Clonage de gènes spécifiques

Cloner un gène spécifique

• Pour identifier les clones spécifiques à un gène d'intérêt, il faut cribler la banque d'ADN génomique ou d'ADNc à l'aide d'une sonde spécifique au gène en question.
• Il existe des sondes qui reconnaissent l'ADN et d'autres qui reconnaissent les protéines.
• La dénaturation et la renaturation de molécules double-brin d'ADN sont des étapes importantes de la procédure.
• Les sondes d'ADN peuvent être des oligonucléotides homologues à la séquence du gène recherché, des fragments d'ADN cloné du gène chez la même espèce à l'étude ou chez une autre espèce ou des fragments d'ADNc cloné qui servent de gabarit pour une sonde d'ARN.
• Le marquage de la sonde peut être réalisé avec divers méthodes.

Utilisation de l'ADN cloné

• L'ADN cloné peut être utilisé comme sonde pour identifier un acide nucléique spécifique dans un mélange.
• L'ADN digéré de plusieurs clones peut être séparé sur gel d'agarose et utilisé pour identifier les clones positifs.
• Les transferts de type Southern, Northern et Western sont utilisés pour détecter les séquences d'ADN, ARN et protéine, respectivement. Le principe est identique mais la sonde est un anticorps pour le Western blot.
• Les analyses de type Southern, Northern et Western du gène X permettent de détecter des changements dans l'expression du gène X.
• Le séquençage de l'ADN peut être réalisé à l'aide de didéoxynucléotides (ddNTPs) qui ne contiennent pas d'extrémité 3'-OH, une méthode inventée par Fred Sanger.
• La méthode de Sanger utilise un marquage radioactif au 32P ou fluorescent pour identifier les nucléotides incorporés. Les séquenceurs automatiques peuvent lire jusqu'à 1 kb de séquence.
• La méthode du pyroséquençage est une méthode de séquençage de nouvelle génération qui permet de séquencer des millions de brins d'ADN en parallèle.

Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing)

• Le pyroséquençage se déroule en cinq étapes:
  • Un amplicon PCR simple brin sert de matrice et est incubé avec les enzymes : ADN polymérase, ATP sulfurylase, luciférase, apyrase ainsi que les substrats, adénosine 5' phosphosulfate (APS), luciférine et amorce de séquençage.
  • Le premier dNTP est ajouté à la réaction et l'ADN polymérase catalyse son incorporation dans le brin d'ADN, si elle est complémentaire à la base du brin matrice.
  • L'ATP sulfurylase convertit le IPP en ATP, qui entraîne la conversion de la luciférine en oxyluciferin, ce qui génère une lumière visible.
  • L'Apyrase dégrade les nucléotides et l'ATP.
  • L'addition de dNTPs est exécutée séquentiellement.
• Le pyroséquençage a considérablement amélioré la vitesse et le coût du séquençage de l'ADN.
• Le projet Génome Humain a duré 13 ans et a coûté 3 milliards de dollars.
• Aujourd'hui, le coût du séquençage du génome humain est de 600$.

Détecter et amplifier des séquences grâce à la réaction en chaîne de la polymérase (PCR)

• La Taq DNA polymérase, issue de la bactérie Thermus aquaticus, est utilisée dans la PCR.
• La PCR est utilisée pour amplifier des séquences spécifiques d'ADN.
• La PCR en temps réel (Real-TIme PCR) utilise des marqueurs fluorescents, comme le SYBR Green ou TaqMan, pour détecter l'amplification de l'ADN en temps réel.

Utilisation de l'ADN cloné

• La position des gènes peut être déterminée sur des cartes de restriction en utilisant des enzymes de restriction et des sondes d'ADN.

L'alcaptonurie

• L'alcaptonurie est une maladie génétique qui est causée par une mutation dans le gène homogentisate 1,2-dioxygénase, ce qui conduit à une accumulation de l'acide homogentisique dans le corps.
• L'acide homogentisique peut provoquer une pigmentation foncée de l'urine, des cartilages et des articulations.