Ensemble Slides de Maud - Biology Cellulaire PDF

CHAPITRE 1: LES MEMBRANES ET LE TRANSPORT MEMBRANAIRE (MM) BIOLOGIE CELLULAIRE FONCTIONS DES MEMBRANES : COMPARTIMENTALISATION  Membrane plasmique qui délimite l’intérieur de la cellule et joue le rôle de barrière sélective (échanges contrôlés!).  Les membranes délimitent et isolent aussi le...

CHAPITRE 1: LES MEMBRANES ET LE TRANSPORT MEMBRANAIRE (MM) BIOLOGIE CELLULAIRE FONCTIONS DES MEMBRANES : COMPARTIMENTALISATION  Membrane plasmique qui délimite l’intérieur de la cellule et joue le rôle de barrière sélective (échanges contrôlés!).  Les membranes délimitent et isolent aussi les organites intracellulaires. FONCTIONS DES MEMBRANES : COMPARTIMENTALISATION  Membrane plasmique qui délimite l’intérieur de la cellule et joue le rôle de barrière sélective (échanges contrôlés!).  Les membranes délimitent et isolent aussi les organites intracellulaires.  C’est une compartimentalisation fonctionnelle: elle permet la spécialisation des processus, l’isolation des processus incompatibles et le contrôle de la qualité de certains processus. Microscopie électronique (ME) Voir cours sur la microscopie FONCTIONS DES MEMBRANES : AUGMENTATION DE LA SURFACE D’ÉCHANGE ME  Microvillosité au pôle apical d’une cellule épithéliale de l’intestin ME  Réticulum endoplasmique de cellules épithéliales de la glande mammaire (synthèse des protéines du lait) STRUCTURE DES MEMBRANES : HISTORIQUE La membrane plasmique  Nageli et Cramer (1855): Concept de membrane en tant que barrière et description des phénomènes osmotiques  Overton (1855): Hypothèse d’une membrane constituée de lipides pour expliquer le passage de substances hydrophobes  Langmuir (1917): Monocouche d’acides gras verticaux STRUCTURE DES MEMBRANES : HISTORIQUE La membrane plasmique  Gorter et Grendel (1925): Concept de bicouche lipidique Estimation sur base de microscopie optique Estimation sur base de l’isolation des lipides et de la reconstitution d’une mono-couche STRUCTURE DES MEMBRANES : HISTORIQUE La membrane plasmique  Gorter et Grendel (1925): Concept de bicouche lipidique ? Protéines STRUCTURE DES MEMBRANES : HISTORIQUE La membrane plasmique  Danielli et Davson (1935): Modèle de “sandwich de lipides” ME STRUCTURE DES MEMBRANES : HISTORIQUE La membrane plasmique  Singer et Nicolson (1972): Modèle de “mosaïque fluide”  Pour expliquer les fonctions de la membrane et sa fluidité  Les protéines membranaires interagissent avec la bicouche à différents niveaux (fractionnement des membranes par congélation) STRUCTURE DES MEMBRANES : HISTORIQUE La membrane plasmique  Singer et Nicolson (1972): Modèle de “mosaïque fluide”  L’organisation de la couche lipidique permet la stabilité de la structure et sa fonction de barrière  Les échanges avec l’extérieur sont rendus possibles par la présence de nombreuses protéines transmembranaires STRUCTURE DES MEMBRANES EN MOSAÏQUE FLUIDE: TECHNIQUES STRUCTURE DES MEMBRANES EN MOSAÏQUE FLUIDE: TECHNIQUES Mosaïque fluide = les protéines flottent librement dans la membrane  Experience of D. Frye and M. Edidin,J. Cell Sci (1970) STRUCTURE DES MEMBRANES EN MOSAÏQUE FLUIDE: TECHNIQUES Mosaïque fluide = les protéines flottent librement dans la membrane  Experience of D. Frye and M. Edidin,J. Cell Sci (1970) t=0 t=40 min COMPOSITION DES MEMBRANES Phospholipide Liquide extracellulaire (aqueux) Tête polaire (hydrophile) Hydrophile Hydrophobe Queue apolaire (hydrophobe) Hydrophile Molécule hydrophobe Molécule hydrophile Cytosol (aqueux) COMPOSITION DES MEMBRANES : TROIS GRANDES CLASSES DE LIPIDES MEMBRANAIRES  Phospho-glycérolipides 65 %  Sphingolipides 10% 25%  Stérols (ou phospho-glycérides) Sphingomyéline Glycosphingolipides PC, PE, PS, PG Cholestérol Formés de : Formés de : Formés de : ❑ 1 glycérol ❑ 1 sphingosine ❑ 1 noyau stérol ❑ 2 acides gras, 1 groupement phosphate ❑ 1 acide gras ❑ 1 acide gras ❑ 1 groupement X polaire et/ou chargé ❑ 1groupement X polaire ❑ 1 groupement X polaire COMPOSITION DES MEMBRANES : TROIS GRANDES CLASSES DE LIPIDES MEMBRANAIRES  Phospho-glycérolipides 65 %  Sphingolipides 10% 25%  Stérols (ou phospho-glycérides) Sphingomyéline Glycosphingolipides PC, PE, PS, PG Cholestérol Formés de : Formés de : Formés de : ❑ 1 glycérol ❑ 1 sphingosine ❑ 1 noyau stérol ❑ 2 acides gras, 1 groupement phosphate ❑ 1 acide gras ❑ 1 acide gras ❑ 1 groupement X polaire et/ou chargé ❑ 1groupement X polaire ❑ 1 groupement X polaire COMPOSITION DES MEMBRANES : CHAINE D’ACIDES GRAS Saturation  Acides gras saturés:  Animal en général  Solide à RT  Consommation liée à des problèmes cardio- vasculaire  Acides gras insaturés:  Végétal en général  Liquide à la température de la pièce COMPOSITION DES MEMBRANES : CHAINE D’ACIDES GRAS Saturation  Acides gras essentiel  Non synthétisable par l’homme (alimentation)  Porteur d’une insaturation au delà de la position 9  Exemple de l’acide stéarique COMPOSITION DES MEMBRANES : NOYAU  Phospho-glycérolipides  Sphingolipides (ou phospho-glycérides) Sphingosine  Stérols COMPOSITION DES MEMBRANES : NOYAU  Phospho-glycérolipides  Sphingolipides (ou phospho-glycérides) Réaction d’estérification entre une fonction alcool et un acide carboxylique de l’AG + Sphingosine COMPOSITION DES MEMBRANES : GROUPEMENT POLAIRE  Phospho-glycérolipides (ou phospho-glycérides) Acide aminé Alcool aminé COMPOSITION DES MEMBRANES : GROUPEMENT POLAIRE  Sphingolipides COMPOSITION DES MEMBRANES : GROUPEMENT POLAIRE  Stérols COMPOSITION DES MEMBRANES : EXEMPLES  Phospho-glycérolipides (ou phospho-glycérides)  Phosphatidylcholine  Phospholipide le pus abondant dans les membranes plasmiques  Surtout présent dans la couche externe  Aussi appelé lécithine COMPOSITION DES MEMBRANES : EXEMPLES  Sphingolipides  Sphingomyéline  Constituant majeur de la gaine de myéline  Forme des replis membranaires pour isoler les axones et augmententier la conduction du signal nerveux COMPOSITION DES MEMBRANES : EXEMPLES  Stérols  Cholestérol  Joue sur la fluidité de la membrane  Constituant membranaire mais aussi précurseur à la formation d’hormone stéroïdes et de vitamine  Biosynthèse par l’organisme si carence PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : FORME DES PHOSPHOLIPIDES Molécules amphipatiques en solution: réduction de l’exposition de la queue hydrophile à la phase aqueuse Bicouche lipidique en solution: autoassemblage de vésicules (liposomes) PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : APPLICATION DES LIPOSOMES Fabrication de liposome en laboratoire Application: encapsulation de molécules actives Bicouche lipidique en solution: autoassemblage de vésicules (liposomes) PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : FORME DES PHOSPHOLIPIDES Molécules amphipatiques en solution: réduction de l’exposition de la queue hydrophile à la phase aqueuse La forme dépend aussi du type de phospholipides et de la nature du groupement polaire PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : FORME DES PHOSPHOLIPIDES La composition des feuillets influence la courbure des membranes PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : IMPACT SUR LA FLUIDITÉ Membrane rigide Membrane fluide  La membrane plasmique est une mosaïque fluide : vrai pour les protéines mais aussi pour les lipides qui peuvent se déplacer dans la bicouche = fluidité membranaire  Cette fluidité est influencée par différents facteurs Phase gel (viscosité) Phase liquide PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : IMPACT SUR LA FLUIDITÉ Membrane rigide Membrane fluide  Facteurs externes: la température Une augmentation de la température entraîne la fluidification de la membrane Phase gel (viscosité) Phase liquide PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : IMPACT SUR LA FLUIDITÉ Membrane rigide Membrane fluide  Facteurs internes: nature des AGs La présence d’insaturations au sein des chaines carbonés des AG augmente sa fluidité (augmentation de la «désorganisation» interne) Phospholipides Phospholipides saturés insaturés PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : IMPACT SUR LA FLUIDITÉ Membrane rigide Membrane fluide?  Facteurs internes: nature des phospholipides Cas du cholestérol: L’insertion de cholestérol dans la membrane modifie son organisation (parfois jusque 50% des lipides totaux) ? Augmente ou diminue la fluidité PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : IMPACT SUR LA FLUIDITÉ La présence de cholestérol sert de tampon pour la fluidité membranaire  Le cholestérol augmente la fluidité  Le cholestérol diminue la fluidité des des membranes à basse température membranes à haute température On part d’une forte organisation On part d’une faible organisation En éloignant les AGs les uns des autres, il diminue la rigidité de la structure En interagissant avec les AGs, il diminue leur mobilité au sein de la membrane +: A basse température, le cholestérol protège la membrane de cassures +: A haute température, le cholestérol maintien la tenue de la membrane PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : IMPACT SUR LA FLUIDITÉ L’effet du cholestérol dépend aussi des lipides avec lesquels il interagit  L’effet sur l’organisation dépend de la forme des phospholipides: Impact plus important sur les phosphoglycérides que les sphingolipides FLUIDITÉ DES MEMBRANES : TECHNIQUES  Fluidité des membranes: Experience de FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) Microscopie à fluorescence (MF) Voir cours sur la microscopie Fluidité membranaire : La technique FRAP, d'après Alberts, B. (2013) Essential cell biology. - YouTube FLUIDITÉ DES MEMBRANES : TECHNIQUES  Fluidité des membranes: Experience de FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : IMPACT SUR LA FLUIDITÉ  Facteurs internes: la composition en protéines La présence de protéines associées la membrane diminue la fluidité de la membrane FLUIDITÉS DES MEMBRANES : TYPE DE MOUVEMENTS  La membrane peut être assimilée à un fluide à deux dimensions Diffusion latérale PROPRIÉTÉS DES MEMBRANES : IMPACTSUR LA FLUIDITÉ  Rotation  Protrusion  Transposition (ou flip-flop) FLUIDITÉS DES MEMBRANES : TYPE DE MOUVEMENTS Rapide et spontané Lent car thermodynamiquement défavorable Nécessité d’une enzyme de type « flippase » FLUIDITÉS DES MEMBRANES : TRANSPOSITION Flippase ou P-type flippase Mouvement vers l’intérieur Besoin d’ATP Spécifique du lipide Floppase ou ABC flippase Mouvement vers l’extérieur Besoin d’ATP Spécifique du lipide Scramblase Mouvement bidirectionnel ATP indépendant, Ca dépendant Non spécifique du lipide TRANSPOSITION : TECHNIQUE DE MISE EN ÉVIDENCE DES FLIPPASES Expérience d’extinction de fluorescence ASYMÉTRIE DES MEMBRANES BIOLOGIQUES ASYMÉTRIE DES MEMBRANES BIOLOGIQUES Syndrome de Bassen-Kornzweig ou aβlipoprotéinémie  Maladie génétique rare touchant le métabolisme des lipoprotéines  Nombreuses manifestations sévères (absorption des graisses, troubles neuro-musculaires, retards mentaux,…)  Caractérisé par la présence d’Acanthocytes dans le sang: érythrocytes dont la membrane est déformée  Cette déformation est due à une mauvaise distribution des lipides dans les feuillets: excès de sphyngomyéline au lieu de phosphatidylcholine LA MEMBRANE : UNE MOSAÏQUE PAS SI FLUIDE QUE CELA Existence d’accumulations localisées (micro-domaines) de certains lipides répartition non homogèns de certains lipides (cholestérol, sphyngomyéline) à la surface des membranes MF EXISTENCE DE RADEAUX LIPIDIQUES  Lipides des ilots très peu mobiles, mais ilots pouvant «dériver»  Enrichissement de lipides mais aussi de récepteurs, d’enzymes, de GTPases,…  → sans doute un rôle de plateforme de signalisation EXISTENCE DE RADEAUX LIPIDIQUES: TECHNIQUES Formation in vitro de membrane Extraction dans détergent: les rafts sont résistants Sonde spécifique aux rafts MF: suivi de la mobilité Sonde dont les propriétés dépendent des rafts LES MEMBRANES SONT COMPOSÉES DE LIPIDES ET DE PROTÉINES Nombreuses protéines associées aux membranes  Rôles de communication, d’échanges, de transport,… PROTÉINES MEMBRANAIRES  Différentes fonctions (transporteurs, récepteurs, enzymes, protéines de structure, protéines d’adhésion)  Différentes topologies d’association (intégrale ou intrinsèque, ancrée aux lipides par lien covalent ou périphérique) COMPOSITION DES MEMBRANES: GLYCOCALYX Les membranes externes sont recouvertes d’une couche de glucides (2 à 10%)  Polysaccharides liés de manière covalente aux protéines ou lipides membranaires (glycosilation)  Couche très hydrophiles créant un environnement hydrique  Protection (mécanique, acidité, enzymes), adhésion, reconnaissance (infection virale) GLYCOCALYX: TECHNIQUES Les lectines sont des protéines qui fixent les sucres avec grande affinité Concanavaline A: Lectine qui fixe spécifiquement le D-mannose et le D-Glucose Lectines Agglutinine: Lectine qui fixe spécifiquement le N-acetylglucosamine Couplage avec un fluorochrome MF PROTÉINES TRANSMEMBRANAIRES: STRUCTURE Glycophorine (erythrocytes) Région extracellulaire  Les régions transmembranaires adoptent généralement une structure en « hélice α »  Les radicaux sont en contact avec les lipides membranaires →hydrophobes Région transmembranaire Région intracellulaire PROTÉINES TRANSMEMBRANAIRES: STRUCTURE Glycophorine (erythrocytes) Région extracellulaire Région transmembranaire Région intracellulaire  Profil d’hydropathie: recherche de domaines riches en résidus hydrophobes PROTÉINES TRANSMEMBRANAIRES: STRUCTURE Bactériorhodopsine  Protéines à plusieurs domaines transmembranaires (souvent 7) APPLICATION DES RHODOPSINE: OPTOGÉNÉTIQUE  L’existence de ces canaux ioniques sensibles à la lumière présents chez certaines algues et bactéries a mené au développement d’une méthode non invasive d’optogénétique (lumière + génétique) pour contrôler les passage d’ions Rhodopsines Video | Optogenetics (nature.com) Purves et al Neurosciences, De Boeck, 2005 PROTÉINES TRANSMEMBRANAIRES: STRUCTURE  Les régions transmembranaires peuvent aussi adopter une structure en « tonneau β »: feuillets plissé β antiparallèles  Les radicaux ne sont pas forcément en contact avec les lipides membranaires →peuvent être hydrophiles Exemple des porines (membrane externe des bactéries gram- et des mitochondries)  Structure en forme de pore assez large et peu flexible PROTÉINES ANCRÉES À LA MEMBRANE  Ancrage direct par l’intermédiaire de lipides ou indirect par interaction avec des protéines transmembranaires  Exposition intra- ou extra-cellulaire PROTÉINES ANCRÉES À LA MEMBRANE Ancrage lipidique intracellulaire  Protéines directement liées à un acide gras  sur un palmitate (cystéine ou sérine interne)  sur un myristate (glycine n-terminale)  sur un farnesyl (cystéine c-terminale) O  Protéines maintenues proche de leur site d’action (enzymes, GTPases,…) Sérine PROTÉINES ANCRÉES À LA MEMBRANE Ancrage lipidique extratracellulaire : lien GPI  Lien Glyco Phosphatidyl Inositol Côté c-terminal des protéines Squelette de sucres Ancrage par le groupe phosphatidylinositol IMPORTANCE DU LIEN GPI Cas de l’hémoglobinurie paroxystique nocturne  Maladie rare touchant les cellules souches hématopoïétiques et donc les érythrocytes porteurs d’hémoglobine  Mutation du gène PIG-a, une enzyme intervenant dans la synthèse du groupr GPI (lien glucosamine-PI) IMPORTANCE DU LIEN GPI Cas de l’hémoglobinurie paroxystique nocturne  Diminution des protéines exposées à la surface des érythrocytes, dont CD55 et CD59, des protéines protégeant contre l’attaque du système du complément  Hémolyse des érythrocytes et relargage de l’hémoglobine qui arrive dans les urines IMPORTANCE DU LIEN GPI Cas de l’hémoglobinurie paroxystique nocturne  Diminution des protéines exposées à la surface des érythrocytes, dont CD55 et CD59, des protéines protégeant contre l’attaque du système du complément  Hémolyse des érythrocytes et relargage de l’hémoglobine qui arrive dans les urines  Manque d’érythocytes → anémie  Risque de thrombose (hémolyse plus aggrégats de plaquettes comme sources de thrombus  Traitement: greffe de moëlle osseuse IMPORTANCE DU LIEN GPI Cas de la variation antigénique chez le trypanosome  Protéine à ancre GPI: la protéine de surface VSG qui est très abondante et forme un «manteau» à la surface du trypanosome  Le système immunitaire de l’hôte infecté et ses anticorps ont uniquement accès à cette protéine  Le trypanosome a développé une stratégie d’évitement de la réponse acquise contre VSG: mécanisme de variation d’expression de protéines VSG IMPORTANCE DU LIEN GPI Cas de la variation antigénique chez le trypanosome  Plus de 800 gènes codant pour des VSGs  assez semblables pour être interchangeables fonctionnellement  assez différentes pour échapper aux anticorps dirigés contre une autre  Le système immunitaire va développer une nouvelle réponse immune adaptative mais le temps de latence permet aux parasites de se multiplier et d’exprimer une nouvelle VSG  Fatigue extrême due à toutes ces réponses immunes à répétition LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE  La perméabilité de la membrane dépend de la taille et de l’hydrophobicité de la substance à transporter  Elle est perméable aux gazs, aux petites molécules hydrophobes ou polaires non chargées  Elle est partiellement perméable à l’eau  Mise en place d’un transport par perméabilité sélective LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE  Le passage de substances à travers la membrane peut se faire avec ou sans dépense d’énergie  Transport passif: sans dépense d’énergie (mais peut impliquer des transporteurs !)  Transport actif: avec dépense d’énergie  Notion de gradients de concentration LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE Le transport passif  Diffusion simple  Osmose  Diffusion facilitée LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Diffusion simple à travers la membrane  Déplacement et redistribution de particules suivant leur gradient de concentration  Mouvements thermiques aléatoires: mouvement brownien (Robert Brown 1827) si C1=C2 DG=0 équilibre LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Osmose  Si les molécules ne son pas diffusibles mais que la membrane est perméable à l’eau (au solvant)  L’eau se déplace du côté hypotonique (dilué) vers le côté hypertonique (concentré), = gradient de concentration de l’eau  L’augmentation du volume de solution en engendre un gradient de pression sur la membrane: la pression osmotique LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Osmose: cas des érythrocytes  La morphologie des érythrocytes varie selon la concentration du milieu environnant LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Diffusion facilitée  La diffusion simple ne s’applique qu’à très peu de substances et est très lente  La diffusion facilitée se fait sans dépense d’énergie, selon le gradient de concentration mais à l’aide de protéines membranaires (canaux et transporteurs) qui vont accélérer le transport et augmenter sa sélectivité Canaux Transporteurs LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Transport facilité par canaux  Les canaux ioniques  Association de sous-unités polypeptidiques transmembranaires (typiquement 4 à 8) formant un pore  Le passage des ions est sélectif (taille et charge)  La nature des sous-unités détermine les propriétés du canal: la topologie du pore filtre selon l’encombrement de l’ion la présence de résidus chargés exposés filtre selon la charge  Exemple du canal au K+, dont la spécificité est donnée par une boucle interne (très sensible aux mutations!). Importance du contrôle de la perméabilité en potassium pour l’homéostasie cellulaire. Canal potassium LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Transport facilité par canaux  Les canaux ioniques  Les canaux ioniques (leur ouverture) peuvent être conditionnels et s’ouvrir en réponse à un stimulus chimique, mécanique ou électrique APPLICATION DES CANAUX IONIQUES Le potential de membrane  Notion de gradients électrochimiques: gradients de concentration et de charge (différence de potentiel électrique)  Potentiel de membrane au repos et potentiel d’action (influx nerveux) Voir chapitre dédié APPLICATION DES CANAUX IONIQUES CONDITIONNELS Le canal chlorure codé par le gène CFTR  CFTR, Cystic Fibrosis (=mucovicidose) Transmembrane Conductance Regulator car de nombreuses mutations sont connues pour être associées à la maladie  Canal exprimé au niveau de l’épithélium bronchique s’ouvrant en réponse à sa phosphorylation par la PKA pour maintenir l’homéostasie cellulaire CTFR Cils Noyau APPLICATION DES CANAUX IONIQUES CONDITIONNELS Le canal chlorure codé par le gène CFTR  Le canal est absent ou non fonctionnel (constitutivement fermé) quand le gène est muté  Surplus de Cl- dans les cellules épithéliales (concentration et charge) qui induit une forte réabsorption d’eau  Le mucus sécrété devient trop épais et s’élimine mal, les micro-organismes piégés aussi  Diagnostique possible selon la salinité de la sueur: les canaux CFTR des glandes sudoripares font ici rentrer les ions car le milieu extracellulaire (sueur) est fort salin. Mutation → sueur plus concentrée en sel LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Transport facilité par transporteur  Les transporteurs lient la molécule à transporter d’un côté de la membrane, opèrent un changement de conformation qui leur permet de relarguer la molécule de l’autre côté  C’est un uniport (une seule direction)  Exemple de Glut-1, un transporteur de glucose LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Transport facilité par transporteur  Augmentation de la vitesse de transport  Courbe de la vitesse de transport en fonction de la concentration externe  La diffusion facilitée permet une augmentation exponentielle (relation linéaire pour la diffusion passive)  Le transport est saturable (nombre limité de transporteurs  La constante Km représente la concentration nécessaire pour obtenir une vitesse de transport = 50% de Vmax LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT PASSIF Transport facilité par transporteur  Augmentation de la spécificité Glut-1 Substrat D-glucose L-glucose D-mannose D-galactose Km (mM) 1,5 >3000 20 30 EXEMPLE DE TRANSPORT FACILITÉ: LES AQUAPORINES Perméabilité des membranes biologiques à l’eau  Les membranes biologiques sont perméables à l’eau dans les deux directions MAIS  La vitesse de transport de l’eau dans les cellules ne peut être expliquée uniquement par cette diffusion  Elle est supérieure au sein des membranes cellulaires par rapport à des membranes reconstituées sans protéines  Peter Agre et Roderick MacKinnon (prix Nobel de chimie 2003) ont découvert un autre mécanisme de transport: les aquaporines EXEMPLE DE TRANSPORT FACILITÉ: LES AQUAPORINES Perméabilité des membranes biologiques à l’eau  Les aquaporines sont des transporteurs qui conduisent rapidement (5*108mol/s) et sélectivement l’eau à travers les membranes (imperméables aux molécules chargées)  Elles forment un pore (4 sous-unités) très étroit, l’eau le traverse en «file indienne» AQP1 Peter Agre - Nobel Lecture: Aquaporin Water Channels - NobelPrize.org EXEMPLE DE TRANSPORT FACILITÉ: LES AQUAPORINES Utilisation du modèle de l’ovocyte de Xénope: micro-injection d’ARN codant pour l’aquaporine  Au départ, les ovocytes sont dans une solution d’eau douce (ils y sont assez résistants)  Passage dans un milieu hypotonique → ? déformation  Les ovocytes exprimant l’aquaporine se déforment 1 mm rapidement à cause d’une entrée rapide d’eau EXEMPLE DE TRANSPORT FACILITÉ: LES AQUAPORINES Utilisation du modèle de l’ovocyte de Xénope: micro-injection d’ARN codant pour l’aquaporine  Les ovocytes exprimant l’aquaporine se déforment rapidement à cause d’une entrée rapide d’eau LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Le transport actif  Transport nécessitant un transporteur ET de l’énergie  S’effectue généralement contre le gradient de concentration LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF ATPases Co-transport ATP → ADP + Pi + énergie  L’énergie provient de l’hydrolyse de l’ATP  L’énergie provient d’un autre transport énergétiquement favorable LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Les familles de pompes ATPases  ATPase type P: exemple: Pompes Na+/K+  ATPase type H: exemple: Pompes à protons (acidification des endosomes, ATPase mitochondriale)  Transporteurs de la famille ABC: exemples: transporteurs MDR (Multidrug resistance), Flippases LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF La pompe Na+/K+ Travaille pour créer et maintenir les gradients de concentration, fournissant un potentiel électrochimique Energie !!! LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF La pompe Na+/K+ 1) Fixation de 3 ions Na+ et d’un ATP 2) Hydrolyse de l’ATP pour phosphoryler une des sous-unité de la pompe 3) Changement de conformation de la sous-unité α qui permet à 2 K+ d’entrer LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF La pompe Na+/K+ 4) Les K+ se lient et les Na+ sont relargués dans le milieu extracellulaire 5) La sous-unité est déphosphorylée et la pompe retrouve sa conformation initiale 6) Les K+ sont expulsés en intracellulaire LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF La pompe Na+/K+  Le couplage entre état de phosphorylation et conformation de la pompe typique des ATPases de type H  Echange de 3 ions Na+ contre 2 ions K+ qui induit un charge négative sur la face intracellulaire de la membrane LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Les co-transporteurs  Symport: les deux transports (énergétiquement favorable et défavorable) vont dans la même direction  Antiport: les deux transports (énergétiquement favorable et défavorable) vont dans des direction opposées LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Le co-transport sodium/glucose  Quand la concentration en glucose extracellulaire est faible (sinon diffusion facilitée par glut-1) +  Utilise le gradient du Na+ pour faire co-rentrer le glucose  Le gradient électrochimique en Na+ est très favorable (concentration + charge)  Au niveau de l’épithélium intestinal pour “récupérer” tout le glucose de l’alimentation - LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Le co-transport sodium/glucose  Au niveau de l’épithélium intestinal intestin pour “récupérer” tout le glucose de l’alimentation  Le glucose intracellulaire passe dans le sang par diffusion facilitée (glut-1) épithélium  Le sodium co-transporté est éliminé par le co-transporteur Na+/K+ (dépense ATP)  Distribution polarisée apico- basalement des transporteurs sang LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Le co-transport sodium/glucose à la base des solutés de réhydratation orale (SRO)  La diarrhée aiguë de l'enfant représente une des causes majeures de la mortalité infantile dans le monde. La létalité est due à la déshydratation  Remède simple: donner des solutions contenant du sel et du sucre (SRO) LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Le co-transport sodium/glucose à la base des solutes de réhydratation orale (SRO)  Travail accru du co-transporteur Na/glucose  Augmentation de la concentration intracellulaire générale, de l’osmolarité  Absorption d’eau par l’épithélium qui l’expulsera vers le sang LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Les pompes H+/K+ pour acidifier l’estomac  Les cellules pariétales de la paroi de l’estomac font rentrer des protons pour acidifier l’estomac pour une bonne digestion LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Les pompes H+/K+ pour acidifier l’estomac  Pompes H+/K+ sur la membrane apicale:  pompes ATPases de type P  antiport H+/K+ contre deux gradients de concentration LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Les pompes H+/K+ pour acidifier l’estomac  Antiport Cl-/HCO3- sur la membrane basale:  antiport utilisant le gradient de bicarbonate formé suite à la dissociation de l’eau et l’entrée de CO2  Canal Cl- (transport passif) permet un bilan électriquement neutre LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE: LE TRANSPORT ACTIF Les pompes H+/K+ pour acidifier l’estomac  Antiport Cl-/HCO3- sur la membrane basale:  antiport utilisant le gradient de bicarbonate formé suite à la dissociation de l’eau et l’entrée de CO2  Canal Cl- (transport passif) permet un bilan électriquement neutre  Oméoprazole: inhibiteur de cette pompe pour traiter l’acidité gastrique LA PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE Transport de substance vers l’intérieur ou l’extérieur des cellules ou des compartiments  Perméabilité à travers les membranes biologiques: transporteurs  Transport vésiculaire: exocytose et endocytose CHAPITRE I1:BIOLOGIE DES ORGANITES (MM) BIOLOGIE CELLULAIRE LA COMPARTIMENTALISATION DES FONCTIONS CELLULAIRES La compartimentalisation cellulaire permet la création d’entités fonctionnelles  Présence d’organites (petits organes) entourées d’une double membrane, d’une simple membrane ou non entourées  Problème d’adressage (voir chapitre dédié) LA COMPARTIMENTALISATION DES FONCTIONS CELLULAIRES La compartimentalisation cellulaire permet la création d’entités fonctionnelles  Possibilité de polarisation de cette compartimentalisation cellulaire  =asymétrie de la distribution des organites (dont l’appareil de Golgi pour diriger la sécrétion, voir chapitre dédié)  La polarisation répond à une demande de fonction, ou de localisation de fonction, particulière LE NOYAU CELLULAIRE Le noyau est délimité par une enveloppe nucléaire  Deux membranes concentriques = deux bicouches lipidiques  Traversée de pores nucléaires pour assurer l’échange avec le cytoplasme  En continuité avec le Réticulum endoplasmique rugueux LE NOYAU CELLULAIRE  Le nucléoplasme contient la chromatine et des condensats moléculaires non séparés par des membranes (nuclear bodies)  Le nucléole est l’endroit où l’ARN ribosomial et les ribosomes sont synthétisés  Présence sur la face interne d’une lamina, ME rigide, faite de filaments intermédiaires (voir chapitre dédié) LE NOYAU CELLULAIRE Hypothèses sur l’origine du noyau  Plusieurs hypothèses sur l’apparition du noyau qui protège le matériel génétique  Invaginations de la membrane plasmique grâce à l’apparition de protéines génératrices de courbures (l’ADN est ancré dans la membrane chez les procaryotes)  Alternative: symbiose entre une bactérie et une archée (comme les mitochondries et les chloroplastes) LE NOYAU CELLULAIRE Les pores nucléaires  L’enveloppe nucléaire est perforée par des pores nucléaires (3000 à 4000)  Ces pores sont des structures élaborées (pas juste des trous) composes d’au moins 50 protéines  Structure en panier de symétrie orthogonale LE NOYAU CELLULAIRE Les pores nucléaires  Le complexe du pore nucléaire contient un canal aqueux ouvert (9nm de diamètre) permettant le passage par diffusion des petites molécules solubles dans l’eau (<20-30kDa)  Présence d’un granule ou transporteur central qui régule fortement le passage des grosses molécules (protéines et ARN messagers) voir chapitre dédié LE RÉTICULUM ENDOPLASMIQUE  Le reticulum endoplasmique est le plus grand organite des cellules eucaryotes (10% du volume total de la cellule)  Il est entouré d’une simple membrane  On distingue 2 types de réticulum  le réticulum endoplasmique lisse: absence de ribosomes  le réticulum endoplasmique rugueux. ME L’aspect rugueux: présence de ribosomes associés à la membrane LE RÉTICULUM ENDOPLASMIQUE Réticulum endoplasmique lisse:  Synthèse des lipides : acides gras, phospholipides et hormones lipidiques  Stockage du Calcium (transport actif par pompe ATPases)  Rôle de détoxification Réticulum endoplasmique rugueux:  Synthèse Cellules de Leidig produisant la testostérone (hormone stéroïde) ME et modification (glycosylation, ponts disulfure, reploiement et clivage) des protéines de la voie de sécrétion LE RÉTICULUM ENDOPLASMIQUE Structure du réticulum endoplasmique  Le réticulum endoplasmique (RE) est formé par un réseau dynamique de tubules et de feuillets (débattu) en cours de remodelage continu MF ME LE RÉTICULUM ENDOPLASMIQUE Origine du réticulum endoplasmique  Hypothèse: formé par des replis de la membrane plasmique (comme enveloppe nucléaire) associés à des ribosomes puis se séparant de la surface LE RÉTICULUM ENDOPLASMIQUE Technique d’isolation de membranes de réticulum endoplasmique  Au laboratoire, on peut préparer des microsomes, de petites vésicules fermées formées de membrane du reticulum  Microsomes rugueux ou lisses  Ils sont fonctionnels (synthèse ou modification de protéines in vitro) L’APPAREIL DE GOLGI  Empilement de membranes aplaties (saccules) qui forment des citernes ME MF L’APPAREIL DE GOLGI  Les protéines empruntant la voie de sécrétion vont rejoindre l’appareil de golgi à partir du réticulum endoplasmique par des intermédiaires membranaires ME  ERES (ER exit sites), ERGIC (ER– Golgi intermediate compartment), COPI, COPII voir chapitre dédié L’APPAREIL DE GOLGI  3 régions:  le cis Golgi qui fait face au RE et réceptionne les intermédiaires vésiculaires qui en proviennent  le Golgi médian  le trans Golgi duquel les vésicules sont libérées pour rejoindre la membrane plasmique ou d’autres organelles L’APPAREIL DE GOLGI  Fonctions:  Maturation de la chaine de N- glycosylation  Réaction de O-glycosylation  Maturation (endopeptidase) phospholipides des protéines et des  Tri des protéines vers différentes destination L’APPAREIL DE GOLGI Modèles de transport au sein de l’appareil de Golgi  Chaque saccule est un compartiment stable qui a une composition et donc des fonctions spécifiques contient un ensemble spécifique de  Les protéines de la voie de sécrétion passent d’une citerne à l'autre par des cycles successifs de transport vésiculaire (dans les deux directions) L’APPAREIL DE GOLGI Modèles de transport au sein de l’appareil de Golgi  Les protéines à transiter se trouvent dans une saccule et y restent.  Cette citerne va maturer le long de l’appareil de Golgi former des vésicules pour finalement  Les protéines propres à chaque fonction du Golgi (à l’évolution de la maturation) doivent donc être importées successivement dans les citernes. Celles ayant déjà agi doivent être retirées. L’APPAREIL DE GOLGI Modèles de transport au sein de l’appareil de Golgi Le traffic intra-golgi impliquent des vésicules qui transfèrent entre les citernes  soit les protéines nouvellement synthétisées  soit les protéines golgienne « de travail » LES LYSOSOMES ET LES PEROXYSOMES Des sacs à enzymes découverts par Christian de Duve (prix Nobel 1974) par fractionnement cellulaire et dosage d’activités enzymatiques  Organites entourées d’une membrane  Corps (soma) de dégradation (lysis) et d’oxydation (peroxydase)  ! Les mécanismes d’adressages aux lysosomes et aux peroxysomes sont différents MF Christian de Duve – Interview - NobelPrize.org LES LYSOSOMES Lysosomes Mitochondries  Digestion intracellulaire par une d’hydrolases acides (+/- 40 enzymes) série  Le pH est maintenu acide par l’action de pompes à protons MF LES LYSOSOMES Sources du matériel à digérer  Vésicules d’endocytose  Autophagosomes contenant des composants cytosoliques voire des organites cellulaires  Phagosomes spécialisées)  Du trans Golgi (dans les cellules L’AUTOPHAGIE Il existe 3 types d’autophagie selon la manière dont le substrat à dégrader entre dans le lysosome  Macroautophagie Formation d’une vésicule membrane, l’autophagosome à double  Microautophagie: Invagination de la membrane du lysosome Lysosome  Autophagie médiée par les chaperonnes: Substrat sélectivement reconnu par des chaperonnes, elles-mêmes reconnues par des récepteurs lysosomiaux LES LYSOSOMES: MALADIES LYSOSOMALES Maladies de « surcharge lysosomales »: le substrat s’accumule dans les lysosomes en l’absence d’enzymes de dégradation  Exemple de la maladie de Gaucher: déficit en gluco-cérébrosidase dans les macrophages. Cause douleurs, fatigue, splénomégalie et hépatomégalie LES LYSOSOMES: MALADIES LYSOSOMALES Maladies de « surcharge lysosomales »: maladie de Tay Sachs  Absence d’hexosaminidase A (substrat: ganglioside) Cause hypotension, convulsions, ataxie et réductions des fonctions motrices et cérébrales Sphingolipides LES LYSOSOMES: MALADIES LYSOSOMALES Maladies de « surcharge lysosomales »: maladie de Tay Sachs  Absence d’hexosaminidase A (substrat: ganglioside) Mécanisme: mutation qui empêche la phosphorylation du mannose de l’enzyme → ciblée vers les lysosomes Adressage des protéines au lysosome LES PEROXYSOMES Les peroxysomes contiennent des oxydases  Beta-oxydation des acides gras  Oxydation de composes organiques (comme l’ethanol) avec production de peroxide d’hydrogène (H2O2)  Elimination des dérivés actifs de l’ O2 (détoxification): RH2 + O2 R + H2O2  Elimination du H2O2 par une oxidase particulière, la ME catalase (protection contre les radicaux libres) : RH2 + H2O2 R + 2H2O 2H2O2 2H2O + O2  Très présents au niveau des cellules du foie et du rein LES PEROXYSOMES: MALADIES PEROXYSOMALES Cas de la maladie de Zellweger Cellules de personnes saines ME Cellules de patients sains  Défauts de biogenèse des peroxysosomes  Syndromes variés: épilepsie, troubles psychomoteurs, surdité, cataracte,… MF LES MITOCHONDRIES  Organites très volumineuses  Quelques centaines à (selon besoins en ATP) quelques milliers  Couplage chimio-osmotique: création d’un gradient de protons pour synthétiser de l’ATP LES MITOCHONDRIES Structure  Elles sont formées d’une matrice entourée d’une double membrane, une interne et une externe, renfermant l’espace intermembranaire MF  La membrane externe contient des pores  La membrane interne forme des crêtes Membrane interne Membrane externe  Les mitochondries forment un reticulum dans la cellule MF LES MITOCHONDRIES Structure MF  Les mitochondries  Ces replis servent à augmenter la surface pour forment un reticulum dans la cellule  La matrice contient aussi de l’ADN, son propre amplifier la capacité de synthèse d’ATP génome, et des ribosomes LES MITOCHONDRIES Hypothèse sur l’origine endosymbiotique des mitochondries En faveur de cette hypothèse d’endocytose d’une bactérie:  double membrane  présence d’ADN et de ribosomes (proches des ADNs sans introns et des ribosomes de type procaryote)  mode de « réplication » des mitochondries LES MITOCHONDRIES Dynamique des membranes mitochondriales  Fusion et fission des membranes pour contrôler le contenu et le nombre de mitochondries (division cellulaire et mitophagie) Mitochondrial Dynamics - YouTube LES MITOCHONDRIES L’ADN mitochondrial Mitochondries (TOM20) ADN nucléaire (DAPI) ADN mitochondrial (TFAM)  16 Kb chez l’homme (séquence connue en 1981), plusieurs copies circulaires (2 - 10 chez l’homme)  absence d’histones et majorité de régions codantes (pas d’introns chez l’homme)  code pour ARNr, ARNt (22), ARNm (pas de cap, mais présence de queue poly-A)  code pour des protéines de la chaine de production d’ATP ou de la machinerie de traduction LES MITOCHONDRIES Les protéines mitochondriales  +/- 1500 protéines mitochondriales  1% des gènes les codant se trouve dans le génome mitochondrial et sera traduit par une machinerie complète propre à la mitochondrie  Le code génétique pour la traduction des ARNm de la mitochondrie diffère  Les autres 99% codées par le génome nucléaire doivent y être importées, besoin de les y adresser Voir chapitre dédié LES ORGANITES CELLULAIRES: TECHNIQUE DE SÉPARATION Séparation par centrifugation à vitesses différentielles LES ORGANITES CELLULAIRES: SITES DE CONTACT Associations nombreuses entre les organites  Communication entre les organites  Transfert de matériel (lipides et ions)  Contrôle la position et la division des organites LES ORGANITES CELLULAIRES: SITES DE CONTACT Cas du réticulum endoplasmique CHAPITRE III: ADRESSAGE DES PROTÉINES (MM) BIOLOGIE CELLULAIRE L’ADRESSAGE DES PROTÉINES La compartimentalisation cellulaire implique un bon adressage des protéines L’ADRESSAGE DES PROTÉINES  Selon la destination des protéines qu’ils synthétisent, les ribosomes sont libres dans le cytoplasme ou ancrés sur le réticulum endoplasmique rugueux  différence de localisation pas d’identité!!! L’ADRESSAGE DES PROTÉINES L’adressage dans la voie de sécrétion  La traduction des ARNm débute sur des ribosomes libres dans le cytosol  Les protéines dont la synthèse débute par une séquence signal sont dirigées vers la membrane du RER  Elles seront transloquées dans la lumière du RER ou intégrées dans sa membrane pour les protéines transmembranaires L’ADRESSAGE DES PROTÉINES L’adressage dans la voie de sécrétion  La translocation est co-traductionnelle  La sequence signal contenant des AA hydrophobe en N-terminal est nécessaire et suffisante. Elle sera clivée  Implication de la SRP, du récepteur à la SRP et du translocon clivage L’ADRESSAGE DES PROTÉINES Certaines protéines sont résidentes du réticulum endoplasmique  Les protéines solubles « travaillant » dans le réticulum doivent y rester (les chaperonnes par exemple)  La majorité de ces protéines contiennent une séquence spécifique en C-terminal: Lysine - Acide aspartique Acide glutamique - Leucine (KDEL)  KDEL est reconnu par un récepteur spécifique des vésicules de transport entre le réticulum et le Golgi  La liaison étant dépendante du pH (forte à faible pH), elle se réalise préférentiellement dans le Golgi et les vésicules de transport rétrograde  La protéine sera relarguée dans le réticulum L’ADRESSAGE DES PROTÉINES L’adressage dans la voie de sécrétion  L’adressage dans le lysosme L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans le noyau  Présence des complexes de pore nucléaire  Les petites molécules suivant leur gradient de concentration peuvent passer passivement à travers les pores nucléaires  Les autres molécules doivent subir un transport actif avec dépense d’énergie qui sera très rapide L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans le noyau  Présence de protéines qui vont « prendre en charge » la protéine à transporter dans le noyau  Un récepteur associé aux pores vont reconnaitre une séquence spécifique  un NLS (nuclear localization signal) pour l’import  un NES (nuclear export signal) pour l’export L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans le noyau: cas des ribosomes  Les ribosomes sont formés de protéines et d’ARNs  L’activité peptidyl transferase est portée par les ARN ribosomiaux (ribozyme!)  L’assemblage des ribosomes impose des processus d’import et d’export nucléaire Protéines ribosomiales ARN ribosomiaux L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans le noyau: cas des ribosomes  L’assemblage des ribosomes se fait dans le nucléole  Les ARNs ribosomiaux y sont transcrits  Les ARNs codant pour les protéines ribosomiales sont transcrits dans le nucléoplasme et exportés dans le cytoplasme pour y être traduits  Les protéines ribosomiales sont alors importées dans le noyau pour l’assemblage  Les ribosomes formés sont exportés dans le cytoplasme L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans le noyau: cas des ribosomes  Import des protéines ribosomiales ≈ 500.000 protéines par minute (/noyau)  Export des ribosomes : ≈ 15.000 par minute : L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU La séquence NLS de reconnaissance pour l’import  Les protéines destinées à être importées dans le noyau possèdent une séquence de localisation nucléaire (NLS = nuclear localisation signal)  Séquence située en surface de la protéine, pas de « vrai consensus », riche en AA basiques (arginine, lysine)  Mono ou bi-partite, quelques AA  Elle sera reconnue par les récepteurs cytoplasmiques associés aux pores nucléaires L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU La séquence NLS de reconnaissance pour l’import GFP cytoplasmique  La protéine GFP (Green Fluorescent Protein) est une protéine de méduse qui est très utilisée pour étudier la localisation des protéines  On peut faire exprimer la sequence codant pour cette GFP, aussi en la modifiant  Elle est cytoplasmique en cellules de mammifères MF L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU La séquence NLS de reconnaissance pour l’import GFP cytoplasmique GFP cytoplasmique + NLS MF  La présence d’une NLS suffit à assurer une localisation nucléaire L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU La séquence NLS de reconnaissance pour l’import MF PNAS May 6, 2014 111 (18) E1852-E1861  La présence d’une NLS est nécessaire à assurer la localisation nucléaire L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU Mécanisme moléculaire de l’import Protéine à importer  Les protéines qui reconnaissent les séquences NLS sont les importines, hydrophobes  Un hétérodimère d’α/β importine lie la protéine à importer dans le cytoplasme  L’importine interagit avec constituant du pore: nucléoporines FG un les  Ces nucléoporines contiennent des repetitions phenylalanine-glycine qui forment des filaments hydrophobes exposés à l’intérieur du pore L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU Mécanisme moléculaire de l’import Protéine à importer  Le complexe importé interagit avec des protéines dans le nucléoplasme, ce qui induit sa dissociation  L’importine-β interagit avec une Ras GTPase: RanGTP, l’α interagit avec une nucléoporine: NUP50  Les importines sont ré-exportées dans le cytoplasme par RanGTP selon son gradient de concentration  directement pour la β  par l’intermédiaire de la protéine CAS pour l’α L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU Mécanisme moléculaire de l’import Protéine à importer  Dans le cytoplasme, le GTP associé à Ran est hydrolysé en GDP par une RanGAP  Cela induit la dissociation des importines de leur complexe et leur permet de recommencer un cycle d’import L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU Mécanisme moléculaire de l’import  Le RanGDP est importé dans le noyau par un transport facilité utilisant la protéine NTF2 (Nuclear Transport Factor 2)  Ran échange son GDP pour du GTP à l’aide d’une RanGEF Existence et maintien d’un gradient de RanGTP/RanGDP nécessaire au transport nucléaire  →  pour former er dissocier les complexes  pour assurer la directionnalité du transport L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU  La forme RanGTP est élevée dans le noyau alors que la forme RanGDP est élevée dans le cytoplasme  L’équilibre est contrôlé par les RanGEF et RanGAP  Les GEF (Guanine Exchange Factor) sont nucléaires et catalysent la formation de RanGTP  Les GAP (GTPase Activating Protein) sont cytoplamsiques et catalysent la formation de RanGDP, assisté des RanBP (Ran Binding Protein) L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LE NOYAU L’export nucléaire  Certaines protéines doivent aussi être exportées du noyau  La séquence nécessaire est un NES (nuclear export sequence), riche en leucines  La protéine réceptrice est XPO1 (CRM1)  L’export est médié par RanGTP L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans les peroxysomes Compartiments cibles à double membrane Compartiments cibles à simple membrane  Peroxisomes : l’exception à la règle « intuitive » L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES PEROXYSOMES  Les protéines à destination des peroxysomes Serine-Lysine-Leucine contiennent une séquence d’adressage PTS (Peroxisomal Targeting Sequence)  Elle est localisée à l’extrémité C-terminale et est assez variable mais contient un consensus SKL (PTS1)  Récepteur cytoplasmique: Pex5  Récepteur à la membrane du peroxysome: Pex14  « Translocon » formé par d’autres protéines Pex  Après l’import, Pex5 est recyclé dans le cytoplasme par le même canal L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES PEROXYSOMES  Similarité avec l’adressage dans le reticulum endoplamsique rugueux  MAIS grosse différence: la translocation se fait après la traduction, la plupart du temps sur une protéine déjà totalement reployée (taille du pore important) L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans les mitochondries  Même si les mitochondries contiennent un génome propre, la plupart des protéines mitochondriales doivent être importées du cytoplasme  Plusieurs destinations: la matrice mitochondriale, la membrane interne intermembranaire ou externe  Le transfert est post-traductionnel et l’espace L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES L’adressage dans les mitochondries  Les protéines mitochondriales à importer contiennent une séquence d’import mitochondriale du côté Nterminal  Séquence d’adressage de 10 à 60 AA alternant résidus chargés basiques (lysine et arginine) et résidus hydrophobes (donc amphipathique) et formant une hélice alpha  Cette séquence est nécessaire mais pas suffisante L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES  Après synthèse dans le cytoplasme, les protéines à destination de la matrice mitochondriale sont maintenues dans un état dénaturé par leur association avec des chaperonnes (Hsc70)  Cette activité requiert de l’énergie sous forme d’ATP  Pour traverser les deux membranes, intervention de deux types de complexes protéiques: les complexes TOM (Translocator Outer Membrane) et TIM (Translocator Inner Membrane)  Le transfert se fait au niveau de zones de contact entre membrane externe et interne L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES  La séquence d’import est reconnue et se lie sur un récepteur de la membrane externe (Tom20)  Le récepteur transfère la protéine, dissociée des chaperonnes vers le canal formé par Tom40  La séquence d’import se lie sur le complexe Tim: récepteur (Tim50), canal (Tim23) et arrimage de Hsc70 (Tim44)  La traversée de la membrane interne est un transport actif qui se réalise à l’aide de la protéine Hsc70, matricielle cette fois et qui va utiliser de l’ATP  Clivage de la séquence d’adressage  Acquisition de la conformation 3D L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES L’adressage dans les mitochondries nécessite la dénaturation de la protéine  La dénaturation de la protéine est une condition au transfert vers les mitochondries  Si on ajoute une séquence d’import à une protéine cytoplasmique (ici la dihydrofolate reductase DHFR, biosynthèse de la thymine) mais qu’on empêche son accès aux chaperonnes et donc sa dénaturation, on bloque l’import  → la reconnaissance de la séquence d’adressage par le récepteur de la membrane n’est pas suffisante L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES L’adressage dans les mitochondries nécessite un gradient de protons  La différence de potentiel électrique provenant du gradient de proton existant à travers la membrane interne est aussi nécessaire à l’import  Les charges négatives attireraient les protéines chargées positivement en N-ter  Technique pour tester l’import mitochondrial: une proteine importée sera protégée de l’action de la protéase (non clivée) L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES  L’adressage des protéines vers la membrane mitochondriale peut se faire selon 3 voies interne  Existence, comme pour les protéines membranaires de la voie de sécrétion, de séquences spécifiques (séquences stop-transfert et d’adressage interne)  Voie A: une séquence stop-transfert hydrophobe arrêtant le transport et diffusant dans la membrane  Voie B: une séquence reconnue par la protéine membranaire Oxa1 qui permettra l’ancrage dans la membrane après translocation totale L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES  Voie C: des séquences d’adressage interne (et pas d’import!) qui seront reconnues par un récepteur Tom spécifique (Tom70)  Passage par Tom40  Tim9 et Tim10 dans l’espace intermembranaire empêche l’agrégation de la protéine très hydrophobe  Complexe spécifique au niveau de la membrane interne,Tim22 et Tim54 L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES  L’adressage des protéines vers l’espace intermembranaire requiert la présence d’une séquence d’adressage interne spécifique  Il peut se faire selon deux voies selon présence ou non d’une séquence d’adressage additionnelle du côté N-terminal  Voie A (présence): reconnaissance et passage par les complexes Tom et Tim traditionnels. Diffusion dans la membrane interne puis clivage  Voie B (absence): la protéine passe par le canal Tom40 et s’arrête là L’ADRESSAGE DES PROTÉINES DANS LES MITOCHONDRIES  L’adressage des protéines vers la membrane externe des mitochondries (surtout des porines) nécessite un complexe protéique spécialisé (SAM) qui permet la sortie du pore Tom40 et la diffusion dans la membrane L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans les chloroplastes  95% des protéines chloroplastiques sont synthétisées dans le cytoplasme (même si génome propre)  Cette activité requiert de l’énergie sous forme d’ATP  Pour traverser les deux membranes, intervention de deux types de complexes protéiques: les complexes TOC (Translocon at the Outer Chloroplast envelope) et TIC (Translocon at the Inner Chloroplast envelope) L’ADRESSAGE DES PROTÉINES: RIBOSOMES LIBRES L’adressage dans les chloroplastes  Les protéines à destination des chloroplastes doivent être maintenues dans un état dénaturé pour leur import par leur association avec des chaperonnes (143-3, Hsp70)  Elles contiennent une séquence d’adressage (un peptide de transit) du côté N-terminal qui sera reconnu par les chaperonnes. Elle sera clivée. L’ADRESSAGE DES PROTÉINES Comparaison  L’adressage est-il co- ou post-traductionnel ? Pré ou post-reploiement?  Nécessite-t-il de l’énergie ?  Est-il spécifié par une séquence signal ?  Quelles sont les caractéristiques de cette séquence (nature, position, caractère nécessaire et suffisant, clivage) ?  Quels sont les acteurs moléculaires (récepteur cytoplamsique, récepteur membranaire,…) CHAPITRE IV: LE TRANSPORT VÉSICULAIRE (MM) BIOLOGIE CELLULAIRE LE TRANSPORT VÉSICULAIRE Adressage Traffic vésiculaire Exocytose Endocytose LE TRANSPORT VÉSICULAIRE Le transport vésiculaire est continu, dynamique et bidirectionnel (balance pour la surface membranaire) La voie de secretion Vers la membrane plasmique ou le lysosome La voie d’endocytose Vers le lysosome La voie de recyclage LE TRANSPORT VÉSICULAIRE La voie de sécrétion  La voie de sécrétion classique concerne les protéines destinées à être sécrétées dans le milieu extracellulaire ou à être exposées à la membrane plasmique(30% des protéines)  Production et modifications (maturation) de ces protéines  Réticulum endoplasmique rugueux → appareil de Golgi → membrane plasmique LE TRANSPORT VÉSICULAIRE Méthodes pour étudier la voie de sécrétion classique (synchronisation)  Utilisation d’un mutant thermosensible d’une protéine de surface virale (la protéine G du virus Vesicular Stomatis Virus) fusionné à la GFP  Au dessus de 39°C, VSV-G est mal reployée et est bloquée, s’accumule dans le réticulum endoplasmique.  Le retour à une température physiologique induit son passage dans la voie de sécrétion  RE→ ER Exit Sites→ Golgi→ Vésicules de sécrétion→ Membrane plasmique MF LE TRANSPORT VÉSICULAIRE Méthodes pour étudier la voie de sécrétion classique (synchronisation) Streptavidin  Utilisation de l’essai RUSH (Retention Using Selective Hook)  La protéine streptavidine est ancrée dans le reticulum endoplasmique (KDEL)  La protéine cargo contient un peptide SBP (Streptavidin Binding Peptide) qui l’y lie et un fluorophore  L’ajout MF de biotine permet la libération de cette interaction et la protéine cargo entre dans la voie de sécrétion LE TRANSPORT VÉSICULAIRE Méthodes pour étudier la voie de sécrétion classique (synchronisation)  Utilisation de l’essai RUSH (Retention Using Selective Hook)  La protéine streptavidine est ancrée dans le reticulum endoplasmique (KDEL)  La protéine cargo contient un peptide SBP (Streptavidin Binding Peptide) qui l’y lie et un fluorophore  L’ajout MF de biotine permet la libération de cette interaction et la protéine cargo entre dans la voie de sécrétion LE TRANSPORT VÉSICULAIRE Méthodes pour étudier la voie de sécrétion classique MF pHluorin  Utilisation du RUSH en combinaison avec un fluorophore dont la lumière émise dépend du pH (pHluorin) pour mettre en évidence les différences de pH le long de la voie de sécrétion LE TRANSPORT VÉSICULAIRE Méthodes pour visualiser l’exocytose  Utilisation de la technique de microscopie TIRF (voir chapitre dédié)  Cette technique permet d’amplifier les signaux très proches de l’objectif, donc de la membrane plasmique NPY-GFP MF LE TRANSPORT VÉSICULAIRE Le transport vésiculaire comprend une