms21155338 102 ENZİM AKTİVİTESİNİ DÜZENLENMESİ Bir metabolik yolun belli bir hızda ve yönde ilerleyebilmesi için kontrol altında tutulması gerekir, bu da enzimlerin sayesinde olur. Enzim aktivitesi 2 şekilde kontrol edilebilir: 1-Enzimin mutlak miktarının değişimi 2-Enzimin katalitik etkinliğinin değişimi 103 1-ENZİMİN MUTLAK MİKTARININ DEĞİŞİMİ ▪Organizma var olan enzim miktarını, enzim sentez hızlarını değiştirerek düzenleyebilir. ▪Enzim proteinin sentezi ihtiyaca göre artabilir (indüklenme) ya da azalabilir (represyon, baskılanma). ▪İndüksiyon ile enzim sentezi artar, represyon ile enzim sentezi azalır. ▪Derepresyon ile enzim sentezi baskıdan kurtulup tekrardan artar. ▪Uzun dönemli düzenlenmedir. ▪Bu tip düzenlenme yavaş gerçekleşir. 104 Enzim sentezi indükleyici bir maddeye cevap olarak tetiklenebilir. ▪Escherichia coli isimli mikroorganizma glukozun bulunduğu ortamda glukozu kullanır. ▪Ancak bir disakkarid olan laktozu, β-galaktozidaz isimli enzimi bulunmadığından dolayı galaktoz ve glukoza hidrolizleyemez. ▪Ortamdan glukoz çıkarılıp yerine laktoz ilave edildiğinde, mikroorganizma laktozu kullanır hale gelir. ▪Laktoz (indüktör) protein yapısında olan β-galaktozidazın sentezlenmesini indüklemiştir. İndükleyici maddelerin çoğu, enzimlerin substratlarıdır. Ancak substrata yapısal bakımdan benzeyen bileşikler de indükleyici madde olabilirler fakat substrat olamazlar! 105 ▪Salmonella isimli mikroorganizma histidin bulunan ortamda, kendisi histidin sentezleyemez (represyon, baskı altına alma). ▪Histidin korepresör’dür, yani kendi sentezi ile ilgili enzimlerin sentezini engellemektedir. ▪Histidin represyon etkisini bir proteine bağlanarak yapar. ▪Bu proteine aporepresör denir. ▪Aporepresör-korepresör, enzim sentezini kontrol altına alır. ▪Ortamdan histidin çıkarılması yahut bu maddenin tükenmesi, enzim biyosentezinin tekrardan başlamasını sağlar (derepresyon, baskının ortadan kaldırılışı). 106 2-ENZİMİN KATALİTİK ETKİNLİĞİNİN DEĞİŞİMİ Kısa dönemli düzenlenmelerdir. 1. Enzim molekülünün aktivasyon-inhibisyonu (Allosterik enzimler) 2. Kovalent Modifikasyon 3. Zimojen Aktivasyonu 107 1.ALLOSTERİK ENZİMLER Allosterik “başka yere ait” anlamına gelir. ▪ Aktif bölgeleri dışında bir yere nonkovalent olarak bağlanan efektör (modülatör) isimli moleküller tarafından düzenlenirler. ▪ Allosterik efektörün enzime bağlanması sonucunda, enzimin substratına olan ilgisi değişir. ▪ Efektör, enzim aktivitesini inhibe ettiğinde negatif efektör, aktiviteyi arttırdığında pozitif efektör denir. ▪ HIZ DÜZENLEYİCİ ENZİMLERİN ÇOĞU ALLOSTERİK ENZİMLERDİR. ▪ Birden fazla alt üniteden meydana gelmişlerdir (oligomerik enzimler). ▪ Çoğunlukla metabolik yolun ilk basamağına etki ederler. 108 ▪ Enzim moleküllerinin üzerinde bir katalitik, bir de düzenleyici bölge bulunur. ▪ Düzenleyici bölgeye efektör, nonkovalent olarak bağlanır. SUBSTRAT KATALİTİK BÖLGE II. AKTİVATÖR (pozitif efektör) I. İNHİBİTÖR (negatif efektör) DÜZENLEYİCİ BÖLGE Enzimin aktif bölgesi substratı için, allosterik bölgesi modülatör için spesifiktir. 109 110 ✓ İki alt birimli bir enzimin 1. alt ünitesine efektörün bağlanması sonucunda, 2. alt birimin substrat bağlanması etkilenmektedir. ✓ Efektör, 2. alt birime substrat bağlanmasını hızlandırabilir ya da yavaşlatabilir. Bu olaya kooperativite adı verilir. ✓ Ortamda bulunan allosterik aktivatör enzimin etkinliğini arttırır, allosterik inhibitör ise enzimin etkinliğini azaltır. ✓ Allosterik enzimlerde, substrat ile hız arasındaki hiperbolik eğri, sigmoidal karakter kazanır. ✓ Bu grafik lineer olarak çizildiğinde ise kırık şekil alır. ✓ Böyle bir grafik enzimin 2 veya daha fazla alt üniteden meydana geldiğini gösterir. ✓ Allosterik modülatörler inhibitör veya aktivatör olabilir. ✓ Aktivatör genellikle substrattır. 111 Allosterik enzimler, basit enzimlerden büyük ve daha komplekstir. Allosterik enzimlerin kinetik özellikleri; • Sigmoidal bir eğri söz konusudur ve Hill eşitliği Kooperatif bağlanma kinetiği gösteren enzimlerde kullanılır. • Eğim "n" ile gösterilir. • n =1 ise bağlama bölgeleri birbirinden bağımsızdır; • n>1 ise bölgeler kooperatif olup sigmoid bir kinetik gösterirler, değer arttıkça kooperatiflik daha güçlüdür; • n < 1 ise bölgeler negatif kooperative gösterir. 112 V Sigmoidal eğri S 1/V kırık eğri 1/S 113 ✓ Substratın kendisi aktivatör ya da inhibitör olarak davrandığında homotropik etki denir. Aktif bölge ile regülatör bölge aynıdır. ✓ Bu olaya 4 altüniteden meydana gelmiş enzimlerde rastlanır. ✓ Bir allosterik enzim kendi substratından başka bir efektör tarafından aktive ya da inhibe edilmekte ise heterotropik etki denir. Monomerik allosterik enzimlerde görülen bir düzenlenmedir. 114 ▪ Bir ara ürün veya son ürün de enzim etkinliğinin düzenlenmesinde görev yapabilir (heterotropik modülasyon). ▪ Bu ürün kullanılmıyor birikiyor ise, bu yolda görevli 1. veya 2. enzimi “negatif feed back” başa tepki şeklinde inhibisyona uğratır. A E B E2 C E3 D 1 Hız düzenleyici enzim Feed back İnhibisyon D’nin konsantrasyonu, sentezlendiği kadar tüketilmediğinden dolayı artacak olursa, metabolik yoldaki ilk enzim inhibe olur. Düzenleyici enzimler sayesinde son ürünün birikimi engellenmiş olur! 115 PFK-1 ‘in allosterik regülasyonu 116 2. KOVALENT MODİFİKASYONA UĞRAYAN SİSTEMLER ▪Bazı enzimlerin katalitik etkileri kovalent modifikasyonlarla değişebilir. ▪Aktivitelerinde kovalent modifikasyona uğrayan enzimler birbirine dönüşebilen enzimlerdir. Bu enzimler iki aktivite halinde bulunurlar: Yüksek ve düşük aktivite ▪En sık rastlanan modifikasyon şekli, enzim molekülünün yapısındaki belirli serin, treonin veya tirozin isimli aminoasitlere bir fosfat grubunun eklenmesi veya bir fosfat grubunun çıkarılmasıdır. 117 • Reversibil bir modifikasyondur. • Kovalent olarak modifikasyona uğrayan gruplar: ✓ Fosfat, AMP, UMP, ADP-riboz, ve metil gruplarıdır. • Kovalent modifikasyon reaksiyonları ve katılan amino asitler; Fosforilasyon (Serin, treonin ve tirozin), Adenilasyon (Tirozin), Uridilasyon (Tirozin), ADP ribozilasyonu (Arginin, glutamin, sistein), Metilasyon (Glutamat) 118 Protein aktivitelerinin ortak kovalent modifkasyonları 119 ▪Bazı enzimlerde fosfoenzim, bazılarında ise defosfo enzim şekil daha aktif olabilmektedir. OH serin Fosforilasyon Enzim serin Enzim O O-P-OO- Defosforilasyon Metabolik yolun gereksinimine uygun olarak, fosfat grubunun enzime ilavesi ya da enzimden ayrılması sonucunda, enzim iki faklı şekilde çalışmaktadır. 120 121 Glikojen sentaz Glukoz Glikojen Glikojen fosforilaz Defosfo şekil (aktif) Glikojen sentaz Glikojen fosforilaz Fosfo şekil (inaktif) Fosfo şekil (aktif) Defosfo şekil (inaktif) 122 • Organizmanın glukoza gereksinimi olduğu esnada, glikojen sentaz fosforillenerek aktivitesini kaybeder. • Aynı esnada glikojen fosforilaz bir fosfat grubu bağlayarak aktif şekle dönüşür. • Bu sayede depo maddesi glikojenden glukoz sağlanmış olur. • Fosforilasyon ve defosforilasyon sırası ile protein kinaz ve protein fosfataz ismi verilen enzimler tarafından gerçekleştirilmektedir. • Bu enzimler ise hormonal ve sinirsel kontrol altında tutulmaktadır. 123 Kinaz ve Fosfataz isimli enzimler kovalent modifikasyonun reversibl (geri dönüşebilir) oluşunu sağlayan enzimlerdir. ADP ATP Mg+2 Kinaz Enzim-Serin Enzim-Serin O-PO3-2 Fosfataz Mg+2 Pi H2O ENZİMİN KOVALENT MODİFİKASYONU 124 3.ZİMOJEN AKTİVASYONU ▪Hücre dışında görev yapan bazı enzimler, bulundukları yere zarar vermemeleri için aktif olamayan öncül moleküller şeklinde sentez edilirler. Bu moleküllere proenzim veya zimojen adı verilmektedir. ▪Zimojen aktivasyonu bir veya birkaç peptid bağının koparılması (yarılması, kırılması) ile olur. ❖ Pankreasta sentezlenen tripsinojen (inaktif) etki gösterdiği bağırsaklara salgılandığında peptid bağları kırılır ve aktif şekle dönüşür. 125 126 Tripsinojen (İnaktif) Enterokinaz Kimotripsinojen Tripsin (İnaktif) Tripsin (Aktif) Kimotripsin Proteinlerdeki aromatik (Aktif) aminoasidleri ayırır. (Tirozin,fenilalanin, triptofan) Kan plazmasında: Fibrinojen (İnaktif) Trombin Fibrin (Aktif) 127 Enzim aktivitesinin düzenlenme mekanizmaları ve hızları 128 İzozim veya izoenzimler • Aynı tepkimeyi katalizleyen belli bir enzimin değişik formlarına verilen isimdir. • Aynı enzimin izozimleri farklı genler tarafından kodlanır. • Amino asit dizilimleri farklıdır. • İzozimlerin alloenzimlerden farkı tek bir gen lokusunda allel varyasyonundan kaynaklanan enzimler olmasıdır. • Her doku kendine özgü enzimi sentezler. • Ancak dördüncül yapısı olan enzimlerin izoenzimleri vardır. • Substrat ve kofaktöre farklı afinite gösterirler. • Km'leri ve immünolojik özellikleri farklıdır. 129 130 İzoenzim analiz yöntemleri katalitik özelliklerdeki farklılıklar temeline dayanan yöntemler dışında kullanılan yöntemler; • Elektroforez • Kromatografi • Seçici inaktivasyon • İmmunokimyasal yöntemler • Doku spesifik izoenzimlerin kanda tespiti, doku hasarının yerinin belirlenmesinde tanısal amaçla kullanılır; izoenzim aktivitelerinin bilinmesi klinik tanıda yol göstericidir. 131 ENZİMLER VE KLİNİK ÖNEMİ • Doku hasarının bir göstergesi olan enzimlerin serum düzeylerinin; klinik lab.da ölçülmesi hastalıkların tanı ve tedavisinin takibinde önemli rol oynar. • Normal bir serum enzim düzeyi; enzimin sentez hızı ile hücre yıkımı sırasında plazmaya salınım hızı ile dolaşımdan temizlenme arasındaki dengeyi gösterir. Fonksiyonel plazma enzim nedir? • Bazı enzimler, pro-enzimler şeklinde veya bunların substratları olarak plazmada bulunur. • Bu fonksiyonel (işlevsel) plazma enzimlerine lipoprotein lipaz, psödokolinesteraz, kan pıhtılaşması (serin proteaz, prokoagülanları; trombin, koagülasyon faktörleri) ve kan pıhtısı çözünmesinde görevli olan proenzimler (fibrinilotik enzimler veya öncülleri; plazminojen, plazmin proaktivatör vb.) örnek olarak verilebilir. Bu enzimlerin çoğunluğu karaciğer tarafından sentezlenir ve salgılanır. Fonksiyonel olmayan plazma enzimi nedir? • Plazmada fonksiyonu olmayan birçok enzim hastalıkların tanı ve tedavisi için önemli bir araçtır. • Bu işlevsel olmayan plazma enzimleri eritrositler, lökositler ve diğer hücrelerin rutin normal yıkımları sonucu ortaya çıkar. • Genellikle plazmada bu enzim seviyelerindeki artışlar doku hasarı veya nekroz, yaralanma ya da hastalık sonucuna eşlik etmektedir. • Vücut sıvılarında direkt olarak enzim protein kons. ölçülmesi yerine ürün / substrat kons. değişiklikler izlenerek enzim aktivitesini ölçmek daha kolaydır. Fonksiyonel ve fonksiyonel olmayan enzimlerin farklılıkları Fonksiyonel plazma enzimleri Fonksiyonel olmayan plazma enzimleri Plazma Plazma kons. Dokuya konsantrasyonları oranla yüksek Normal şartlarda plazma konsantrasyonu dokuya oranla çok düşük Fonksiyonu Substratı Biliniyor Substratları kanda (plazma) mevcut Bilinmiyor Substratları kanda (plazma) yok Sentez yeri Karaciğer KC, Kalp, iskelet kası, beyin gibi farklı organlar Hastalıktaki etkisi Karaciğer hastalıklarında Farklı organ hastalıklarında artar azalır Örnek Protrombin gibi pıhtılaşma faktörleri, Lipoprotein lipaz, psödokolinesteraz AST, ALT, CK, alkalin fosfataz, asid fosfataz, lipaz, amilaz Proteins and enzymesMurphy, Michael, MA MD FRCP FRCPath, Clinical Biochemistry: An Illustrated Colour Text, 25, 50-51Plasma levels of intracellular enzymes in diagnosis of disease. Karaciğer Hastalıkları ve Enzimler Aminotransferazlar Pankreas Hastalıkları ve Enzimler • • • • Serum amilaz Lipaz Tripsin Kimotripsin Amilaz Kemik Hastalıkları ve Enzimler • Kemik ALP • Tartarat dirençli asit fosfataz Kas Hastalıkları ve Enzimler • • • • • Aldolaz total kreatin kinaz (CK, CPK) CK-MB Aspartat transaminaz (AST) Laktat dehidrojenaz (LDH) Kreatin kinaz Kalp hastalıklarının tanısında yararlı enzimler • • • • total kreatin kinaz (CK, CPK) CK-MB aspartat transaminaz (AST) laktat dehidrojenaz (LDH) Kalp hastalıklarının tanısında yararlı enzimler Klinik Tanıda Kullanılan Diğer Enzimler • • • • • LDH Asetilkolin esteraz Kolinesteraz İzositrat DH Glukoz-6-P DH Genetik hastalıkların tanısında yararlı enzimler • Genetik hastalıkların tanısında serumda fenilalanin hidroksilaz, galaktoz-1fosfat üridiltransferaz, glukoz-6-fosfataz gibi birçok enzimin aktivitesinin tayini yararlı olmaktadır. Kalıtsal enzim anormalliklerinin sonucu ortaya çıkan 140’tan fazla hastalık bilinmektedir. Enzimatik kusura bağlı olarak gelişen çeşitli patolojik durumlar vardır: • 1) Kusurlu enzimin normal substratının birikmesi. • Örneğin fenilalanin hidroksilaz eksikliğine bağlı olarak ortaya çıkan fenil ketonüride kanda fenilalanin birikir. • Galaktoz-1-fosfat üridiltransferaz eksikliğine bağlı olarak ortaya çıkan galaktozemide galaktoz-1-fosfat birikir. • Glukoz-6-fosfataz eksikliğine bağlı olarak ortaya çıkan tip I glikojen depo hastalığında (Von Gierke hastalığı) karaciğerde glikojen birikir. Genetik hastalıkların tanısında yararlı enzimler • 2) Enzimlerin nihai ürünlerinin eksikliği. • Örneğin adrenal hiperplazi tip I’de enzim eksikliklerine bağlı olarak kortizol oluşumu bozulur. • 3) Biriken substratın yan yollara sapması. • Örneğin adrenal hiperplazi tip I’de enzim eksikliklerine bağlı olarak kortizol oluşumu bozulunca anormal androjenik ürünler oluşur. Galaktozemide dulsitol oluşur ve bu da gözde birikerek katarakta neden olur. Hematolojik hastalıkların tanısında yararlı enzimler • Hematolojik hastalıkların tanısında anaerobik glikoliz ile ilgili bazı enzimler, pentoz fosfat yolu ile ilgili bazı enzimler, glutatyon metabolizması ile ilgili bazı enzimler, adenozin deaminaz gibi pürin ve pirimidin katabolizması enzimleri, Na+/ K+ ATPaz, lesitin kolesterol açil transferaz (LCAT) gibi eritrosit membranı fosfolipid kompozisyonunu etkileyen enzimler, methemoglobin redüktaz enzimleri gibi enzimlerin aktivite tayinleri yararlı olmaktadır. Glukoz-6-fosfat dehidrojenaz yetmezliği • Glukoz-6-fosfat dehidrojenaz yetmezliği, pentoz fosfat yolunun işlememesi ve sonuçta eritrositleri oksidan etkenlerden koruyan NADPH’lerin oluşamamasına bağlı olarak şiddetli hemolitik krizlere neden olabilir. • Glukoz-6-fosfat dehidrojenaz yetmezliğinde, çiğ bakla yenmesi, antimalaryal ilaçlar, sulfonamidler, nitrofuran ve fenasetin turevleri, vitamin K analogları alınmasından sonra şiddetli hemolitik kriz ortaya çıkar. Enzim Aktivitelerinin Tayininde Kullanılan Yöntemler • Spektrofotometrik yöntem, Pekçok enzim substratı, ürünü veya koenzimi, görülen ışıkta veya ultraviyole ışıkta bir tepe değeri göstererek, absorbans vermektedir. • Monometrik yöntem, Bir komponenti gaz olan enzimlerin aktivitesini ölçmek için kullanılan yöntemdir. Örneğin; oksidazlarla oksijen alınımı ve dekarboksilazlarla karbon dioksit salınımı bu yöntemle ölçülür. • Thunberg yöntemi, Çok sayıda dehidrogenaz enziminin aktivitesi bu yöntem kullanılarak ölçülür. • Elektrot yöntemi, Cam elektrotlarla oluşan ürünlerin ölçülmesi esasına dayanır. Enzim Aktivitelerinin Tayininde Kullanılan Yöntemler • Polimerik yöntem, Pekçok enzimin substratı optikçe aktiftir. Eğer üründe optik aktivite değişmesi görülecek olursa bu yöntem kullanılmaktadır. • Kromatografik yöntem, Diğer yöntemlerle bir ölçme yapılamadığında bu yönteme başvurulur. • Kimyasal tayin yöntemi, Birçok enzim reaksiyon başladıktan sonra belirli zaman aralıklarında karışımdan örnek alıp, substrat ve ürünün kimyasal yöntem ile miktarı tayin edilir. ELISA • ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay testinin İngilizce kısaltmasıdır. • Antijen-antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. LS-F5040 is a 96-well enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the Quantitative detection of Human LDH / Lactate Dehydrogenase in samples of Plasma, Serum and Tissue Homogenates. It is based upon a Sandwich assay principle and can be used to detect levels of LDH / Lactate Dehydrogenase as low as 0.057 nanograms per millilter.